SOCS1基因過表達對豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響

摘要：【目的】明確細胞因子信號轉導抑制因子1基因（SOCS1）過表達對乳腺發(fā)育關鍵信號通路（JAK/STAT）相關基因表達的影響，為揭示SOCS1基因調節(jié)豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的作用機制提供參考依據(jù)。【方法】構建SOCS1基因過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC，分別轉染豬乳腺上皮細胞，然后通過CCK-8檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡情況，實時熒光定量PCR檢測轉染后JAK/STAT信號通路相關基因的表達變化?！窘Y果】以過表達載體pcDNA3.1-SOCS7和陰性對照載體pcDNA3.1-NC分別轉染豬乳腺上皮細胞，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組的SOCS1基因相對表達量極顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組（Plt;0.01，下同）;轉染48和72h后，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組豬乳腺上皮細胞的OD值極顯著低于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制豬乳腺上皮細胞的增殖能力；過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組的細胞凋亡率[（36.15±0.92）%]顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，下同），且過表達載體pcDNA3.1-SOCS?轉染組中的G1期細胞比例極顯著降低，而S期和G2期細胞比例顯著升高。與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組相比，除JAK2、STAT3和TYK2基因外，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組中的SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCL1和PIAS3等9個JAK/STAT信號通路相關基因的相對表達量均極顯著升高。【結論]SOCS1基因過表達可抑制豬乳腺上皮細胞增殖及促進細胞凋亡，并影響JAK/STAT信號通路相關基因的表達變化，從而在豬的乳腺發(fā)生發(fā)育調控機制中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：豬；乳腺上皮細胞；SOCS1基因；細胞增殖；細胞凋亡；JAK/STAT信號通路

中圖分類號：S828.3文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）01-0207-10

Effects of SOCS1 gene overexpression on proliferation and apoptosis of porcine mammary epithelial cells

MAO Tong-hui122，YANG Suan3，LUO Jie2，SU Zheng2，ZHANG Yi-yu3?

（'Tongren Animal Husbandry Technology Promotion Station，Tongren，Guizhou554300，China;2Tongren Polytechnic College，Tongren，Guizhou554300，China;3College of Animal Science，Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics，Breedingand Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang，Guizhou550025，China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to clarify the effect of overexpressed cytokine signal transducer suppressor1（SOCS1）gene on the expression of key signaling pathway（JAK/STAT）related genes in mammary gland de-velopment，and to provide reference for revealing the mechanism of SOCS1 gene regulating proliferation and apoptosis of porcine mammary epithelial cells.【Method]The overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 and the negative control vector pcDNA3.1-NC were constructed and transfected into porcine mammary epithelial cells，respectively.Then，cell prolifera-tion was detected by CCK-8，cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry，and the expression changes of JAK/STAT signaling pathway related genes after transfection were detected by real-time fluorescence quantitative PCR【Result]Porcine mammary epithelial cells were transfected with overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 and negative control vector pcDNA3.1-NC，respectively.The relative expression of SOCS1 gene in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely significantly higher than that in the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group（Plt;0.01，thesame below）.After transfection for48and72h，the OD value of porcine mammary epithelial cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely significantly""""" lower than that in the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group，indicating that the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 could effectively inhibit the proliferation ability of porcine mammary epithelial cells.The apoptosis"""""" rate of cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group[（36.15±0.92）%]was significantly higher"""" than that of the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，the same below），""" and the rate of G1phase cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely signifi-cantly decreased，while the rates of Sand G2phase cells were significantly increased.Compared with thenegative control vector pcDNA3.1-NC transfection group，except for JAK2，STAT3and TYK2genes，the relative expressions of9JAK/STAT signaling pathway related genes，including SOCS2，SOCS3，JAK1，STAT2，STAT5A，IL-6，PRLR，MCLI and PLAS3，in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group were extremely significantly increased.【Con-" clusion]Overexpression of SOCS1gene can inhibit the proliferation of porcine mammary epithelial cells and promote the""" apoptosis of cells and affect the expression changes of JAK/STAT signaling pathway related genes，thus playing an impor-"""" tan rolein the regulation mechanism of mammarygland development in pigs

Keywords：pig;porcine mammary epithelial cells;SOCS1 gene;cell proliferation;cell apoptosis;JAK/STAT sig-naling pathway

Foundation items：Guizhou Outstanding Young Scientific and Technological Talents Training Project（QKHPTRC〔2021〕5630）;Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2021〕Yiban147，QKHZC〔2022〕1Y038）;Animal Husbandry and Veterinary Professional Group Technical Skills Platform Project of Tongren Polytechnic College（〔2022〕02）

0引言

【研究意義】豬作為產(chǎn)仔數(shù)較多的家畜，其乳腺發(fā)育情況直接影響仔豬的生長，從而關系到整體的生產(chǎn)力。在哺乳動物的乳腺發(fā)育過程中，由關鍵調控因子和激素控制的遺傳信息與表皮生長因子家族成員調控的通路協(xié)同作用，在青春期、懷孕及哺乳期間協(xié)調生長和形態(tài)發(fā)生（Macias and Hinck，2012;劉嘉爍等，2023），但有關各類調控因子與生長因子通路之間的相互作用機制尚未明確。因此，亟待開展相關基因超表達對豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響研究，探明其調控機制，為研究豬乳腺發(fā)育提供科學依據(jù)。【前人研究進展】Chu等（2018）通過抑制和過表達miR-15b，結果發(fā)現(xiàn)miR-15b能下調小鼠乳腺上皮細胞的脂質代謝；華麗萍等（2020）通過干擾和過表達盤狀蛋白結構域受體1基因（DDR1），證實該基因能促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，并顯著抑制細胞凋亡；Li等（2022）在探究牛miR-199a-3p調節(jié)牛乳腺上皮細胞炎癥免疫反應的潛在機制時發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p的沉默能完全逆轉其過表達所產(chǎn)生的效應，進一步揭示miR-199a-3p可作為治療牛乳腺炎的有效靶點；朱俊儒等（2023）通過干擾和過表達方式探究程序性細胞死亡因子4（PDCD4）對奶山羊乳腺上皮細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)干擾PDCD4基因表達可促進乳腺上皮細胞增殖并降低凋亡水平，過表達PDCD4基因則抑制細胞增殖及促進細胞凋亡。細胞因子信號轉導抑制因子（SOCS）家族蛋白通過SH2結構域和SOCS box結構域調控下游蛋白GHR、JAK激酶、STAT蛋白的磷酸化作用，進而影響GH信號通路反應，調控動物生長發(fā)育（González et al.，2002;楊忠誠等，2015）。細胞因子信號轉導抑制因子1（SOCS1）作為SOCS家族的成員之一，近年來在人類疾病和藥物研發(fā)領域已有大量研究，尤其是探究SOCS1在各類癌癥及炎癥疾病中的調控機制（鄧楨等，2021）。Lindeman等（2001）利用SOCS1基因缺陷小鼠研究SOCS1基因作為催乳素反應調節(jié)劑的作用，結果發(fā)現(xiàn)SOCS1基因缺陷小鼠在妊娠晚期和早泌乳期表現(xiàn)出乳腺小葉肺泡發(fā)育加速，證實了SOCS1基因在分娩前預防泌乳機制中的關鍵性。與SOCS1基因同樣具有KIR特殊結構的SOCS3基因，參與JAK2-STAT5A信號通路而調控奶牛乳腺上皮細胞增殖及泌乳，且SOCS3基因沉默能促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖相關基因的表達（Huang et al.，2013;Geng et al.，2021）。由此推測，干擾SOCS1基因也可抑制豬乳腺上皮細胞細胞增殖，但其作用機制尚未明確?！颈狙芯壳腥朦c】至今，已發(fā)掘出大量乳腺相關調控關鍵因子，但還需從關鍵基因的變量表達進一步驗證其調控效應，包括SOCS1基因在不同物種乳腺中如何調節(jié)信號轉導途徑等，尤其對于繁殖性能較差的地方豬種，亟待揭示SOCS1基因調控豬乳腺發(fā)育的作用機制以推進地方豬種的品種改良?！緮M解決的關鍵問題】通過構建SOCS1基因過表達載體并轉染豬乳腺上皮細胞，采用實時熒光定量RCR、CCK-8試劑及流式細胞術等檢測方法分析SOCS1基因對乳腺發(fā)育關鍵信號通路（JAK/STAT）相關基因表達的影響，為揭示SOCS1基因調節(jié)豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的作用機制提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試健康母豬由貴州省赫章縣種豬場提供，其經(jīng)產(chǎn)3代，乳腺發(fā)育良好，無病灶。于斷奶后1周屠宰，以無菌剪刀采集其乳腺組織進行原代乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)。動物試驗由貴州大學動物倫理委員會批準，批準號EAE-GZU-2022-P049。胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、F12培養(yǎng)基、Opti-MEMIM減血清培養(yǎng)基和青鏈霉素混合液購自Gibco公司；Lipofectamine3000轉染試劑購自Invitrogen公司；2×T5Fast qPCR Mix和核酸染料購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取液及cDNA逆轉錄試劑盒購自Thermo-Fisher Scientific公司；細胞內角蛋白18（CK18）抗體（10712-1-AP，一抗）和Alexa Fluor488標記山羊抗兔IgG（H+L）（SA00006-2，二抗）購自Proteintech公司。

1.2豬乳腺上皮細胞培養(yǎng)及鑒定

參照張亞林（2016）的方法，將乳腺組織置于無菌培養(yǎng)皿中，PBS多次清洗，采用眼科剪修剪整塊乳腺，剔除皮膚和脂肪等多余組織，剪成1mm

大小的顆粒并裝入50mL無酶離心管中，加入組織塊體積3倍的IV型膠原酶溶液，置于37℃恒溫水浴鍋中消化50min，期間每隔5min搖晃1次；消化結束后吸取離心管內的上清液，用400目不銹鋼細胞過濾篩將其過濾至培養(yǎng)皿中，向濾液加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化，制成細胞消化液。將細胞消化液轉入15mL離心管中，1000r/min離心10min，棄上清液；再加入5mL完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，再次離心；最后以2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀并鋪板，置于37℃、5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為鑒定豬乳腺上皮細胞，采用間接免疫熒光法對細胞CK18進行染色，具體操作如下：將玻璃爬片平放于細胞培養(yǎng)板中，加入適量培養(yǎng)基，細胞數(shù)量控制在2000個孔，置于CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。待細胞爬片后棄培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入4%多聚甲醛（PFA），在4℃下固定30min，再以PBS清洗3次。將玻璃爬片取出，置于培養(yǎng)皿支撐物上，滴加50.0μL破膜封閉液（0.5%Trition X-100與PBS按1：1混合，再加入10%血清）于防水膜上封閉約2h。取50.0μL一抗（用PBS按1：100稀釋）滴加于防水膜上，4℃下孵育過夜；二抗避光孵育（用PBS按1：500稀釋）2h，以PBS清洗3次，加入300.0μLDAPI染色5min，以PBS再清洗3次。每個樣品玻璃爬片上各滴加1滴Fluoromount-G熒光封片劑，避光封片1h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3SOCS1基因過表達載體構建及轉染

以pcDNA3.1為載體，委托北京擎科生物科技股份有限公司構建過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC。SOCS1基因過表達載體引物序列信息見表1。將狀態(tài)良好的豬乳腺上皮細胞接種至6孔細胞板，待細胞生長匯合度達70%左右時，按Lipofectamine3000轉染試劑說明進行轉染，在2支1.5mL無菌無酶EP管中各加入125.0μLOpti-MEMTM減血清培養(yǎng)基，然后向其中一支EP管中加入5.0μL Lipofectamine3000轉染試劑，而另一支EP管中加入5.0μLP3000M試劑和5.0μL表達載體（500ng/μL），最后將2支EP管溶液混合，室溫孵育30min，將孵育好的混合溶液均勻滴加到6孔細胞板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中轉染24～48h，利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發(fā)光情況。

1.4CCK-8檢測細胞增殖

將豬乳腺上皮細胞接種至96孔細胞板中，分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC進行轉染，于細胞貼壁后6、12、24、48和72h，按CCK-8試劑盒說明向對應細胞孔各加入15.0μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后通過酶標儀于450nm處檢測不同處理組的細胞吸光值。每個轉染載體設5個重復細胞孔，每個轉染組重復3次。

1.5流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡

豬乳腺上皮細胞轉染48h后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶進行消化，1000r/min離心5min，棄上清液，獲得細胞沉淀，通過流式細胞儀測定細胞周期及細胞凋亡情況。（1）細胞周期檢測：用PBS洗滌細胞沉淀，250r/min離心6min，棄上清液，加入2mL預冷的70%乙醇，-20℃保存或用于DNA染色；取出細胞樣本，250r/min離心5min，棄上清液，PBS洗滌2次，相同條件重復離心1次，棄上清液；加入60.0μLRNase（10mg/mL），37℃水浴30min，加入400.0μLPI染液，混勻，4℃避光反應20min，在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長585±21nm下進行流式細胞術檢測。（2）細胞凋亡檢測：向細胞

沉淀加入500.0μLPBS，1000r/min離心6min，棄上清液；加入1×Binding Buffer緩沖液，制成1×106個/mL的細胞懸液，采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（BD5556574）進行檢測。流式細胞儀測定參數(shù)：激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長FL1為525±20nm FL2為585±21nm。

1.6總RNA提取及cDNA合成

豬乳腺上皮細胞轉染48h后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入1mL TRIzol裂解液，將混合溶液轉入EP管并加入200.0μL氯仿，混勻，4℃孵育10min后，4℃下12000r/min離心15min。吸取上層水相至新的EP管中，加入500.0μL異丙醇，混勻，冰上靜置15min，4℃下12000r/min離心10min，棄上清液；向EP管中加入1mL75%乙醇洗滌沉淀，4℃下7500r/min離心5min，棄上清液；打開EP管置于超凈工作臺中風干，待沉淀由白色變成透明時加入30.0μL DEPC水溶解沉淀，利用超微量紫外可見分光光度計檢測RNA濃度和純度。按照cDNA逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，經(jīng)紫外可見分光光度計測定其濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7實時熒光定量PCR檢測JAK/STAT信號通路相關基因表達

根據(jù)NCBI已公布的豬SOCS1基因和JAK/STAT信號通路相關基因序列，利用Primer-BLAST設計實時熒光定量PCR擴增引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin為內參基因進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系10.0μL：2×UltraSYBR Mixture5.0μL，cDNA模板（100ng/μL）1.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH?O補足至10.0μL。擴增程序：95℃預變性10min;95℃10s，退火45s，72℃32s，進行35個循環(huán)。每個樣設3次重復，采用2-～法計算目的基因相對表達量。

1.8統(tǒng)計分析

利用WPS Office對豬乳腺上皮細胞的增殖、凋亡和周期，以及SOCS1基因和JAK/STAT信號通路相關基因的相對表達量進行統(tǒng)計分析；采用Modfit分析流式細胞數(shù)據(jù)，以確定細胞周期分布情況；使用FlowJo10.0.0分析豬乳腺上皮細胞在不同狀態(tài)下的凋亡比例；利用SPSS26.0對各基因相對表達量進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并以Graphpad Prism6.0制圖。

2結果與分析

2.1豬乳腺上皮細胞培養(yǎng)及鑒定結果

由母豬乳腺組織分離培養(yǎng)獲得的豬乳腺上皮細胞如圖1所示。分離獲得的豬原代乳腺上皮細胞呈上皮樣，其形狀不規(guī)則，以鋪路石狀生長分裂（圖1-A和圖1-B）。細胞免疫熒光鑒定結果（圖1-C、圖1-D和圖1-E）顯示，CK18免疫熒光染色呈陽性，且細胞純度在90%以上。

2.2SOCS1基因過表達載體構建情況

對完成測序的SOCS7基因過表達載體pcDNA3.1-SOCS1進行EcoRI和AvrⅡ雙酶切鑒定，結果（圖2）顯示獲得的目的條帶大小（1756bp/4326bp）與預期結果相符，其中1條與SOCS1基因大小一致，表明成功構建獲得過表達載體pcDNA3.1-SOCS1。

2.3SOCS1基因在豬乳腺上皮細胞中的表達情況

分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC瞬時轉染豬乳腺上皮細胞，轉染24h后即可觀察到載體pcDNA3.1（+）中的綠色熒光蛋白普遍發(fā)光（圖3-A），能明顯觀察到上皮樣細胞，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS7和陰性對照載體pcDNA3.1-NC均成功轉染豬乳腺上皮細胞。實時熒光定量PCR檢測結果（圖3-B）顯示，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染豬乳腺上皮細胞中的SOCS1基因相對表達量極顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染豬乳腺上皮細胞（Plt;0.01，下同）。

2.4SOCS1基因過表達對豬乳腺上皮細胞增殖的影響

分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染豬乳腺上皮細胞，采用CCK-8法在酶標儀450nm波長處檢測轉染6、12、24、48和72h后豬乳腺上皮細胞的增殖情況，結果（圖4）顯示：與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組相比，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組豬乳腺上皮細胞OD值在轉染48和72h時極顯著降低，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制豬乳腺上皮細胞的增殖能力。

2.5SOCS1基因過表達對豬乳腺上皮細胞凋亡及細胞周期的影響

以流式細胞儀檢測過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染后的豬乳腺上皮細胞凋亡水平，結果（圖5）顯示，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組的細胞凋亡率[（36.15±0.92）%]顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，下同）。由圖6可看出，與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組相比，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組中的G1期細胞比例極顯著降低，而S期和G2期細胞比例顯著升高，說明過表達SOCS1基因將促使豬乳腺上皮細胞阻滯于G2期和S期，從而改變細胞周期進程。

2.6SOCS1基因過表達對JAK/STAT信號通路相關基因表達的影響

采用實時熒光定量PCR對SOCS1基因過表達后JAK/STAT信號通路相關基因的相對表達量進行檢測，結果（表3）顯示，與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉染組相比，除JAK2、STAT3和TYK2基因外，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉染組中的SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCLI和PIAS3等9個JAK/STAT信號通路相關基因的相對表達量均極顯著升高。

3討論

在哺乳動物的一生中，其乳腺上皮細胞不斷經(jīng)歷增殖、分化和凋亡等過程。已有許多研究表明，乳腺上皮細胞的增殖和凋亡受許多因素影響，包括激素（Annen et al.，2008）、營養(yǎng)（Meng et al.，2017）及環(huán)境（Kapila et al.，2018）等。酵母硒（SeY）和蛋氨酸硒（Sel-Met）通過p38/JNK信號通路調控硒蛋白表達和抗氧化能力，從而抑制豬乳腺上皮細胞凋亡（Wu et al.，2020）;血清素（5-HTP）通過MAPK/ERK/Bcl-3途徑能抑制山羊乳腺上皮細胞凋亡（Zhao et al.，2021）;補充葉酸可促進牛乳腺上皮細胞增殖并減少凋亡（Bae et al.，2022）;橙皮苷通過Bcl-2/Bax-Caspase3信號通路能阻抑H?O?誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡，有效提高細胞活性（劉嘉爍等，2023）。SOCS家族基因與JAK/STAT信號通路調控多種細胞的增殖與凋亡變化，敲除SOCS1基因可促進人類肺泡上皮細胞凋亡（Qian et al.，2012）;非編碼microRNA-155（miR-155）通過沉默SOCS1基因而促進肝星狀細胞周期進程及減少細胞凋亡，而沉默miR-155可上調SOCS1基因并促使MAPK信號通路失活，進而抑制酒精性肝星狀細胞增殖及促進細胞凋亡（Liu et al.，2020）;SOCS1基因過表達能誘導G2/M期細胞周期阻滯和凋亡，顯著降低細胞增殖（Kajiyama et al.，2022）。綜上所述，SOCS1基因能抑制細胞增殖及促進細胞凋亡，且與相關泌乳的信號通路緊密相關。此外，與SOCS1基因同樣具有特殊結構KIR的SOCS3基因沉默會促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳及上調相關基因表達（Huang et al.，2013），且有研究證實SOCS3基因能促進卵巢上皮癌細胞凋亡（王茹等，2022），故推測過表達SOCS1基因能抑制豬乳腺上皮細胞增殖并促進細胞凋亡。

在動物生產(chǎn)方面，已有研究圍繞SOCS基因及JAK/STAT信號通路在奶牛產(chǎn)奶量、乳房炎癥、乳蛋白合成等作用機制方面開展深入探索（Coskun et al.，2013;Khan et al.，2020），證實JAK/STAT信號通路是在幾種多肽激素和細胞因子的下游運作，且這些激素和細胞因子是乳腺產(chǎn)后分泌功能的關鍵（Hennighausen and Robinson，2001）。JAK/STAT信號通路的激活參與促進多種細胞增殖。Yin等（2021）研究表明，在細胞滋養(yǎng)層中過表達SOCS3基因能減少細胞凋亡，敲低SCOS3基因則獲得相反效果，證實SOCS3基因過表達能抑制JAK2和STAT3磷酸化。郝蘭等（2022）在探究祛腐生肌合劑聯(lián)合表皮細胞生長因子調控壓瘡創(chuàng)面修復作用機制時發(fā)現(xiàn)，上調SOCS1蛋白表達水平能抑制JAK2/STAT3信號通路表達。此外，有研究報道沉默.JAK2基因表達后牛乳腺上皮細胞的增殖和分化降低95%以上（Shillingford et al.，2002）。在本研究中，SOCS1基因過表達能極顯著提高JAK/STAT信號通路內大部分相關基因（SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCL1和PIAS3）的相對表達量。其中，JAK2和STAT3基因相對表達量呈降低趨勢，不僅證實了SOCS1基因與JAK2和STAT3基因間的負反饋抑制關系，還提示JAK2和STAT3基因在豬乳腺上皮細胞增殖與凋亡調控中與SOCS1基因存在密切關系。STAT3基因能特異性二聚化誘導細胞凋亡，而STAT5基因會減弱由STAT3基因誘導劑LIF介導的細胞凋亡（Clarkson et al.，2006）。STAT3和STAT5A在整個乳腺發(fā)育周期中具有相互激活的作用模式，其中，STAT5A可能是分化乳腺上皮細胞的生存因子，而STAT3可能是細胞凋亡的關鍵因子（Chapman et al.，2000）。李輝（2014）研究表明，抑制STAT5A基因表達后，山羊乳腺上皮細胞增殖受抑制，而細胞凋亡率明顯上升。本研究中，隨著SOCS1基因在豬乳腺上皮細胞中的過表達，STAT3和STAT5A基因的表達呈現(xiàn)相反的變化趨勢，其中STAT5A基因表達量極顯著升高。綜合STAT家族基因在乳腺上皮細胞中的調控研究結論，以及SOCS蛋白是STATs的直接轉錄靶點，可推測SOCS1基因與STAT3和STAT5A基因間的相互作用對于豬乳腺上皮細胞的增殖和凋亡起關鍵作用，但具體調控機制還需進一步探究。

4結論

SOCS1基因過表達可抑制豬乳腺上皮細胞增殖及促進細胞凋亡，并影響JAK/STAT信號通路相關基因的表達變化，從而在豬的乳腺發(fā)生發(fā)育調控機制中發(fā)揮重要作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）