線粒體DNA含量及10398位點在健康及宮頸癌人群中的分析

[摘要]目的探討血清中線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）含量和10398位點突變情況檢測的臨床意義。方法收集2020年1月至12月在宜昌市第二人民醫(yī)院體檢的314名健康女性納入健康體檢組，同時收集2020年1月至2023年12月在宜昌市第二人民醫(yī)院就診的82例宮頸癌患者納入宮頸癌組。檢測兩組納入者的血清樣本mtDNA含量及10398位點基因型，并比較兩組納入者的指標差異。結果宮頸癌組患者的mtDNA含量高于健康體檢組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組納入者在10398位點基因型差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。健康體檢組中≥45歲的女性mtDNA含量更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；mtDNA在不同10398位點的分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。宮頸癌組中≥45歲的患者mtDNA含量更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同臨床分期、不同病理類型患者的mtDNA含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），mtDNA在不同10398位點中的含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論mtDNA含量檢測對健康體檢人群與宮頸癌人群均有一定的意義，兩組納入者的mtDNA含量均與年齡相關，均隨著年齡增長而升高；宮頸癌患者的mtDNA含量明顯高于健康體檢者；10398位點的血清mtDNA含量檢測對兩組人群的意義不大；宮頸癌人群的mtDNA含量及10398位點分布與病理、臨床分期均無關。mtDNA含量檢測可考慮作為宮頸癌診斷的血清標志物。

[關鍵詞]線粒體DNA；10398位點突變；宮頸癌；健康人群

[中圖分類號]R733[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.019

AnalysisofmitochondrialDNAcontentandsite10398inhealthyandcervicalcancerpopulations

FENGDali1，ZHANGLijin2，HUANGHuazhong1

1.DepartmentofOncology，theSecondPeople’sHospitalAffiliatedtoChinaThreeGorgesUniversity，YichangSecondPeople’sHospital，Yichang443000，Hubei，China;2.DepartmentofPharmacy，TraditionalChineseMedicineHospitalofChinaThreeGorgesUniversity，YichangCityHospitalofTraditionalChineseMedicine，Yichang443000，Hubei，China

[Abstract]ObjectiveToexploretheclinicalsignificanceofdetectingmitochondrialDNA（mtDNA）contentand10398sitemutationinserum.MethodsAtatolof314healthywomenwhounderwentphysicalexaminationsattheYichangSecondPeople’sHospitalwerecollectedfromJanuarytoDecember2020ashealthexaminationgroup，andcollect82cervicalcancerpatientswhoreceivedmedicaltreatmentattheSecondPeople’sHospitalofYichangCityfromJanuary2020toDecember2023ascervicalcancergroup.DetectthemtDNAcontentand10398locusgenotypeofserumsamplesfromtwogroupsofparticipants，andcomparethedifferencesinindicatorsbetweentwogroupsofparticipants.ResultsThemtDNAcontentofcervicalcancerpatientswassignificantlyhigherthanthatofhealthyexaminationgroup（P<0.05）;Therewasnostatisticallysignificantdifferenceingenotypeatlocus10398betweentwogroupsofparticipants（P>0.05）.ThemtDNAcontentofwomenaged≥45inhealthexaminationgroupwashigher，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）;TherewasnostatisticallysignificantdifferenceinthedistributionofmtDNAatdifferent10398loci（P>0.05）.Patientsaged≥45incervicalcancergrouphavehighermtDNAcontent，andthedifferenceisstatisticallysignificant（P<0.05）;TherewasnostatisticallysignificantdifferenceinmtDNAcontentamongpatientswithdifferentclinicalstagesandpathologicaltypes（P>0.05），andtherewasnostatisticallysignificantdifferenceinmtDNAcontentatdifferent10398loci（P>0.05）.ConclusionThedetectionofmtDNAcontenthascertainsignificanceforbothhealthyphysicalexaminationpopulationandcervicalcancerpopulation.ThemtDNAcontentinbothgroupsisrelatedtoageandincreaseswithage.ThemtDNAcontentincervicalcancerpopulationissignificantlyhigherthanthatinnormalphysicalexaminationpopulation.ThedetectionofmtDNAat10398siteinserumhaslittlesignificanceforbothgroups.ThemtDNAcontentand10398sitedistributionincervicalcancerpopulationarenotrelatedtopathologyandstage.ThedetectionofmtDNAcontentcanbeconsideredasaserumbiomarkerforthediagnosisofcervicalcancer.

[Keywords]MitochondrialDNA，Themutationofsite10398，Cervicalcancer，Healthypeople

線粒體是人類細胞中除細胞核外唯一具有自身DNA——線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）的細胞器，其對真核細胞的能量代謝至關重要。相對于核DNA，mtDNA具有較大的不穩(wěn)定性，其與細胞老化和相關疾病的發(fā)生密切相關[1]。大量的研究顯示mtDNA突變與人類腫瘤相關[2-4]。既往關于健康人群中mtDNA含量與10398位點突變的相關研究及健康人群與癌癥患者的對照研究較少。本研究旨在分析健康人群與宮頸癌患者的mtDNA含量與10398位點突變情況，以期為后續(xù)研究提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2020年1月至12月在宜昌市第二人民醫(yī)院體檢的314名健康女性納入健康體檢組。納入標準：①年齡20～65歲；②無重大基礎疾病，無腫瘤性疾病史及腫瘤性疾病家族史者；③自愿參與本研究并愿意提供研究所需血液標本。收集納入者的姓名、性別、年齡、電話、住址等基本信息。

收集2020年1月至2023年12月在宜昌市第二人民醫(yī)院就診的82例宮頸癌患者納入宮頸癌組。納入標準：①年齡20～75歲；②無除宮頸癌外的其他腫瘤及重大基礎疾病史及腫瘤性疾病家族史者；③經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌（鱗狀細胞或腺癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期）；④自愿參與本研究并愿意提供研究所需血液標本。排除標準：①年齡<20歲或>75歲者；②有其他慢性疾病史者；③不能配合本研究者。收集患者的姓名、性別、年齡、臨床分期、病理結果等信息。本研究患者均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)宜昌市第二人民醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：202414）。

1.2標本收集

抽取納入者的靜脈血1～2ml置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝管內(nèi)，立即提取靜脈血基因組DNA（采用北京TIGEN公司基因組DNA提取試劑盒），不能及時提取時將血標本置于冰箱內(nèi)冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3mtDNA含量及10398位點基因型檢測

采用聚合酶鏈反應-限制性片段多態(tài)性方法（polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）檢測mtDNA10398位點的基因型，酶切（采用美國NewEnglandBiolabs公司限制性內(nèi)切酶）完畢后進行瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定目的位點的基因型：10398位點的基因型為A攜帶者或G攜帶者。本研究采用實時定量PCR方法（試劑盒購自日本TaKaRa公司）檢測mtDNA含量。以單拷貝基因β2M基因作為參考，每次反應檢測48個樣本的目的基因及內(nèi)參后讀取每個反應樣本的Ct值，計算mtDNA拷貝數(shù)，計算mtDNA含量[4-5]。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示。計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用方差檢驗或非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組納入者的一般資料比較

健康體檢組納入者年齡25～65歲，平均（48.29±8.60）歲，中位年齡48歲；宮頸癌組患者年齡24～75歲，平均（57.53±9.98）歲，中位年齡46歲，臨床分期以Ⅰ期、Ⅱ期居多，Ⅲ期較少，病理類型以鱗狀細胞癌為主，見表1。

2.2兩組納入者的mtDNA含量及10398位點基因型比較

宮頸癌組患者的mtDNA含量高于健康體檢組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組納入者在10398位點基因型差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3兩組不同特征納入者的mtDNA含量及10398位點基因型比較

健康體檢組不同年齡納入者的mtDNA含量存在差異，≥45歲女性mtDNA含量更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但mtDNA在不同10398位點基因型分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

宮頸癌組不同年齡患者的mtDNA含量存在差異，≥45歲患者的mtDNA含量更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同臨床分期、不同病理類型患者的mtDNA含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），mtDNA在不同10398位點基因型中的含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4。

3討論

mtDNA的不穩(wěn)定性可能導致細胞老化，與相關疾病的驅(qū)動因素相關[1]。在人類多種實體腫瘤中檢測到mtDNA編碼區(qū)及調(diào)控區(qū)體細胞的突變[6-8]。這些突變提示mtDNA突變的積累可能是引起線粒體功能持久性缺陷并最終導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的原因之一，多項研究表明mtDNA含量的變化具有一定的腫瘤特異性[2-5，9]。

本研究發(fā)現(xiàn)健康人群中年齡≥45歲者的mtDNA含量較高，與相關研究結果一致[4-5]。但也有研究顯示年齡≥45歲者的mtDNA含量偏低[10]。本研究顯示mtDNA含量在宮頸癌與健康人群中均表現(xiàn)為隨年齡增長而升高的趨勢，且在宮頸癌患者中差異更顯著。宮頸癌患者的mtDNA含量高于健康者，但mtDNA含量與臨床分期、病理類型及10398位點分布均無關，與以往研究結果一致[4-5，11]。李夢穎等[12]和梁轉霞等[13]的研究顯示外周血mtDNA拷貝數(shù)過高或過低均可增加肝癌的發(fā)生風險；血漿游離mtDNA拷貝數(shù)有助于診斷急性胰腺炎；急性胰腺炎患者的mtDNA拷貝數(shù)升高也可作為預測病情嚴重程度及判斷預后的標志物。

mtDNA含量變異的機制較多，可能與缺氧、遺傳、類固醇激素刺激等多種內(nèi)外因素相關。有研究顯示乳腺癌、尤文肉瘤等實體瘤中的mtDNA含量顯著下降與H鏈復制起始位點的突變和（或）D環(huán)區(qū)D310有顯著相關性。因這些序列均參與mtDNA合成所需的RNA/DNA復合體的形成，影響mtDNA轉錄、復制的效率，從而導致腫瘤細胞中mtDNA含量降低[14-16]。另外，p53途徑缺陷也易導致mtDNA含量降低，p53缺失可增加mtDNA對氧化損傷的敏感度，擾亂線粒體活性氧的穩(wěn)態(tài)，從而引起mtDNA含量降低[17]。卵巢癌相關研究顯示琥珀酸脫氫酶B亞基通過p38MAPK通路影響DNA損傷修復導致mtDNA相對拷貝數(shù)降低[18]。

影響10398位點突變的機制多且尚不明確。本研究提示10398位點分布與年齡無相關性，在健康人群與宮頸癌人群中差異不顯著，且10398位點分布在宮頸癌人群中與病理、臨床分期均不相關，這與之前的研究結果相似[5]。研究表明10398位點的基因型G被A替換，可導致丙氨酸替代蘇氨酸，引起呼吸傳遞鏈中復合體Ⅰ功能的變化，進一步導致細胞凋亡傳遞鏈上信號蛋白功能障礙，導致正常細胞凋亡，而腫瘤細胞因受誘導保護存活，即10398位點基因型G突變?yōu)锳可導致腫瘤細胞出現(xiàn)相對更強的抗凋亡能力，腫瘤細胞更易存活[19]。有研究假設細胞損傷過程是由于復合體Ⅰ的損傷，導致活性氧簇產(chǎn)生增加，而活性氧簇增多可引起不同細胞成分的損傷，進一步引起細胞死亡[20]。探索肺癌10398位點突變對腫瘤發(fā)生、發(fā)展影響的研究顯示位點突變阻礙細胞抗凋亡并影響細胞質(zhì)中鈣信號的傳遞[21]。

結合已有研究[3，22]，可推論mtDNA的含量隨年齡增長而增加，mtDNA含量變化及質(zhì)變（位點的缺失、突變等）均可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且量變和質(zhì)變也會相互影響，具體作用機制還有待進一步探索、驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] LIH，SLONEJ，F(xiàn)EIL，etal.MitochondrialDNAvariantsandcommondiseases：Amathematicalmodelforthediversityofage-relatedmtDNAmutations[J].Cells，2019，8（6）：608.

[2] HSUC，TSENLM，LEE&nbsp;H.Roleofmitochondrialdysfunctionincancerprogression[J].ExpBiolMed（May-wood），2016，241（12）：1281–1295.

[3] TANAKAT，KOBUNAIT，YAMAOTOY，etal.IncreasedcopynumbervariationofmtDNAinanarray-baseddigitalPCRassaypredictsulcerativecolitis-associatedcolorectalcancer[J].InVivo，2017，31（4）：713–718.

[4] 豐大利.線粒體DNA含量、10398位點突變及HPV感染狀態(tài)對宮頸癌病理、分期及預后的影響研究[D].武漢：武漢大學，2017.

[5] 江換鋼.基因多態(tài)性及線粒體DNA變化與乳腺癌易感性關系的分子流行病學研究[D].武漢：武漢大學，2014.

[6] 熱孜婉古麗·吾布力，王琳，瑪依努爾·尼牙孜.卵巢惡性腫瘤患者血漿游離線粒體DNA的定量分析及臨床意義[J].中國腫瘤臨床與康復，2018，25（5）：550–552.

[7] PUSTYLNIKOVS，COSTABILEF，BEGHIS，etal.Targetingmitochondriaincancer：Currentconceptsandimmunotherapyapproaches[J].TranslRes，2018，202：35–51.

[8] O’HARAR，TEDONEE，LUDLOWA，etal.QuantitativemitochondrialDNAcopynumberdeterminationusingdropletdigitalPCRwithsingle-cellresolution[J].GenomeRes，2019，29（11）：1878–1888.

[9] GUERRAF，ARBINIA，MOROL.Mitochondriaandcancerchemoresistance[J].BiochimBiophysActaBioenerg，2017，1858（8）：686–699.

[10] CREEL，&nbsp;PATLS，PYLEA，etal.Age-relateddeclineinmitochondrialDNAcopynumberinisolatedhumanpancreaticislets[J].Diabetologia，2008，51（8）：1440–1443.

[11] 豐大利，尹宜發(fā)，章婷婷，等.122例宮頸癌患者線粒體DNA含量及10398位點突變情況分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2020，28（20）：3583–3588.

[12] 李夢穎，馮越，管鑫，等.外周血線粒體DNA拷貝數(shù)與肝癌發(fā)病風險的病例隊列研究[J].中華預防醫(yī)學雜志，2022，56（9）：1289–1294.

[13] 梁轉霞，楊澤華.急性胰腺炎患者血漿游離線粒體DNA水平變化及臨床意義[J].中國急救醫(yī)學，2020，40（10）：966–971.

[14] MAMBOE，CHATTERJEEA，XINGM，etal.Tumor-specificchangesinmtDNAcontentinhumancancer[J].IntJCancer，2005，116（6）：920–924.

[15] MIZUMACHIT，MUSKHELISHVILIL，NaitoA，etal.IncreaseddistributionalvarianceofmitochondrialDNAcontentassociatedwithprostatecancercellsascomparedwithnormalprostatecells[J].Prostate，2008，68（4）：408–417.

[16] CHOIS，KIMS，KANGH，etal.Mutationalhotspotsinthemitochondrialgenomeoflungcancer[J].BiochemBiophysResCommun，2011，407（1）：23–27.

[17] LEBEDEVAM，EATONJ，ShadelG.Lossofp53causesmitochondrialDNAdepletionandalteredmitochondrialreactiveoxygenspecieshomeostasis[J].BiochimBiophysActa，2009，1787（5）：328–334.

[18] 陳立蘭，狄文.琥珀酸脫氫酶B亞基對卵巢癌細胞線粒體DNA拷貝數(shù)影響的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2022，31（3）：161–165.

[19] TENGKUBAHARUDINN，JAAFARH，ZAINUDDINZ.AssociationofmitochondrialDNA10398polymorphismininvasivebreastcancerinMalaypopulationofPeninsularMalaysia[J].MalaysJMedSci，2012，19（1）：36–42.

[20] CHOMOVAM，RACAYP.MitochondrialcomplexⅠinthenetworkofknownandunknownfacts[J].GenPhysiolBiophys，2010，29（1）：3–11.

[21] XUH，HEW，JIANGHG，etal.PrognosticvalueofmitochondrialDNAcontentandG10398Apolymorphisminnon-smallcelllungcancer[J].OncolRep，2013，30（6）：3006–3012.

[22] 豐大利，周福祥.線粒體DNA突變在宮頸癌中的研究探討[J].腫瘤代謝與營養(yǎng)電子雜志，2018，5（1）：88–91.

（收稿日期：2024–01–16）

（修回日期：2024–07–11）