麝香草酚調(diào)控鹽土中水稻耐鹽作用研究

摘要 ［目的］研究麝香草酚調(diào)控鹽土中水稻耐鹽作用。［方法］選取江蘇省東臺市鹽度較高的水稻田（鹽度4‰）為研究對象，在揚花期結(jié)合葉面噴施自主研發(fā)的天然生物刺激素制劑5%麝香草酚，評估麝香草酚在田間調(diào)控水稻耐鹽的作用效果。［結(jié)果］噴施麝香草酚可顯著提升鹽土環(huán)境中水稻劍葉的生理狀態(tài)，包括提高葉綠素、脯氨酸、還原性糖含量；噴施麝香草酚可提高鹽土環(huán)境中水稻籽粒的飽滿度、穗粒數(shù)、千粒重；噴施麝香草酚可提高鹽土環(huán)境中稻米的黏稠度和醇溶蛋白含量，降低直鏈淀粉含量。［結(jié)論］田間噴施麝香草酚可有效提高水稻耐鹽性、維持產(chǎn)量性狀和稻米品質(zhì)，為新型耐鹽調(diào)控劑的研發(fā)和相應的田間應用技術(shù)開發(fā)提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 麝香草酚；水稻；鹽脅迫；耐鹽作用；稻米品質(zhì)

中圖分類號 S311 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）15-0055-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.012

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Thymol Regulates Rice Salt Tolerance in Saline Soil

ZHANG Xiao-wei1，ZHOU Xin-xiang2，CHEN Hao3 et al

（1.Jiangsu Cangdong Agricultural Development Co.Ltd.，Dongtai，Jiangsu 224237;2.Institute of Food Safety and Nutrition，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;3.Nanjing Lvxianzi Biotechnology Co.Ltd.，Nanjing，Jiangsu 210014）

Abstract ［Objective］ To study the thymol regulate rice salt tolerance in saline soil.［Method］ Selecting rice filed with high salinity （salinity 0.4‰） in Dongtai City，Jiangsu Province as the research object，self-developed natural bio-stimulator （5% thymol） at flowering period was sprayed，in order to evaluate the effect of thymol on the regulation of rice salt tolerance in filed.［Result］ Spraying thymol was able to enhance the physiological status of flag leaves in saline soil，such as the increase in chlorophyll content，proline content and reducing sugar content.Spraying thymol increased the grain plumpness，kernel number per spike and thousand kernel weight in saline soil.Spraying thymol enhanced rice viscosity and prolamin content，and decreased rice amylose content in saline soil.［Conclusion］ Spraying thymol effectively stimulated rice tolerance against salinity in field by maintaining productivity and rice quality in saline soil.This may provide scientific basis for the development of novel regulators conferring salt tolerance and its applying technology in field.

Key words Thymol;Rice;Salt stress;Salt tolerance effect;Rice quality

不合理的土地利用模式導致土壤次生鹽漬化問題日趨嚴重。我國受鹽漬化危害的耕地面積達933萬hm2。土壤鹽漬化抑制農(nóng)作物生長，嚴重制約我國糧食安全生產(chǎn)。另外，在保證原有耕地的基礎(chǔ)上，開發(fā)利用沿海鹽漬化耕地資源，是我國和江蘇省沿海地區(qū)耕地資源的重要戰(zhàn)略儲備［1］。鹽漬化土壤中的高濃度鹽分干擾作物體內(nèi)多種生理過程，抑制作物生長［2］。鹽脅迫導致作物水分和養(yǎng)分失衡，進一步發(fā)生滲透脅迫和離子脅迫，進而降低葉綠素水平、抑制光合作用穩(wěn)態(tài)、影響糖代謝和蛋白質(zhì)合成代謝，最終導致作物減產(chǎn)［3-4］。水稻不僅是重要的糧食作物之一，其作為中度鹽敏感作物，還可對土壤中鹽分起到淋溶作用［5］。如何保證鹽漬化耕地中水稻的安全生產(chǎn)，是保證我國糧食安全的重要措施［6］。

針對鹽漬化土壤中的水稻安全生產(chǎn)問題，土壤改良和耐鹽水稻育種是不可或缺的長期研究目標，而通過外源生理調(diào)控水稻耐鹽是相對簡單易行的栽培措施。國內(nèi)外已經(jīng)報道了一些調(diào)控作物耐鹽的化合物［7-8］，但其環(huán)境兼容性或?qū)嶋H應用性還有待進一步研究。因此，開發(fā)環(huán)境友好且能實際應用的新型耐鹽調(diào)控劑，是保障鹽漬化環(huán)境中作物生產(chǎn)的高效措施。

麝香草酚（又名百里香酚，Thymol）是百里香精油的主要成分，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎和解痙活性，在食品、藥品化妝品工業(yè)中作為抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)劑和防腐劑廣泛應用［9-10］。麝香草酚對環(huán)境友好，且已被化學合成，可大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)。李敏等［11］將麝香草酚開發(fā)為環(huán)保型農(nóng)用生物制劑，室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚可刺激作物免疫低于逆境脅迫，尤其可顯著提高水稻幼苗的耐鹽性［12］。由此推測麝香草酚具備提高作物耐鹽性的巨大潛力。因此，該研究采用前期開發(fā)的5%麝香草酚制劑，在沿海鹽漬化稻田中評估其緩解大田水稻鹽脅迫的能力，通過分析水稻植株生理變化、結(jié)實率和稻米品質(zhì)變化，評估麝香草酚在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中調(diào)控水稻耐鹽性的作用，旨在為實際可應用型的農(nóng)用耐鹽調(diào)控劑開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試水稻品種為“揚農(nóng)香28”（當?shù)剞r(nóng)戶常規(guī)種植粳米品種）；5%麝香草酚為李敏等［11］自主開發(fā)的配方制劑。

1.2 試驗設(shè)計 選取江蘇省東臺市鹽度較高的2塊水稻田（面積為2.67 hm2，土壤鹽度4‰），在水稻揚花期，配合無人機植保用藥開始對試驗組水稻葉面噴施5%麝香草酚制劑，濃度為750 g/hm2，每7 d噴施一次，連續(xù)用藥3次。處理組除了噴施5%麝香草酚制劑外，其他農(nóng)事操作與對照組完全相同。待3次用藥結(jié)束后，采用五點取樣法對水稻植株進行取樣，液氮冷凍后，-80 ℃保存待測。在水稻完全成熟后采集籽粒樣品，60 ℃烘干至恒重，備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 株高和干重。隨機選取20株水稻，測量其株高與地上部干重，然后取其平均值，設(shè)置3次重復。

1.3.2 葉片葉綠素含量。將水稻劍葉、第2片、第3片、第4片避開主脈剪碎成寬度約2 mm細條?；靹蚝蠓Q取0.1 g葉片樣品浸入95%乙醇中避光浸提，24 h后將浸提液搖勻過濾，分別于663和645 nm測定吸光度。參照李麗娜等［13］的方法計算葉綠素含量。

1.3.3 葉片脯氨酸含量。準確稱取劍葉樣品0.2 g，加入5 mL濃度為3%的磺基水楊酸充分研磨，密封沸水中浸提15 min。過濾后取濾液作為待測液，在待測液中依次加入1.5 mL雙蒸水、2 mL冰醋酸、2 mL茚三酮，搖勻后沸水浴30 min，冷卻后加入5 mL甲苯黑暗中萃取2 h，測定520 nm吸光度。同時配制濃度分別為20、40、60、80、100 μmol/L的脯氨酸標準溶液，采用與上述待測液相同的方法測定。根據(jù)脯氨酸標準溶液測定結(jié)果制作標準曲線，用于計算待測液中的脯氨酸含量。

1.3.4 葉片還原糖含量。準確稱取劍葉樣品0.5 g于10 mL離心管，加入80%乙醇溶液，80 ℃水浴攪拌加熱浸提30 min，取出冷卻至室溫后3 940 r/min離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中稀釋定容，吸取0.2 mL稀釋液，沸水中蒸干，加入蒸餾水10 mL，充分攪拌溶解，3 940 r/min離心10 min，取2 mL上清液，加入 3，5-二硝基水楊酸試劑2 mL ，顯色后測定波長540 nm吸光度，計算還原糖含量。

1.3.5 稻米粒長、粒寬。隨機選取40粒稻米，將其橫向或豎向依次擺放，緊密相連不留間隙，分別測量排列后的稻米長度，取其平均值，重復3次。

1.3.6 稻米穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重。隨機選取稻米20穗，對每穗的稻米數(shù)量進行計數(shù)，計算平均穗粒數(shù)；將飽滿的和空殼的稻米分開計數(shù)，計算結(jié)實率；數(shù)取飽滿稻米1 000粒進行稱重，計算千粒重。

1.3.7 稻米黏稠度。參照米質(zhì)檢測方法NY 147—88測定稻米黏稠度。將稻米脫殼后，粉碎成米粉， 0.15 mm孔徑過篩，稱取米粉樣品0.1 g置于試管內(nèi)，加入0.2 mL百里酚藍指示劑，振蕩使樣品分散濕潤；加入0.2 mL濃度為0.2 mol/L的氫氧化鉀溶液，振蕩混勻，沸水浴；用玻璃球蓋住試管糊化20 min，室溫25 ℃下水平放置，1 h后測量管底至冷膠前沿長度，即為稻米黏稠度。

1.3.8 稻米直鏈淀粉含量。參照GB 7648—1987測定直鏈淀粉含量。取粉碎過篩后的米粉2 g置于100 mL容量瓶中，加入1.0 mL 95%乙醇，晃勻使米粉充分浸潤，加入9 mL氫氧化鈉溶液（1 mmol/L），沸水浴10 min。取冷卻后樣品5 mL，加入1.0 mL濃度為1 mol/L的乙酸溶液使樣品酸化后，加入1.5 mL碘液，充分搖勻，靜置20 min后測定620 nm吸光度。同時配制直鏈淀粉含量分別為0、10%、30%、60%、90%的標準溶液，采取上述同樣步驟測定620 nm吸光度。根據(jù)測定結(jié)果制作標準曲線，用于計算樣品中直鏈淀粉含量。

1.3.9 稻米蛋白含量。準確稱取稻米粉0.5 g，放入研缽中，加入0.1 mmol/L的NaOH溶液6 mL，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中用攪拌，放置30 min，放置過程間斷攪動數(shù)次。3 940 r/min離心15 min，取上清液用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，獲得堿溶性蛋白。取上述離心后的沉淀用70%乙醇重復提取，操作步驟同上，獲得醇溶性蛋白。吸取提取液0.1 mL，放入10 mL刻度試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G250，混勻，放置2 min，測定595 nm吸光度。同時配制20、40、60、80、100 g/mL的牛血清白蛋白標準溶液，采取上述同樣步驟測定595 nm吸光度。根據(jù)測定結(jié)果制作標準曲線，用于計算樣品中蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 每個結(jié)果采用3次重復的平均值±標準差表示。采用SPSS 14.0對各處理間進行標準差和單因素方差分析 （ANOVA）。結(jié)合單因素方差分析和F檢驗的結(jié)果，來判定2個特定處理之間在P<0.05或P<0.01水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 麝香草酚對鹽土中水稻生長和葉片生理狀態(tài)的影響 在鹽土稻田中，葉面噴施麝香草酚能夠提高水稻劍葉和第2葉中的葉綠素含量；劍葉和第2葉中的葉綠素含量分別比對照顯著提高了38.6%和24.8%，第3葉和第4葉中的葉綠素含量與對照相比無顯著變化（圖1）。與對照組相比，葉面噴施麝香草酚對水稻株高和地上部干重無顯著影響； 噴施麝香草酚后，水稻劍葉還原糖含量比對照顯著增加了97.4%，脯氨酸含量比對照顯著上升了19.4%（表1）。

2.2 麝香草酚對鹽土中水稻結(jié)實的影響 粒長、粒寬決定水稻籽粒的粒性和飽滿度。從表2可以看出，在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚的水稻籽粒寬度比對照顯著增加了9.4%，但粒長無顯著變化，這說明在鹽脅迫條件下，噴施麝香草酚可有效增加水稻籽粒的飽滿度。在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚的水稻穗粒數(shù)比對照顯著升高了11.3%，結(jié)實率無顯著變化，千粒重比對照顯著升高了16.4%，這說明在鹽脅迫條件下，噴施麝香草酚具備提高水稻產(chǎn)量的潛力。

2.3 麝香草酚對水稻品質(zhì)的影響

通過測定稻米黏稠度、直鏈淀粉、堿性蛋白和醇溶蛋白含量，評估稻米品質(zhì)。糊化米膠長度反映稻米黏稠度，米膠長度越短，黏稠度越高。從表3可以看出，在鹽土條件下，噴施麝香草酚的稻米米膠長度比對照顯著下降了18.2%，表明稻米黏稠度顯著提高；噴施麝香草酚的稻米直鏈淀粉含量比對照顯著下降了25.3%；噴施麝香草酚的稻米堿性蛋白含量相比對照無顯著變化，但醇溶蛋白含量比對照顯著提高了100%。這些結(jié)果說明在鹽脅迫條件下，噴施麝香草酚可顯著提高稻米品質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

土壤鹽漬化抑制作物生長、降低產(chǎn)量。在鹽土環(huán)境中確保水稻的安全生產(chǎn)，對于保證我國糧食安全非常重要。該研究發(fā)現(xiàn)，田間噴施天然生物刺激素麝香草酚，可顯著提高鹽土環(huán)境中水稻劍葉的生理狀態(tài)，進而促進水稻結(jié)實；同時可有效提升稻米品質(zhì)。

在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚不影響水稻株高和地上部干重。這可能源于施藥時期偏后，水稻營養(yǎng)生長已基本完成，開始進入生殖生長時期。在生殖生長期，水稻劍葉的生理狀態(tài)（特別是葉綠素含量）是水稻灌漿效率和最終產(chǎn)量的決定性因素之一［14］。鹽脅迫通常會降低植物葉片葉綠素含量并抑制光合作用［15］。噴施麝香草酚可顯著提高鹽土環(huán)境中水稻劍葉的葉綠素含量，這可能與籽粒產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)的提高密切相關(guān)。另外，鹽脅迫通常導致植物產(chǎn)生滲透脅迫，累積脯氨酸和還原性糖是植物應對調(diào)節(jié)滲透脅迫的重要方式之一［16-17］。因此，水稻劍葉中脯氨酸和還原性糖含量升高亦是麝香草酚提升水稻耐鹽性的重要作用方式。

在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚可顯著提高水稻穗粒數(shù)，籽粒更加飽滿，最終導致千粒重顯著增加。這說明在鹽土環(huán)境條件下，麝香草酚具備提高水稻產(chǎn)量的巨大潛力。激活“源-流-庫”活性是水稻高效灌漿的前提，而灌漿效率直接決定了水稻籽粒發(fā)育和產(chǎn)量［18］。劍葉作為營養(yǎng)物質(zhì)重要的源頭之一，其生理狀態(tài)在增加穗粒數(shù)和籽粒大小方面發(fā)揮重要作用［19］。有研究表明，提升水稻劍葉生理活性能夠有效減緩鹽脅迫條件下水稻產(chǎn)量損失［20］。在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚能夠顯著提高劍葉的葉綠素含量，進而可能提升光合性能，合成更多營養(yǎng)物質(zhì)（包括該研究中含量上升的還原性糖），通過灌漿作用促進水稻籽粒發(fā)育。

植物耐鹽分子機制涉及眾多信號分子，如一氧化氮和鈣信號作為上游信號分子，通過激活脯氨酸和葉綠素合成等下游事件，參與調(diào)控植物耐鹽［21-23］。麝香草酚可通過調(diào)控一氧化氮信號激活水稻耐鎘［24］；在動物細胞中，麝香草酚可作為鈣離子通道TRPA1的激活劑刺激胞內(nèi)鈣信號［25］。該研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚可通過提升劍葉生理狀態(tài)調(diào)控水稻耐鹽，那么一氧化氮和該信號是否參與調(diào)控此生理過程還需要進一步深入研究。

稻米中直鏈淀粉含量越低，口感越軟，黏性越高，蒸煮品質(zhì)相對較好［26］。在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚可顯著提升稻米黏稠度，這可能與直鏈淀粉含量下降有關(guān)。醇溶蛋白是反映大米品質(zhì)的重要指標之一，逆境脅迫會導致稻米中醇溶蛋白含量降低［27］。在鹽土環(huán)境中，噴施麝香草酚可顯著提升稻米中醇溶蛋白含量，這說明在鹽脅迫環(huán)境中，麝香草酚可以維持稻米品質(zhì)。稻米品質(zhì)涉及眾多關(guān)于籽粒中淀粉和蛋白合成的調(diào)控通路，包括激素信號和營養(yǎng)信號等［28］。后續(xù)進一步挖掘麝香草酚調(diào)控的信號通路，將有利于解析其維持稻米品質(zhì)的作用機制。

綜上所述，田間葉面噴施天然生物刺激素麝香草酚，可有效提高鹽土環(huán)境中水稻的產(chǎn)量性狀和稻米品質(zhì)，這可能與提升水稻劍葉的生理狀態(tài)密切相關(guān)。進一步深度解析其中的作用機理，將有助于揭示麝香草酚在鹽土環(huán)境中激活水稻耐鹽、維持產(chǎn)量和品質(zhì)的潛在分子機制，進而為麝香草酚作為耐鹽調(diào)控劑的田間應用技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻

［1］ 王凱，高波，李紅陽，等.江蘇沿海地區(qū)耕地質(zhì)量研究進展及提升對策：以鹽城沿海地區(qū)為例［J］.大麥與谷類科學，2021，38（2）：44-49.

［2］ VAN ZELM E，ZHANG Y，TESTERINK C.Salt tolerance mechanisms of plants［J］.Annual review of plan biology，2020，71：403-433.

［3］ SADDHE A A，MISHRA A K，KUMAR K.Molecular insights into the role of plant transporters in salt stress response［J］.Physiologia plantarum，2021，173（4）：1481-1494.

［4］ 黎遠東，江海霞，謝麗瓊.植物鹽脅迫適應性機制研究進展［J］.植物遺傳資源學報，2022，23（6）：1585-1593.

［5］ 凌啟鴻.鹽堿地種稻有關(guān)問題的討論［J］.中國稻米，2018，24（4）：1-2.

［6］ 南楠.鹽脅迫對水稻糧食安全影響的研究進展［J］.糧食問題研究，2022（5）：9-11，43.

［7］ 劉淑麗，張瑞，HUSSAIN S，等.外源物質(zhì)對水稻鹽脅迫緩解效應研究進展［J］.中國水稻科學，2023，37（1）：1-15.

［8］ ZHAO S S，ZHANG Q K，LIU M Y，et al.Regulation of plant responses to salt stress［J］.International journal of molecular sciences，2021，22（9）：1-16.

［9］ KOWALCZYK A，PRZYCHODNA M，SOPATA S，et al.Thymol and thyme essential oil-new insights into selected therapeutic Applications［J］.Molecules，2020，25（18）：1-17.

［10］ REDONDO-BLANCO S，F(xiàn)ERNNDEZ J，LPEZ-IBEZ S，et al.Plant phytochemicals in food preservation：Antifungal bioactivity：A review［J］.Journal of food protection，2020，83（1）：163-171.

［11］ 李敏，薛延豐，石志琦.5%百里香酚水乳劑配方的篩選［J］.江西農(nóng)業(yè)學報，2015，27（7）：80-83.

［12］ CHENG Y W，KONG X W，WANG N，et al.Thymol confers tolerance to salt stress by activating anti-oxidative defense and modulating Na+ homeostasis in rice root［J］.Ecotoxicology and environmental safety，2020，188：1-8.

［13］ 李麗娜，石志琦，高弢，等.肉桂醛對增強辣椒疫霉病抗性的作用機制研究［J］.西北植物學報，2016，36（1）：100-105.

［14］ RAHMAN M A，HAQUE M E，SIKDAR B，et al.Correlation analysis of flag leaf with yield in several rice cultivars［J］.Journal of life and earth science，2013，8：49-54.

［15］ ZAHRA N，AL HINAI M S，HAFEEZ M B，et al.Regulation of photosynthesis under salt stress and associated tolerance mechanisms［J］.Plant physiology and biochemistry，2022，178：55-69.

［16］ EL MOUKHTARI A，CABASSA-HOURTON C，F(xiàn)ARISSI M，et al.How does proline treatment promote salt stress tolerance during crop plant development？［J］.Frontiers in plant science，2020，11：1-16.

［17］ BISWAL A K，KOHLI A.Cereal flag leaf adaptations for grain yield under drought：Knowledge status and gaps［J］.Molecular breeding，2013，31（4）：749-766.

［18］ MA B，ZHANG L，HE Z H.Understanding the regulation of cereal grain filling：The way forward［J］.Journal of integrative plant biology，2023，65（2）：526-547.

［19］ CHANG T G，ZHU X G.Source-sink interaction：A century old concept under the light of modern molecular systems biology［J］.Journal of experimental botany，2017，68（16）：4417-4431.

［20］ TISARUM R，THEERAWITAYA C，SAMPHUMPHUANG T，et al.Alleviation of salt stress in upland rice （Oryza sativa L.ssp.indica cv.Leum Pua） using arbuscular mycorrhizal fungi inoculation［J］.Frontiers in plant science，2020，11：1-15.

［21］ SHANG J X，LI X，LI C，et al.The role of nitric oxide in plant responses to salt stress［J］.International journal of molecular sciences，2022，23（11）：1-19.

［22］ QI N，WANG N，HOU X，et al.Involvement of calcium and calmodulin in NO-alleviated salt stress in tomato seedlings［J］.Plants，2022，11（19）：1-14.

［23］ SHAHID M A，SARKHOSH A，KHAN N，et al.Insights into the physiological and biochemical impacts of salt stress on plant growth and development［J］.Agronomy，2020，10（7）：1-34.

［24］ WANG T T，SHI Z Q，HU L B，et al.Thymol ameliorates cadmium-induced phytotoxicity in the root of rice （Oryza sativa） seedling by decreasing endogenous nitric oxide generation［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2017，65（34）：7396-7405.

［25］ LEE S P，BUBER M T，YANG Q，et al.Thymol and related alkyl phenols activate the hTRPA1 channel［J］.British journal of pharmacology，2008，153（8）：1739-1749.

［26］ HUANG L C，GU Z W，CHEN Z Z，et al.Improving rice eating and cooking quality by coordinated expression of the major starch synthesis-related genes，SSII and Wx，in endosperm［J］.Plant molecular biology，2021，106（4）：419-432.

［27］ HE W，WANG L，LIN Q L，et al.Rice seed storage proteins：Biosynthetic pathways and the effects of environmental factors［J］.Journal of integrative plant biology，2021，63（12）：1999-2019.

［28］ BUTARDO V M，SREENIVASULU N，JULIANO B O.Improving rice grain quality：State-of-the-art and future prospects［J］.Methods in molecular biology，2019，1892：19-55.