鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗氧化及免疫的影響

摘要：【目的】分析鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）生長(zhǎng)、抗氧化及免疫的影 響，探究凡納濱對(duì)蝦應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的調(diào)控機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。【方法】以凡納濱對(duì)蝦（平均體長(zhǎng)5.20± 0.67 cm，平均體質(zhì)量2.01+0.73g）為試驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)雙因素試驗(yàn)，鹽度為0.5%o、1.0%o和3.0%o，亞硝酸鹽氮濃度為0.07、0.20、0.50、1.50、4.00和10.90mg/L，共18個(gè)處理組，進(jìn)行30d脅迫試驗(yàn)，測(cè)定凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能指標(biāo)、肝胰腺和鰓組織酶活性及抗氧化與免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。【結(jié)果】凡納濱對(duì)蝦存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值和體質(zhì) 量日增長(zhǎng)值在相同鹽度下均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高總體呈下降趨勢(shì)，在相同亞硝酸鹽氮濃度下隨著鹽度的升高 總體呈上升趨勢(shì)；肝胰腺和鰓的總抗氧化能力（T-AOC）及過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性與錳 型超氧化物歧化酶基因（Mn-sod）、CAT基因、GPx基因、細(xì)胞色素氧化酶基因（CyrC）、細(xì)胞凋亡因子Caspase-3基因 （CASP3）和抗菌肽基因（Crustin）相對(duì)表達(dá)量在相同鹽度下均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在相同亞硝酸鹽氮濃度下隨著鹽度的升高總體呈上升趨勢(shì)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦肝細(xì)胞凋亡率隨 著亞硝酸鹽氮濃度的增加呈上升趨勢(shì)。鹽度和亞硝酸鹽氮的交互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦的存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值及體質(zhì) 量日增長(zhǎng)值均無顯著影響（Pgt;0.05），但對(duì)肝胰腺和鰓組織的T-AOC及CAT、GPx活性與Mn-sod、CAT、GPx、CytC、 CASP3、Crustin相對(duì)表達(dá)量均有極顯著影響（Plt;0.01）?！窘Y(jié)論】抗氧化酶（CAT和GPx）及抗氧化與免疫相關(guān)基因（Mn- sod、CAT、GPx、CytC、CASP3和Crustin）參與凡納濱對(duì)蝦在鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫下的應(yīng)答過程，鹽度和亞硝酸鹽氮 的變化會(huì)引起凡納濱對(duì)蝦氧化應(yīng)激反應(yīng)，脅迫程度較輕時(shí)，機(jī)體通過增加抗氧化酶活性并上調(diào)抗氧化與免疫相關(guān)基 因協(xié)同應(yīng)對(duì)外界惡劣環(huán)境；但隨著脅迫程度加強(qiáng)，酶活性和基因相對(duì)表達(dá)量下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，對(duì)肝胰腺和鰓 造成損傷，影響正常生理功能，最終導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦死亡。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；生長(zhǎng)；抗氧化；免疫；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：S968.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1194-13

Effects of chronic salinity and nitrite nitrogen stress on growth， antioxidation and immunity of Litopenaeus vannamei

WANG Lin-wei1.2， CHENG Xi1.2， GAN Hong-kuan1.2， DAI Xi-lin1.2*（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Shanghai Collaborative Innovation Center for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）

Abstract：[Objective]The aim was to analyze the effects of chronic salinity and nitrite nitrogen stress on the growth， antioxidation and immunity of Litopenaeus vannamei， and to investigate the regulatory mechanisms of L. vannamei in response to environmental stress， which could provide a theoretical basis for its healthy culture. 【Method】L. vannamei （average body length 5.20生0.67 cm，average body weight 2.01±0.73 g） were used as the test material， a two-factor experi-ment was designed with salinity being 0.5%o， 1.0%o，3.0%o， and nitrite nitrogen concentrations being 0.07，0.20，0.50，1.50，4.00，10.90 mg/L. A total of 18 treatment groups were carried out for 30 d stress test. The growth performance indexes， enzyme activities of hepatopancreas and gill tissues and relative expression of antioxidant and immune related genes were measured and TUNEL assay was performed. [Result]Under the same salinity， survival rate，daily growth value of body length， and daily growth value of body weight of L. vannamei all showed an overall decreasing trend with the increase of nitrite nitrogen concentration， under the same nitrite nitrogen concentration， they showed general upward trend with increasing salinity. The total antioxidant capacity （T-AOC）， catalase （CAT）， and glutathione peroxidase （GPx） in hepatopancreas and gill tissues，as well as the relative expressions of manganese-type superoxide dismutase gene （Mn-sod）， CAT gene， GPx gene， cytochrome oxidase gene （CyrC）， apoptosis factor Caspase-3 gene （CASP3）， and antimicrobial peptide gene （Crustin） showed an increasing trend and then a decreasing trend with the increase of nitrite nitrogen concentration under the same salinity， and the showed an increasing trend with increasing salinity under the same nitrite nitrogen concentration. The results of TUNEL assay showed that the rate of L. vannamei hepatocyte apoptosis increased with increasing nitrite nitrogen concentration. The interaction between salinity and nitrite nitrogen did not significantly affect the survival rate，daily growth value of body length and daily growth value of body weight of L. vannamei（Pgt;0.05），but had extremely significant effects on the activities of T-AOC， CAT and GPx in hepatopancreatic and gill tissues， as well as the relative expression of Mn-sod， CAT， GPx， CytC， CASP3 and Crustin （Plt;0.01）. 【Conclusion ]Antioxidant enzymes （CAT and GPx）and antioxidant and immune related genes（Mn-sod，CAT，GPx，CytC， CASP3 and Crustin）are involved in the re- sponse process of L. vannamei under salinity and nitrite nitrogen stress. Changes in salinity and nitrite nitrogen cause oxi- dative stress in L. vannamei. When the degree of stress is mild， the body responds to the harsh external environment by in- creasing the activity of antioxidant enzymes， up-regulating antioxidant and immune related genes. However， as the de- gree of stress is strengthened， the relative expression of enzymes and genes decreases， which induces apoptosis， causes damage to the hepatopancreas and gills， affects normal physiological functions， and ultimately leads to the death of L.van- namei.

Key words： Litopenaeus vannamei; growth; antioxidation; immunity; apoptosis

Foundation items： Shanghai Modern Agricultural Industrial Technology System（HNKCZ（2022）5）

0 引言

【研究意義】近年來，凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，是目前世界上最重要的經(jīng) 濟(jì)蝦類之一（滕瑜等，2021）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年全球凡 納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)650萬t，其中我國凡納濱對(duì)蝦 產(chǎn)量約210萬t，約占全球產(chǎn)量的1/3（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁 業(yè)漁政管理局等，2023）。亞硝酸鹽氮（NO2-N）是水 產(chǎn)養(yǎng)殖過程中重要的環(huán)境因素，其含量的增加可能 會(huì)抑制水生動(dòng)物的免疫系統(tǒng)功能和抗氧化酶活性， 導(dǎo)致氧化應(yīng)激，使水生動(dòng)物大量死亡（Cui et al.， 2017;Duan et al.，2018;Zhang et al.，2018）。鹽度對(duì) 亞硝酸鹽氮毒性影響十分顯著，高鹽能緩解亞硝酸 鹽氮對(duì)蝦類生長(zhǎng)和攝食的影響，主要是由于氯離子 和亞硝態(tài)氮離子在鰓部競(jìng)爭(zhēng)相同吸收位點(diǎn)（胡賢德 等，2009；陳亨等，2018）。因此，探究凡納濱對(duì)蝦在 不同鹽度下對(duì)亞硝酸鹽氮脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制對(duì) 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重大意義?！厩?人研究進(jìn)展】亞硝酸鹽氮對(duì)蝦類等水生物的影響 已有相關(guān)報(bào)道，中國明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinen- sis）在亞硝酸鹽氮脅迫下各組織均受影響，其中肝胰 腺病變最嚴(yán)重（吳中華等，1999）；凡納濱對(duì)蝦在含亞 硝酸鹽氮的水體中養(yǎng)殖14d，生長(zhǎng)和發(fā)育均被明顯 抑制（彭自然等，2004）；亞硝酸鹽會(huì)影響蝦類正常生 長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致其對(duì)副溶血弧菌的易感性增加，造成組織損傷（Mallasen and Valenti，2006）；凡納濱對(duì)蝦 在亞硝酸鹽氮脅迫下，肝胰腺中抗氧化酶相關(guān)基 因的表達(dá)被顯著誘導(dǎo)用于機(jī)體免疫防御（郭慧等， 2017）;羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）在亞 硝酸鹽氮脅迫48h后，肌肉中超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性均受明顯影響（董學(xué)興等，2018）；菲律賓 蛤仔（Ruditapes philippinarum）在亞硝酸鹽氮脅迫 下，組織免疫功能下降（Lvet al.，2019）；凡納濱對(duì)蝦經(jīng)亞硝酸鹽氮脅迫40d后，SOD和CAT活性及錳型超氧化物歧化酶基因（Mn-sod）和CAT基因表達(dá) 量均降低，不同亞硝酸鹽濃度對(duì)其生長(zhǎng)和免疫功能 的抑制程度不同（方成等，2022）。鹽度對(duì)蝦類抗氧 化能力的影響也有報(bào)道，鹽度驟變會(huì)降低葛氏長(zhǎng)臂 蝦（Palaemon gravieri）體內(nèi)總抗氧化能力（T-AOC） 和CAT活性（胡潤(rùn)豪等，2022）；鹽度的升高或降低 均會(huì)影響紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）體內(nèi)抗 氧化酶活性（張高偉等，2022）。部分研究聚焦于雙 因素脅迫下水生生物的響應(yīng)機(jī)制，羅杰等（2011）研 究發(fā)現(xiàn)，鹽度降低會(huì)使亞硝酸鹽氮對(duì)管角螺（Hemi- fusus tuba）稚貝的毒害作用不斷增大；胡益鳴等 （2020）研究發(fā)現(xiàn)，溫度和鹽度驟變能顯著影響巖牡 蠣（Crassostrea nippona）的CAT和SOD活性等免疫 相關(guān)指標(biāo)；邢逸夫等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氮和 微塑料復(fù)合脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦CAT、GPx等抗氧化酶活性與細(xì)胞凋亡因子Caspase-3基因（CASP3）、細(xì)胞色素氧化酶基因（CytC）等抗氧化和免疫相關(guān)基因 表達(dá)量產(chǎn)生顯著影響；周紅等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，在低 鹽度和亞硝酸鹽氮共脅迫下，菲律賓蛤仔鰓組織的 正常生理功能受影響，導(dǎo)致其呼吸代謝機(jī)能減弱。 目前關(guān)于凡納濱對(duì)蝦在環(huán)境因素脅迫下生理機(jī)制響 應(yīng)的研究主要集中于單一脅迫，如高溫（熊大林等， 2020）、亞硝酸鹽（方成等，2022）、氨氮（黃勇和戴習(xí) 林，2022）、低氧（薛藝佳等，2023）及低鹽（祝華萍等， 2024）等對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗氧化、免疫和能量代 謝等方面的影響。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于鹽度或 亞硝酸鹽氮對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)研究主要集中 在單一因素影響，但實(shí)際養(yǎng)殖中常面臨多因素的協(xié) 同作用，低鹽下亞硝酸鹽氮的毒害作用更強(qiáng)，而低鹽 和亞硝酸鹽氮復(fù)合脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗氧化 能力及免疫功能的綜合影響研究鮮見報(bào)道?！緮M解決 的關(guān)鍵問題】以凡納濱對(duì)蝦為試驗(yàn)材料，設(shè)不同鹽度 和亞硝酸鹽氮濃度脅迫處理，測(cè)定凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng) 性能指標(biāo)、肝胰腺和鰓組織酶活性及抗氧化與免疫 相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，分析鹽度 和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗氧化及免疫的影響，探究凡納濱對(duì)蝦應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的調(diào) 控機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦購自上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)有限 公司，選取健康且規(guī)格一致的540尾蝦（平均體長(zhǎng) 5.20+0.67cm，平均體質(zhì)量2.01+0.73g）用于試驗(yàn)，試 驗(yàn)前在水泥池中暫養(yǎng)7d，養(yǎng)殖容器為藍(lán)色塑料箱 （長(zhǎng)×寬×高為66cm×45cm×36cm），使用前以0.02% 高錳酸鉀浸泡消毒，養(yǎng)殖水體體積55L，養(yǎng)殖用水 為充分曝氣的自來水，每日換水量為60%，水溫（26±1）℃，光周期為L(zhǎng)：D=14：10，溶解氧6mg/L以上，pH8.2+0.1。每日8：00、13：00、18：00和23：00 投喂定量飼料（浙江明輝飼料有限公司），每次投喂 量為蝦體質(zhì)量1.5%，攝食1.5h后，虹吸收集殘餌和 糞便，正式試驗(yàn)前禁食1d。

1.2試驗(yàn)方法

根據(jù)凡納濱對(duì)蝦不同鹽度下的亞硝酸鹽氮96h 半致死濃度（Lin and Chen，2003），設(shè)計(jì)雙因素試 驗(yàn)，鹽度為0.5%o、1.0%o和3.0%o，亞硝酸鹽氮濃度為 0.07、0.20、0.50、1.50、4.00和10.90mg/L，共18個(gè)處理組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行10尾蝦。采用NaNO2 （分析純）控制水體亞硝酸鹽氮濃度，使用海水晶控制水體鹽度。脅迫試驗(yàn)周期為30d，每日記錄蝦死 亡尾數(shù)，試驗(yàn)開始與結(jié)束時(shí)，稱量記錄每個(gè)平行全部 蝦的體長(zhǎng)和體質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行采樣，采樣前 1d停止喂食，每個(gè)平行取3尾蝦，將肝胰腺和鰓組織剖 出，用預(yù)冷的PBS清洗并吸干后，取部分置于無RNA 酶離心管中，液氮速凍后-80℃保存，用于酶活性測(cè) 定和RNA提取，剩余肝胰腺組織用4%多聚甲醛保 存，用于制作石蠟切片。動(dòng)物試驗(yàn)由上海海洋大學(xué) 動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)SHOU-DW-2022-062。 1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1常規(guī)生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定測(cè)定凡納濱對(duì)蝦 的存活率、體質(zhì)量日增長(zhǎng)值和體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值，計(jì)算公 式如下：

存活率（%）=N/N%×100

體質(zhì)量日增長(zhǎng)值（g/d）=（W-Wa）/t

體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值（cm/d）=（L-Lo）/t

式中，N。表示初始尾數(shù)，N表示終末尾數(shù)，W。為初始平均體質(zhì)量（g），W為終末平均體質(zhì)量（g），L。為初始平均體長(zhǎng)（cm），L為終末平均體長(zhǎng)（cm），t為試 驗(yàn)天數(shù)（d）。

1.3.2肝胰腺和鰓組織酶活性測(cè)定

使用南京建 成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒測(cè)定肝胰腺和鰓組織T-AOC和CAT、GPx活性。

1.3.3 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

采用RNA Easy Fast動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取肝胰腺組織的RNA，按照反 轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)NCBI已發(fā)布的凡納濱對(duì)蝦Mn- sod、CAT、GPx、CytC、CASP3和抗菌肽基因（Crustin） 序列設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序 列見表1。按照SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增程序：94℃預(yù) 變性30s;94℃5s，55℃25s，72℃30s，進(jìn)行40個(gè) 循環(huán)。采用2-4Aa法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4TUNEL檢測(cè)根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 試劑盒（顯色法）（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公 司）說明，對(duì)肝胰腺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、生物素 標(biāo)記及顯色后封片觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Duncan's法檢驗(yàn)處理間差異顯著性，采用雙因素方 差分析探究鹽度和亞硝酸鹽氮對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響，利用GraphPad Prism 9.0作圖。

2結(jié)果與分析

2.1鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫下凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的變化

相同鹽度下，凡納濱對(duì)蝦的存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng) 值和體質(zhì)量日增長(zhǎng)值均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高 總體呈下降趨勢(shì)；相同亞硝酸鹽氮濃度下，凡納濱對(duì) 蝦的存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值和體質(zhì)量日增長(zhǎng)值隨著 鹽度的增加總體呈上升趨勢(shì)（圖1）。3.0%0鹽度下， 0.07和0.20mg/L亞硝酸鹽氮濃度組存活率及體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值最大且均顯著高于其他處理組（Plt;0.05， 下同），體質(zhì)量日增長(zhǎng)值最高且均顯著高于4.00和 10.90mg/L亞硝酸鹽氮濃度組，但與0.50mg/L亞硝酸鹽氮濃度組無顯著差異（Pgt;0.05，下同）。亞硝酸鹽氮濃度為0.50、1.50、4.00和10.90mg/L時(shí)，3.0%o 鹽度組的存活率顯著高于0.5%%鹽度組。相同亞硝 酸鹽氮濃度下，3.0%0鹽度組的體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值顯著高 于0.5%o和1.0%o鹽度組，體質(zhì)量日增長(zhǎng)值高于0.5%。和1.0%o鹽度組但差異不顯著。相同鹽度下，0.07和0.20mg/L亞硝酸鹽氮濃度組的存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng) 值和體質(zhì)量日增長(zhǎng)值均無顯著差異。生長(zhǎng)性能的雙 因素方差分析結(jié)果如表2所示，鹽度和亞硝酸鹽氮 對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值及體質(zhì)量日增 長(zhǎng)值均有極顯著影響（Plt;0.01，下同），鹽度和亞硝酸 鹽氮的交互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦的存活率、體長(zhǎng)日增 長(zhǎng)值及體質(zhì)量日增長(zhǎng)值均無顯著影響。

2.2鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫下凡納濱對(duì)蝦 抗氧化酶的變化

凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和鰓的T-AOC及CAT、GPx 活性在相同亞硝酸鹽氮濃度下均隨著鹽度的升高總 體呈上升趨勢(shì)，在相同鹽度下均隨著亞硝酸鹽氮 濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖2）。在 3.0%%鹽度下，0.20mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的T-AOC及CAT、GPx活性均達(dá)最高，顯著高于其他處理組。在0.5%o鹽度下，10.90mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的T-AOC及CAT、GPx活性均 為最低，顯著低于其他處理組。相同亞硝酸鹽氮濃度下，1.0%o鹽度組肝胰腺的T-AOC顯著低于3.0%o鹽度組，在除0.07和0.20mg/L外的其他亞硝酸鹽氮濃度下，1.0%o鹽度組鰓的T-AOC顯著低于3.0%o鹽度組。相同亞硝酸鹽氮濃度下，0.5%%鹽度組肝胰腺的CAT 活性顯著低于1.0%o鹽度組；0.5%o和1.0%o鹽度組鰓 的CAT活性無顯著差異，但均顯著低于3.0%0鹽度組。4.00和10.90mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的T-AOC及CAT、GPx活性均低于0.50和1.50mg/L亞 硝酸鹽氮濃度組，表明高濃度亞硝酸鹽氮脅迫更能 引起凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活性變化。相同亞硝酸鹽 氮濃度下，不同鹽度組間鰓的GPx活性均差異顯著，但只有在亞硝酸鹽氮濃度為0.20和10.90mg/L時(shí)，肝胰腺的GPx活性3個(gè)鹽度組才差異顯著。雙因素 方差分析結(jié)果如表3所示，鹽度、亞硝酸鹽氮及其交 互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和鰓的T-AOC與CAT、GPx活性均有極顯著影響。

2.3鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫下凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)情況的變化

相同亞硝酸鹽氮濃度下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和 鰓的Mn-sod、CAT及GPx基因相對(duì)表達(dá)量均隨著鹽 度的升高總體呈上升趨勢(shì)；相同鹽度下，基因相對(duì)表 達(dá)量均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高呈先上升后下降 的變化趨勢(shì)，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的GPx基因相對(duì)表達(dá)量上升幅度比鰓大，鰓的CAT基因相對(duì)表達(dá)量上升幅度比肝胰腺大（圖3）。3.0%%鹽度下，0.20mg/L 亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺的GPx基因及鰓的CAT和 Mn-sod基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)最高，顯著高于其他處理組，1.50mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺的Mn-sod 基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高，顯著高于其他處理組。 0.5%o鹽度下，10.90mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的Mn-sod、CAT及GPx基因相對(duì)表達(dá)量均為最 低，顯著低于其他處理組。相同亞硝酸鹽氮濃度下，不同鹽度組肝胰腺和鰓的CAT基因相對(duì)表達(dá)量差異 顯著。0.5%鹽度下，不同亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺 的CAT和GPx基因相對(duì)表達(dá)量均差異顯著。雙因素 方差分析結(jié)果如表4所示，鹽度、亞硝酸鹽氮及其交 互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和鰓的Mn-sod、CAT及GPx基因相對(duì)表達(dá)量均有極顯著影響。

2.4鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān) 基因表達(dá)情況的變化

相同亞硝酸鹽氮濃度下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和 鰓的Crustin、CASP3和CytC的基因相對(duì)表達(dá)量均隨 著鹽度的升高總體呈上升趨勢(shì)，相同鹽度下，基因相 對(duì)表達(dá)量均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升高呈先上升后 下降的變化趨勢(shì)（圖4）。3.0%o鹽度下，0.50mg/L亞 硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的Crustin基因及肝胰 腺的CASP3基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)最高，顯著高于其他處理組，0.20mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺的CytC基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高，顯著高于其他處理組。0.5%o鹽度下，10.90mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝 胰腺和鰓的Crustin、CASP3及CytC基因相對(duì)表達(dá)量 均為最低，顯著低于其他處理組。相同亞硝酸鹽 氮濃度下，不同鹽度組鰓的Crustin和CytC基因相 對(duì)表達(dá)量均存在顯著差異。3.0%o鹽度下，0.07和 0.20mg/L亞硝酸鹽氮濃度組肝胰腺和鰓的CASP3基因相對(duì)表達(dá)量無顯著差異，但CytC基因相對(duì)表達(dá) 量差異顯著。雙因素方差分析結(jié)果表明，鹽度、亞硝 酸鹽氮及其交互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和鰓的 Crustin、CASP3與CytC基因相對(duì)表達(dá)量有極顯著影響（表4）。

2.5鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫下凡納濱對(duì)蝦 肝胰腺TUNEL檢測(cè)結(jié)果

TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦肝細(xì)胞凋亡 率隨著亞硝酸鹽氮濃度的增加呈上升趨勢(shì)。1.0%o 鹽度下，脅迫30d后各亞硝酸鹽氮濃度的凡納濱 對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡率排序?yàn)?0.90mg/L（67%）gt;4.00 mg/L（50%）gt;1.50 mg/L（48%）gt;0.50 mg/L（38%）gt;0.20mg/L（30%）gt;0.07mg/L（25%）。從圖5可看出，0.07 mg/L亞硝酸鹽氮濃度下凋亡細(xì)胞較少，肝小管數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)完整，管腔呈星形，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 正常、基膜結(jié)構(gòu)完整、排列整齊、邊界清晰。隨著亞 硝酸鹽氮濃度的增加，細(xì)胞凋亡率上升，肝小管變 形，星形管腔變形，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、排列紊亂、 邊界模糊。

3討論

3.1鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng) 性能的影響

亞硝酸鹽脅迫會(huì)影響對(duì)蝦的存活和生長(zhǎng)（Chen and Lei，1990）。Lin和Chen（2003）采用靜水毒性試驗(yàn)研究亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性，結(jié)果表 明亞硝酸鹽毒性效應(yīng)與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，本研究 結(jié)果與之相符，亞硝酸鹽氮能引起凡納濱對(duì)蝦死亡， 凡納濱對(duì)蝦存活率隨著脅迫濃度的升高呈降低趨 勢(shì)，表明亞硝酸鹽氮對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性存在劑量依賴效應(yīng)。凡納濱對(duì)蝦耐鹽廣，但鹽度對(duì)其生長(zhǎng)和 代謝有重要影響，低鹽下凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育和 免疫力受抑制（Pan et al.，2007；何桂倫等，2022）。 本研究發(fā)現(xiàn)，相同亞硝酸鹽氮濃度下，隨著鹽度的降 低，凡納濱對(duì)蝦的存活率、體長(zhǎng)日增長(zhǎng)值和體質(zhì)量日 增長(zhǎng)值總體均呈降低趨勢(shì)，表明低鹽會(huì)加重亞硝酸 鹽氮對(duì)其機(jī)體的毒性，推測(cè)凡納濱對(duì)蝦為減輕鹽度 變化帶來的影響，消耗了大量能量維持穩(wěn)態(tài)，對(duì)其生 長(zhǎng)發(fā)育造成影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氮濃度 為0.20和0.07mg/L時(shí)，凡納濱對(duì)蝦存活率、體長(zhǎng)日 增長(zhǎng)值和體質(zhì)量日增長(zhǎng)值均無顯著差異，表明養(yǎng)殖過程中將水體亞硝酸鹽氮濃度控制在0.20mg/L以 下，凡納濱對(duì)蝦機(jī)體能進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的 影響較小。

3.2鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦 抗氧化功能的影響

蝦機(jī)體在環(huán)境變化時(shí)會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn) 生大量活性氧（ROS），而過量ROS會(huì)對(duì)DNA和蛋白 質(zhì)造成氧化損傷，誘發(fā)自噬和凋亡并損害機(jī)體，生 物機(jī)體依靠CAT和GPx等抗氧化酶維持氧化還原 穩(wěn)態(tài)（Gong et al.，2019）。CAT和GPx參加O2-、H2O2 及脂質(zhì)過氧化物的解毒過程（亢玉靜等，2013）。

T-AOC是機(jī)體各類抗氧化酶及酶促反應(yīng)體系抗氧化能力的綜合，T-AOC升高代表機(jī)體清除活性氧能力增強(qiáng)（Choi et al.，2008）。郭慧等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在20mg/L亞硝酸鹽氮脅迫下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的CAT基因表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)；龍曉文等（2019）研究發(fā)現(xiàn)隨著鹽度的升高，雌性三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）肝胰腺的SOD和CAT活性呈升高趨 勢(shì)；魯耀鵬等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，低鹽條件下凡納濱對(duì) 蝦血清和肝胰腺的T-AOC及GPx活性被抑制，肝胰 腺受損；張高偉等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，3%o鹽度組紅螯 螯蝦肝胰腺組織的CAT活性顯著高于0.1%o、1%o和2%o鹽度組；本研究中，凡納濱對(duì)蝦的T-AOC和CAT、GPx活性及Mn-sod、CAT、GPx基因相對(duì)表達(dá) 量均隨著亞硝酸鹽氮濃度的上升呈先上升后下降的 變化趨勢(shì)，隨著鹽度的增加總體呈上升趨勢(shì)，與上述 前人研究結(jié)果相符，且Mn-sod、CAT和GPx等抗氧化 酶相關(guān)基因?qū)喯跛猁}氮和鹽度的敏感程度不同， 可能在抵抗脅迫過程中存在一定協(xié)同作用；表明凡 納濱對(duì)蝦機(jī)體通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來抵抗脅迫，清除體內(nèi)的ROS，大量能量被用于氧化應(yīng)激，導(dǎo)致低 鹽和高濃度亞硝酸鹽氮脅迫下，凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng) 性能受限；同時(shí)，還表明低濃度亞硝酸鹽氮脅迫可誘 導(dǎo)氧化應(yīng)激，但高濃度亞硝酸鹽氮脅迫下凡納濱對(duì) 蝦的抗氧化能力降低，氧化損傷超過自身修復(fù)能力， 造成肝胰腺和鰓組織的永久損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽 度和亞硝酸鹽氮的交互作用對(duì)T-AOC和CAT、GPx活性及Mn-sod、CAT、GPx基因相對(duì)表達(dá)量均有極顯 著影響，亞硝酸鹽氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能 力隨著鹽度的降低總體呈下降趨勢(shì)；說明高濃度亞 硝酸鹽氮與低鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生雙重脅迫，高 濃度硝酸鹽氮抑制凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力，而適 當(dāng)提高鹽度可增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力，與凡納 濱對(duì)蝦作為海水蝦的特性相符。

汪蕾等（2016）研究表明，凡納濱對(duì)蝦在硫化物 脅迫下，血細(xì)胞的GPx基因表達(dá)先于CAT基因被顯 著誘導(dǎo)；郭慧等（2017）研究表明，凡納濱對(duì)蝦在亞硝 酸鹽氮脅迫下，肝胰腺的CAT基因表達(dá)先于GPx基因被顯著誘導(dǎo)；而本研究中，肝胰腺和鰓組織的GPx和CAT基因相對(duì)表達(dá)量同時(shí)被顯著誘導(dǎo)，可能是由 于試驗(yàn)時(shí)間和脅迫濃度不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn)， 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的GPx基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)亞硝酸 鹽氮脅迫的響應(yīng)比鰓更迅速，而鰓的CAT基因相對(duì) 表達(dá)量對(duì)硝酸鹽氮脅迫的響應(yīng)比肝胰腺更迅速，可 能是由于肝胰腺中GPx基因發(fā)揮主要作用，鰓中CAT基因發(fā)揮主要作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

3.3鹽度和亞硝酸鹽氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫 功能的影響

長(zhǎng)期低鹽和亞硝酸鹽脅迫會(huì)激活細(xì)胞凋亡的酶 系統(tǒng)，抑制DNA聚合酶的活性并阻礙DNA修復(fù)，最 終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（Nu?ez-Hernandez et al.，2018）。氧 化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的重要誘因，有序的凋亡有利于 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。CytC蛋白是線粒體中參與三磷酸腺苷（ATP）合成的關(guān)鍵酶之一，受信號(hào)刺激后細(xì)胞通透性發(fā)生變化，CytC蛋白從線粒體中釋放并與CASP9蛋白結(jié)合觸發(fā)機(jī)體細(xì)胞凋亡機(jī)制，從而激活CASP3蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡（Cheng and Chen，1998）。CASP3是一種蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起 主導(dǎo)作用（Chang et al.，2008）。Crustin蛋白作為有 抗菌活性的小分子，在生物非特異免疫中起關(guān)鍵作 用（Ai et al.，2008）。凡納濱對(duì)蝦在長(zhǎng)期低鹽脅迫下，機(jī)體免疫能力下降，對(duì)病原體的易感性增加（Lin et al.，2012），本研究中，鹽度和亞硝酸鹽氮雙重脅 迫下，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和鰓的Crustin、CASP3及 CytC基因相對(duì)表達(dá)量均隨著亞硝酸鹽氮濃度的升 高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，表明低濃度亞硝酸鹽氮脅迫會(huì)誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦免疫功能，使機(jī)體產(chǎn)生 免疫應(yīng)答，Crustin、CASP3及CytC基因相對(duì)表達(dá)量 被誘導(dǎo)，加快凋亡過程，減少脅迫對(duì)機(jī)體的影響，維 持穩(wěn)態(tài)；但高濃度的亞硝酸鹽氮脅迫抑制了凡納濱 對(duì)蝦肝胰腺和鰓的細(xì)胞凋亡功能，細(xì)胞不能進(jìn)行有 序凋亡，ROS在體內(nèi)過量累積，可能是由于長(zhǎng)期的環(huán) 境脅迫對(duì)肝胰腺和鰓組織造成了不可逆?zhèn)?，機(jī)體 凋亡系統(tǒng)受損。

4結(jié)論

抗氧化酶（CAT和GPx）及抗氧化與免疫相關(guān)基 因（Mn-sod、CAT、GPx、CytC、CASP3和Crustin）參與凡納濱對(duì)蝦在鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫下的應(yīng)答過 程。鹽度和亞硝酸鹽氮的變化會(huì)引起凡納濱對(duì)蝦氧 化應(yīng)激反應(yīng)，脅迫程度較輕時(shí)，機(jī)體通過增加抗氧化 酶活性并上調(diào)抗氧化與免疫相關(guān)基因協(xié)同應(yīng)對(duì)外界 惡劣環(huán)境，減少鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì) 蝦的損傷，維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，提高機(jī)體耐受性；但隨著 脅迫程度加強(qiáng)，凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)代謝紊亂，酶活性和 基因相對(duì)表達(dá)量下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，對(duì)肝胰腺 和鰓造成損傷，影響正常生理功能，最終導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦死亡。

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