蝦類十足目虹彩病毒1（DIV1）LAMP-HNB快檢方法的建立

摘要 ［目的］建立一種操作簡便、快速、可視化的蝦類病原檢測方法，實現(xiàn)基層養(yǎng)殖戶自檢。［方法］針對十足目虹彩病毒1（DIV1），設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）特異性引物，對反應(yīng)試劑用量、溫度、反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立LAMP與羥基萘酚藍(lán)（HNB）結(jié)合的LAMP-HNB可視化快速檢測方法。［結(jié)果］在LAMP反應(yīng)體系中添加12 mmol/L Mg2+和250 μmol/L HNB，65 ℃恒溫條件下反應(yīng)60 min最佳；DIV1病原質(zhì)粒最低檢出限為102 copies/μL，穩(wěn)定性和特異性較好，通過帶有靶標(biāo)基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行16次重復(fù)性試驗結(jié)果均較為穩(wěn)定，多種模板擴(kuò)增試驗均未發(fā)生假陽性情況，符合試驗要求。［結(jié)論］該研究建立的LAMP-HNB可視化快速檢測方法，適用于上述對蝦DIV1的現(xiàn)場快速檢測。

關(guān)鍵詞 南美白對蝦；LAMP；HNB；十足目虹彩病毒1；快速檢測

中圖分類號 S945.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0192-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.041

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Establishment of LAMP-HNB Rapid Detection Method for Decapod Iridescent Virus 1 （DIV1） of Shrimp

WANG Wen-qiong1，GE Ming-feng1，LU Xian-dong2 et al

（1.Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute，Ningbo，Zhejiang 315012;2.Ningbo AiGene Technology Co.，Ltd.，Ningbo，Zhejiang 315105）

Abstract ［Objective］To establish a simple，rapid and visual pathogen detection method for shrimp，and to achieve self detection by fishermen.［Method］The specific primers of LAMP （loop-mediated isothermal amplification technique） were designed for decapod iridescent virus 1 （DIV1）.After optimizing the conditions of reagent dosage，temperature and reaction time，a visual and rapid detection method of LAMP combined with hydroxynaphthol blue （HNB） was established.［Result］12 mmol/L Mg2+ and 250 μmol/L HNB solution in the LAMP reaction system was the most suitable condition at 65 ℃ for 60 min.The minimum detection limits of LAMP-HNB of DIV1 was 102 copies/μL plasmid.The stability and specificity of the detection of DIV1 had also been verified using positive plasmids with target genes，and the results of 16 repeated experiments were relatively stable，multiple template amplification experiments did not show false positives，which meets the experimental requirements.［Conclusion］The LAMP-HNB visualization rapid detection method established in this study is suitable for the on-site rapid detection of shrimp DIV1 mentioned above.

Key words Litopenaeus vannamei;LAMP;HNB;Decapod iridescent virus 1（DIV1）;Rapid detection

我國是蝦類養(yǎng)殖大國，特別是南美白對蝦（Litopenaeus vannamei），為我國主導(dǎo)養(yǎng)殖蝦類品種。隨著高密度、集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的普及，各類疾病頻發(fā)。據(jù)《2022中國水生動物衛(wèi)生狀況報告》，2021年養(yǎng)殖蝦類因疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)90億元，而十足目虹彩病毒1（DIV1）為感染養(yǎng)殖蝦類的主要病原［1］。因此，急需建立一種針對蝦類疾病的快速診斷技術(shù)，以便基層養(yǎng)殖企業(yè)第一時間發(fā)現(xiàn)病原，從而采取防控措施及時止損。目前國內(nèi)外已有多種方法用于對蝦病原檢測，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、微陣列檢測、核酸分子雜交等［2］，但這些方法存在操作步驟煩瑣、操作時間長、對儀器和操作要求較高、易導(dǎo)致氣溶膠污染等不足，不適合基層快速檢測。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一項新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度和重復(fù)性良好、結(jié)果判讀簡易、不需要特殊設(shè)備、操作簡單等優(yōu)點［3］。羥基萘酚藍(lán)（HNB）在LAMP反應(yīng)體系中作為產(chǎn)物指示劑，既能滿足肉眼判讀結(jié)果的需求，又能避免反應(yīng)后開蓋引起的氣溶膠污染，更適合在實際檢測中應(yīng)用［4］。LAMP-HNB是基于LAMP技術(shù)形成的一種可視化的快速檢測方法，可通過反應(yīng)前后染料的顏色變化來判斷檢測結(jié)果。此方法無需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備，具有成本低、特異性強(qiáng)、操作簡單、高效快捷、結(jié)果易觀察、滿足基層現(xiàn)場操作等優(yōu)點。該研究基于LAMP-HNB建立針對蝦類十足目虹彩病毒1的快速檢測方法，可使蝦類養(yǎng)殖企業(yè)在養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，該方法為及時排除對蝦養(yǎng)殖期的病原感染風(fēng)險、規(guī)避主要流行性病害暴發(fā)風(fēng)險、提前做好預(yù)警和防治工作提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10×反應(yīng)緩沖液和Bst DNA聚合酶，購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；SYBR Green熒光染料，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒，購自上海百力格生物技術(shù)有限公司。南美白對蝦樣品于2022年4—6月采集自浙江省寧波市各對蝦養(yǎng)殖場，體長3～10 cm，現(xiàn)場取肝胰腺、鰓、腸、肌肉等組織經(jīng)95%乙醇固定后帶回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計。利用Primer Explorer V5軟件，依據(jù)GenBank報道的病原特異性序列（GenBank序列號KY681040.1），分別設(shè)計兩對LAMP引物，包括2條內(nèi)引物（FIP：5′-ACGAATCGTTTCCCGTGAGA-CAAATGCTGACGA-AATCATCA-3′；BIP：5′-TGGGCTCGAGATTTGTTCCAAC-GCTTGTTGCAAATCATGTGTA-3′）和2條外引物（F3：5′-TGTTAGATGGGCAGTCATG-3′；B3：5′-GCATCCTTGATTGCTGGA-3′）。

1.2.2 最適反應(yīng)溫度優(yōu)化。根據(jù)Bst DNA聚合酶特性，分別在63、65、67 ℃ 3個溫度梯度下進(jìn)行試驗，通過比較熒光起峰時間確認(rèn)最適反應(yīng)溫度。反應(yīng)時間設(shè)定為60 min，模板為含DIV1靶基因序列的質(zhì)粒（模板濃度為104 copies/μL），反應(yīng)體系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，SYBR Green 熒光染料0.5 μL，ddH2O 14.0 μL，模板1.0 μL，總體積25.0 μL。

1.2.3 最適反應(yīng)時間優(yōu)化。以DIV1靶基因質(zhì)粒（濃度100～106 copies/μL）為模板，分別反應(yīng)30、45、60 min后，觀察熒光起峰時間，確認(rèn)最適反應(yīng)時間，反應(yīng)體系同“1.2.2”。

1.2.4 Mg2+濃度優(yōu)化。以DIV1靶基因質(zhì)粒（濃度104 copies/μL）為模板，分別設(shè)置MgSO4終濃度為8、12、16 mmol/L，在3組試驗中分別加入100 mmol/L MgSO4 0、1.0和2.0 μL，每組反應(yīng)體系中再加含80 mmol/L MgSO4的10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTP 4.0 μL、100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL、Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL、SYBR Green熒光染料0.5 μL、HNB 1.0 μL，最終加ddH2O至25.0 μL，在65 ℃下反應(yīng)60 min，確認(rèn)最佳顯色的同時，觀察熒光起峰時間，確認(rèn)最佳Mg2+濃度。

1.2.5 HNB濃度優(yōu)化。對HNB濃度進(jìn)行優(yōu)化，以求獲得最好的顯色效果。以DIV1靶基因質(zhì)粒（濃度104 copies/μL）為模板，設(shè)置HNB終濃度為150～500 μmol/L，在65 ℃下反應(yīng)60 min，確認(rèn)最佳顯色濃度。反應(yīng)體系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，100 mmol/L MgSO4 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，150～500 μmol/L HNB 1.0 μL，ddH2O 12.5 μL，模板1.0 μL，總體積25.0 μL。

1.2.6 特異性試驗。以蝦類常見的8種病原［白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性肌壞死病毒（IMNV）、對蝦偷死野田村病毒（CMNV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）、致急性肝胰腺壞死病弧菌（Vp

AHPND）、DIV1］以及ddH2O為模板進(jìn)行特異性試驗，觀察DIV1檢測體系是否產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。反應(yīng)條件（65 ℃下反應(yīng)60 min）和反應(yīng)體系見“1.2.5”，其中HNB終濃度為250 μmol/L。

1.2.7 靈敏度試驗。通過調(diào)節(jié)DIV1的初始濃度，經(jīng)10倍梯度稀釋，制備質(zhì)粒濃度為100～106 copies/μL，評估反應(yīng)體系的靈敏度。通過觀察HNB顯色效果，探究檢測體系的最低檢測限，反應(yīng)條件（65 ℃下反應(yīng)60 min）和反應(yīng)體系見“1.2.5”。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗。為確保LAMP-HNB反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，通過帶有靶標(biāo)基因的陽性質(zhì)粒，進(jìn)行16次重復(fù)試驗，確認(rèn)其穩(wěn)定性。質(zhì)粒濃度為DIV1檢測限濃度，反應(yīng)條件（65 ℃下反應(yīng)60 min）和反應(yīng)體系見“1.2.5”。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適反應(yīng)溫度 從表1和圖1可以看出，隨溫度上升，擴(kuò)增效率隨之提高，當(dāng)溫度升至67 ℃時擴(kuò)增效率有所下降，故選擇65 ℃作為最適反應(yīng)溫度。

2.2 最適反應(yīng)時間

不同濃度的DIV1靶基因質(zhì)粒模板對比試驗（表2）發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增曲線的起峰時間均在60 min內(nèi)。從擴(kuò)增曲線（圖2）來看，起峰時間晚（模板濃度低）的擴(kuò)增曲線在60 min以后才開始進(jìn)入平臺期（但這時已能確保結(jié)果的判定）?？紤]到檢測的快捷性和準(zhǔn)確性要求，選擇60 min較為合理。

2.3 最適Mg2+濃度篩選

不同Mg2+終濃度（8、12、16 mmol/L）對比試驗（表3、圖3）發(fā)現(xiàn)，12 mmol/L Mg2+組擴(kuò)增效率最高，其次是16 mmol/L Mg2+組，而8 mmol/L Mg2+組的擴(kuò)增效率最低。通過觀察反應(yīng)前后的顏色變化，其中8 mmol/L Mg2+組的顏色變化差距較小，不易觀察，而16 mmol/L Mg2+組是從紫色變?yōu)樽狭_蘭色，只有12 mmol/L Mg2+組為紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色，變化較為明顯。因此在該試驗中，12 mmol/L為反應(yīng)體系最適Mg2+終濃度。

2.4 最適HNB濃度篩選

從圖4可以看出，隨HNB濃度升高，體系顏色逐步加深。500 μmol/L濃度時，反應(yīng)前后體系顏色均為紫色，400 μmol/L濃度時需要有較好的視線才能分辨陰性、陽性，200 μmol/L濃度時兩者顏色對比相對較淺。經(jīng)多次比較選擇，發(fā)現(xiàn)250 μmol/L組反應(yīng)前后色差最明顯，

辨識度較強(qiáng)。陽性反應(yīng)呈藍(lán)天色，陰性呈紫羅蘭色，故選擇250 μmol/L為體系中HNB的最佳終濃度。

2.5 特異性測試

為測試DIV1引物是否會產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，以8種常見對蝦病原為模板進(jìn)行擴(kuò)增試驗。結(jié)果表明（圖5），DIV1檢測體系經(jīng)過多種模板擴(kuò)增試驗均未發(fā)生假陽性情況，僅在DIV1模板下產(chǎn)生顏色反應(yīng)，符合試驗要求。

2.6 靈敏度試驗 試驗結(jié)果表明（圖6），100和101 copies/μL的模板濃度反應(yīng)后的顏色與陰性對照差異不明顯，102 copies/μL以上的模板濃度在反應(yīng)后與陰性對照具有較明顯的色差，因此DIV1病原質(zhì)粒LAMP-HNB最低檢測限為102 copies/μL，達(dá)到預(yù)期要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將帶有DIV1靶標(biāo)基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行16次重復(fù)性試驗確認(rèn)其穩(wěn)定性，結(jié)果表明（圖7），DIV1反應(yīng)體系在檢測限濃度的16次重復(fù)試驗中均很好地發(fā)生了擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物均呈現(xiàn)天藍(lán)色（陽性），符合要求。

3 討論

Bst DNA聚合酶大片段作為一種常用的DNA聚合酶，具有引發(fā)鏈置換反應(yīng)、高保真、耐高溫等特點，是一種重要的DNA多重置換擴(kuò)增酶［5］。DNA聚合酶都有一個最佳反應(yīng)溫度，該研究中的Bst DNA聚合酶在65 ℃左右呈現(xiàn)出最佳反應(yīng)溫度，這與該試劑提供商［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］描述是一致的。通過不同濃度的質(zhì)粒模板（100～106 copies/μL）對比試驗發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增曲線的起峰時間均在40 min內(nèi)，且隨模板濃度的增加，起峰時間呈現(xiàn)下降趨勢。從該試驗結(jié)果看，當(dāng)反應(yīng)50 min后擴(kuò)增曲線基本達(dá)到平臺期，一些強(qiáng)陽性的樣品在40 min內(nèi)可進(jìn)入反應(yīng)曲線平臺期，但是低濃度拷貝模板（101 copies/μL）在近60 min后才進(jìn)入平臺期。因此，在不影響結(jié)果判定的基礎(chǔ)上選擇反應(yīng)時間60 min較為合理，這個結(jié)果與徐匆等［4］、姜朕元等［6］所使用的方法一致。

體系成分濃度直接影響到反應(yīng)前后顏色變化，其中影響較大的是HNB和Mg2+濃度。該試驗通過反應(yīng)前后顏色變化來判定結(jié)果，反應(yīng)前體系溶液呈紫羅蘭色，反應(yīng)后陽性樣品變?yōu)樘焖{(lán)色，陰性樣品則顏色不變。反應(yīng)體系中HNB濃度起到了關(guān)鍵作用，如果HNB濃度過高，反應(yīng)前顏色呈現(xiàn)紫色（300 μmol/L以上），反應(yīng)前后辨識度不強(qiáng)；HNB濃度過低（150 μmol/L以下），反應(yīng)前后顏色均較淡，影響結(jié)果判定，該試驗經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化確定250 μmol/L為HNB最佳終濃度。由于Mg2+在反應(yīng)中形成dNTP-Mg 絡(luò)合物與核酸骨架相互作用，穩(wěn)定堿基形成中的中間體影響B(tài)st 聚合體，所以體系中Mg2+濃度小于一定值時，靶基因無法擴(kuò)增［7］。在該試驗中，8 mmol/L Mg2+組的顏色變化差距較小，肉眼不易觀察，而高濃度Mg2+組（16 mmol/L）起始時顏色為紫色，反應(yīng)后呈現(xiàn)變紫羅蘭色，與預(yù)期不符?？梢姡琈g2+不僅能影響靶基因的擴(kuò)增，還會對指示劑的顯色造成影響。該試驗中，12 mmol/L Mg2+組中反應(yīng)前體系為紫羅蘭色，靶基因擴(kuò)增后體系變?yōu)樘焖{(lán)色，變化較為明顯。此外，該試驗對DIV1檢測體系進(jìn)行了16次擴(kuò)增試驗來驗證引物的可靠性和體系的穩(wěn)定性，很好地證實了檢測引物的可靠性和穩(wěn)定性。另外，靈敏度測試結(jié)果為102 copies/μL，符合現(xiàn)場快速檢測需求。

目前暫無有效治療對蝦疾病的手段，對蝦病害的防控是一個復(fù)雜且系統(tǒng)性的工程，涉及蝦池的消毒殺菌、投飼、增強(qiáng)蝦體抗病能力、藥物治療等方面［8-10］。近幾年來，隨著對蝦檢測技術(shù)的發(fā)展以及對病原的研究，各種檢測手段也越來越成熟且多樣化，但大部分只能面向?qū)I(yè)的實驗室和技術(shù)人員，大多基層養(yǎng)殖戶沒有專業(yè)檢測手段，且專業(yè)接受性較弱，無法落到實處。該試驗建立的蝦類DIV1 LAMP-HNB技術(shù)具備操作簡便、易學(xué)、耗時短、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點，為實現(xiàn)養(yǎng)殖一線病原常態(tài)化自檢提供了新的解決方案。

4 結(jié)論

通過對體系反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、Mg2+濃度、HNB濃度、靈敏度、穩(wěn)定性等系列試驗，確認(rèn)該研究中所列引物檢測效果良好，最終確認(rèn)反應(yīng)體系為含80 mmol/L MgSO4的10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL、100 mmol/L MgSO4 1.0 μL、10 mmol/L dNTP 4.0 μL、100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL、Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL、250 μmol/L HNB 1.0 μL、ddH2O 12.5 μL、模板1.0 μL，總體積25.0 μL，在反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時間60 min條件下具有較好的靈敏度和特異性。

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