FBXW12在胰腺癌組織中的表達及其對胰腺癌細胞侵襲和遷移的影響

[摘要]目的探討FBXW12在胰腺癌組織中的表達及其對胰腺癌細胞侵襲和遷移的影響。方法采用GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析FBXW12在胰腺癌組織及癌旁正常組織中的表達差異；收集2016年6月至2022年12月于臨沂市人民醫(yī)院行根治術治療的31例胰腺癌患者的臨床資料，對術中切除的癌組織及癌旁正常組織行免疫組化染色檢測FBXW12的表達，并隨訪患者的生存預后情況。利用蛋白質印跡（Westernblot）與聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）研究胰腺癌細胞株內(nèi)FBXW12蛋白的表達，并借助Transwell細胞侵襲試驗及劃痕試驗評估FBXW12對胰腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響。結果在癌旁正常組織中的FBXW12mRNA表達水平顯著高于胰腺癌組織（P<0.05）；胰腺癌組織的FBXW12蛋白陽性表達率為75.19%（23/31），癌旁正常組織的FBXW12蛋白陽性表達率為93.55%（29/31），F(xiàn)BXW12在胰腺癌及癌旁正常組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且胰腺癌中FBXW12表達量與淋巴結轉移密切相關（P<0.05），F(xiàn)BXW12低表達組患者預后更差（P<0.05）；應用FBXW12過表達質粒轉染后，胰腺癌細胞的侵襲和遷移能力均出現(xiàn)顯著下降。結論FBXW12在胰腺癌中低表達且與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關。

[關鍵詞]FBXW12；胰腺癌；預后；侵襲；遷移

[中圖分類號]R576[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.018

ExpressionofFBXW12inpancreaticcancertissuesanditseffectontheinvasionandmigrationofpancreaticcancercells

ZHANGJinming1，2，XIEYongfeng1，NIEJiao2，LULin2，DUChao2

1.GraduateTrainingBaseofLinyiPeople’sHospital，JinzhouMedicalUniversity，Linyi276000，Shandong，China;2.DepartmentofGastroenterology，LinyiPeople’sHospital，Linyi276000，Shandong，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionofFBXW12inpancreaticcancerandelucidateitsimpactoncancercellmigrationandinvasion.MethodsThepresentstudyutilizedtheGEPIA2databasetoanalyzethedifferentialexpressionofFBXW12betweenpancreaticcancertissuesandnormaltissues.Clinicaldatafrom31pancreaticcancerpatientswhounderwentradicalresectionatLinyiPeople’sHospitalfromJune2016toDecember2022werecollected.ImmunohistochemicalstainingwasconductedtoassessFBXW12expressioninbothcancerousandadjacentnormaltissuesobtainedduringsurgery，withsubsequentfollow-upforsurvivalprognosis.Westernblotandpolymerasechainreaction（PCR）techniqueswereemployedtodetermineFBXW12proteinexpressionlevelsinpancreaticcancercelllines.TheimpactofFBXW12oncancercellinvasionandmigrationwasevaluatedusingTranswellcellinvasionandscratchtest.ResultsTheresultsfromtheanalysisoftheGEPIA2databaserevealedasignificantdownregulationofFBXW12mRNAexpressioninpancreaticcancertissuescomparedtonormalpancreatictissues（P<0.05）.ImmunohistochemicalanalysisdemonstratedapositiveexpressionrateofFBXW12proteininpancreaticcancertissuesat75.19%（23/31），whereasadjacentnormaltissuesexhibitedahigherpositiveexpressionrateat93.55%（29/31），indicatingastatisticallysignificantdifferenceinFBXW12expressionbetweenpancreaticcancerandadjacentnormaltissues（P<0.05）.Additionally，theexpressionlevelofFBXW12inpancreaticcancertissueswasfoundtobecloselyassociatedwithlymphnodemetastasis（P<0.05），patientswithlowexpressionofFBXW12haveaworseprognosis（P<0.05）.Furthermore，transfectionwithFBXW12overexpressionplasmidresultedinasignificantdecreaseintheinvasionandmigrationabilitiesofpancreaticcancercells.ConclusionFBXW12islowexpressedinpancreaticcancerandisassociatedwiththeoccurrenceanddevelopmentofpancreaticcancer.

[Keywords]FBXW12;Pancreaticcancer;Prognosis;Cellinvasion;Migration

胰腺癌是人類最致命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，在惡性腫瘤中死亡率排名第3位，具有診斷難度大、預后差、病死率高的特點[1-3]。胰腺癌的分子作用機制較復雜，通常涉及多個基因，泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）參與癌癥的進展并控制許多腫瘤抑制因子和癌基因的降解，維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)適應新的環(huán)境，防止外界持續(xù)性的損害[4-5]。泛素化是由3個組分酶組成的級聯(lián)調(diào)控的關鍵翻譯后修飾，是一種重要的通過選擇性自噬實現(xiàn)底物特異性的方式。實現(xiàn)泛素化反應所需的3種酶為泛素活化酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3。在參與降解過程中，F(xiàn)BXW家族是E3連接酶的重要組成部分。既往研究表明FBXW家族基因在調(diào)節(jié)參與細胞周期和腫瘤發(fā)生的蛋白質中發(fā)揮關鍵作用，并有助于判斷治療效果和疾病預后。FBXW家族表達的高低與多種癌癥的預后相關，尤其是FBXW4、FBXW5、FBXW7、FBXW9、FBXW10[6]；但對FBXW12的研究較少，F(xiàn)BXW12作為FBXW蛋白家族的一員，參與細胞內(nèi)泛素化降解、轉錄調(diào)控、信號轉導、細胞周期調(diào)控和細胞凋亡等多種生物活動，是一種抑癌基因[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的FBXW12表達明顯降低，可能與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展有關，但在消化系統(tǒng)癌癥中的表達及意義尚無研究報道[8]。鑒于此，本研究探討FBXW12在胰腺癌組織和細胞中的表達及對細胞功能的影響，并分析其與患者臨床參數(shù)和生存預后的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年6月至2022年12月于臨沂市人民醫(yī)院行根治術治療的31例胰腺癌患者的臨床資料進行回顧性分析。其中男17例，女14例；年齡46～74歲，平均（60.62±8.18）歲。患者在接受手術治療時均取標本用于病理學檢查，并最終確診為胰腺癌。納入標準：①經(jīng)病理學檢查明確診斷為胰腺癌；②臨床、病歷資料完整；③術前無放化療或其他輔助治療。排除標準：①合并其他部位原發(fā)性腫瘤患者；②腫瘤復發(fā)患者；③伴有嚴重心、肺功能衰竭患者?；颊呔橥獠⒑炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：YX200709）。

1.2GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析

在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中設定以下條件以研究FBXW12基因在胰腺癌組織與正常胰腺組織中的表達差異：“gene：FBXW12”“expressiondiy：boxplot”“cancertype：PAAD”。

1.3免疫組化檢測FBXW12蛋白表達情況

實驗標本取胰腺癌組織與癌旁正常組織，所有標本均采用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法，按試劑盒說明書進行操作，兔抗人FBXW12抗體購自美國LSBio公司，工作濃度1：50，山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulinG，IgG）二抗購自杭州華安生物技術有限公司，工作濃度1∶100。之后進行閱片，將胞核或胞質中出現(xiàn)淺黃色、黃色或棕褐色顆粒的細胞定為FBXW12表達陽性。根據(jù)FBXW12陽性細胞比例評分和染色強度評分進行分析：陽性細胞比例≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；無染色、淺黃色、黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分；陽性細胞比例與染色強度得分相乘，積分≥4分為高表達，<4分為低表達[9]。根據(jù)FBXW12表達水平將31例胰腺癌組織及癌旁正常組織分為高表達組和低表達組。

1.4蛋白質印跡檢測FBXW12蛋白的表達

根據(jù)蛋白提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）說明提取細胞蛋白，并用二喹啉甲酸試劑盒酶標儀檢測濃度。在十二烷基磺酸鈉凝膠（濃縮膠4%，分離膠10%）上常規(guī)電泳等量的蛋白質，后轉聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（購自Millipore公司）2h，5%脫脂牛奶封閉并用Tris緩沖液-氯化鈉-Tween-20（Tris-bufferedsaline-Tween-20，TBST）清洗后加入FBXW12一抗抗體（1∶1000；購自LSBio公司）。放置4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入抗兔酶標記二抗（1∶5000；購自Huabio公司），搖床孵育1.5h，TBST洗膜3次，10min/次，采用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒于PVDF膜上進行化學發(fā)光顯影，最后計算FBXW12蛋白表達水平。

1.5細胞培養(yǎng)及轉染

采用DMEN培養(yǎng)基培養(yǎng)胰腺癌細胞PANC-1、BxPC-3和SW1990，F(xiàn)BXW12過表達質粒pcDNA-FBXW12和pcDNA陰性對照（pcDNA-NC），用于轉染PANC-1和SW1990細胞。轉染48h后收集細胞用于下一步實驗。

1.6實時定量聚合酶鏈反應鑒定FBXW12mRNA表達

根據(jù)操作指南，首先使用FastPure試劑盒（購自Vazyme公司）從樣本中提取RNA；隨后采用EvoM-MLVRTPremix反轉錄試劑盒（購自AccurateBiotechnology公司）將RNA反轉錄為cDNA；最后利用SYBRGreenPremixProTapHSqPCR（購自AccurateBiotechnology公司）進行實時定量聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR），測定目標mRNA水平。使用引物：FBXW12正向：5'-ATGGAGATCCGATTGCCTGA-3'，反向：5'-GCAGAAGATGATGCAAGGTCA-3'；GAPDH正向：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.7Transwell侵襲試驗

將100μl（1×106個）PANC-1細胞懸浮于預先涂有基質膠（購自Corning公司）的上室中，含有10%磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）的700μlDMEM培養(yǎng)基加至下室中。在37°C條件下孵育4h后，將腔室取出，并利用棉簽清除膜表面殘留的細胞。使用4%多聚甲醛固定侵入膜下表面的細胞，并進行0.1%結晶紫染色處理10min。隨后使用PBS洗滌膜并使其干燥，最后使用倒置顯微鏡觀察細胞并進行計數(shù)。

1.8細胞劃痕試驗

將胰腺癌細胞等量接種于6孔板中，待貼壁細胞達90%時，用200μl無菌移液器吸頭劃痕，加入無血清培養(yǎng)基DMEM，培養(yǎng)24h，在獲取24h后的照片后，測量劃痕距離，根據(jù)公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率（%）=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。

1.9統(tǒng)計學方法

采用GraphpadPrism8.4.3和SPSS6.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用c2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t檢驗。Fisher確切概率法檢驗FBXW12高表達組與低表達組在各類病理參數(shù)表達的差異。使用Kaplan-Meier方法分析FBXW12表達對胰腺癌患者生存預后的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1GEPIA2數(shù)據(jù)庫中FBXW12mRNA基因表達變化

GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，胰腺癌組織中的FBXW12mRNA表達量顯著低于其在正常胰腺組織中的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2胰腺癌及癌旁正常組織中的FBXW12表達

為高表達組和低表達組，在31例胰腺癌及31例癌旁正常組織中，F(xiàn)BXW12的陽性率分別為74.19%及93.55%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；免疫組化染色結果顯示FBXW12陽性染色主要表現(xiàn)在細胞質中，與胰腺癌組織相比，F(xiàn)BXW12在癌旁正常組織中的表達明顯增強，見圖2和圖3。

2.3不同臨床病理特征胰腺癌患者的FBXW12表達水平比較

胰腺癌患者FBXW12的表達與性別、年齡、腫瘤分化程度和臨床分期無顯著相關性（P＞0.05），與淋巴結轉移存在相關性（P<0.05），見表1。

2.4FBXW12表達與胰腺癌患者生存期的關系

截至2023年10月，本研究中12例患者存活，19例死亡。根據(jù)隨訪年數(shù)及是否存活繪制生存曲線，結果顯示FBXW12低表達患者的生存曲線快速下降（P<0.001），提示FBXW12低表達患者生存時間短、預后差，見圖4。

2.5FBXW12在胰腺癌細胞中的表達情況

通過蛋白質印跡（Westernblot）分析3種不同胰腺癌細胞系（BxPC-3、PANC-1和SW1990）中FBXW12的表達，發(fā)現(xiàn)FBXW12在胰腺癌3種細胞株中均表達較低。為進一步分析加強FBXW12作用后對胰腺癌細胞功能的影響，本研究從中任選2株（PANC-1和SW1990），將靶向FBXW12的過表達質粒導入其中，并用PCR驗證過表達效率，見圖5。

2.6FBXW12對癌細胞侵襲和遷移能力的影響

侵襲和遷移是癌癥轉移的標志，可加速腫瘤發(fā)展并降低患者的生存率[10]。為評價FBXW12在胰腺癌細胞侵襲過程中的作用，本研究進行2種細胞的Transwell侵襲試驗，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比過表達FBXW12組侵襲的細胞數(shù)量明顯減少，表現(xiàn)出較低的膜穿透能力。之后，本研究進行劃痕愈合試驗，探討FBXW12對胰腺癌細胞遷移的影響，結果表明相較于0h，24h時對照組橫向遷移距離較過表達FBXW12組明顯縮短。因此，F(xiàn)ABXW12在抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，見圖6。

3討論

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，通?；颊哳A后極差，5年生存率僅11%左右[10]。

早期胰腺癌缺乏特異性臨床表現(xiàn)，導致大多數(shù)患者在就診時已處于中晚期，錯失最佳手術治療時機。值得注意的是，即使在手術后，胰腺癌患者的生存時間也相對其他癌癥患者較短，疾病的致命性極高[11]。腫瘤細胞的一個顯著特征是出現(xiàn)非整倍體遺傳和惡性增殖，人們對識別出在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用的新基因越來越感興趣。隨著分子生物學的快速發(fā)展，基因相關技術為篩選胰腺癌的診治標志物提供便利[12]。因此迫切需要尋求胰腺癌新的有效診治靶點，早發(fā)現(xiàn)、早治療對抑制胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

F-box蛋白家族是多聚體E3泛素連接酶復合物的關鍵識別亞基[13]，根據(jù)C端二級結構的不同可分為FBXW、FBXL、FBXO3個亞類[14]；通常與多個底物蛋白結合進行泛素化和降解，特定E3連接酶的活性和豐度可極大影響細胞生物學，參與腫瘤細胞的代謝和DNA的損傷修復[15]。參與降解的E3連接酶的重要成分包括FBXW家族，該家族有10個成員。尤其是FBXW1和FBXW7已被確定為可能的癌基因，其缺失或突變與多種形式的癌癥有關[16]。FBXW12（含F(xiàn)-box和WD重復結構域12）也稱為FBXO35、FBW12或FBXO12，靶向多種癌蛋白被認為是一種腫瘤抑制基因，并已被證明在控制許多生物過程中至關重要，包括細胞周期、細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡[17]。FBXW12只在卵巢癌中作為抑癌基因被研究，在其他癌癥中未見報道。本課題是首次研究FBXW12在胰腺癌中的作用，也是首次研究其在消化系統(tǒng)腫瘤中的作用。

本研究先通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析FBXW12在胰腺癌中的表達差異，后用免疫組織化學染色檢測出FBXW12定位于細胞質且癌旁正常組織中FBXW12表達水平明顯高于胰腺癌組織，癌中FBXW12表達與淋巴結轉移存在顯著相關性，之后分析FBXW12表達量與胰腺癌患者生存預后的關系，發(fā)現(xiàn)FBXW12高表達的胰腺癌患者的生存時間明顯長于FBXW12低表達患者，將過表達質粒轉入胰腺癌細胞，通過Transwell侵襲試驗和劃痕試驗觀察FBXW12對胰腺癌細胞生物學行為的影響，發(fā)現(xiàn)增強FBXW12作用后，癌細胞的侵襲和遷移能力明顯下降，提示FBXW12可抑制胰腺癌細胞的相關功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box蛋白家族具有促癌或抑癌作用，如FBXW7和FBXW，F(xiàn)BXW9在腫瘤（如浸潤性乳腺癌、結腸腺癌和膀胱尿路上皮癌等）中通常作為上調(diào)基因，與FBXW12作用相反[18]。FBXW7是該家族中典型的抑癌基因，F(xiàn)BXW7在胰腺癌、乳腺癌和血液系統(tǒng)腫瘤中起抑制作用[19]；與本研究的FBXW12基因在胰腺癌中的結果一致，但FBXW7還影響細胞的增殖、凋亡、細胞分化和代謝[20]。本研究僅初步探討FBXW12的作用，后續(xù)將繼續(xù)研究其對胰腺癌細胞增殖、凋亡及相關分子通路的影響機制，以驗證本研究的結果。

綜上所述，F(xiàn)BXW12在胰腺癌中呈低表達且與患者淋巴結轉移和生存預后相關，F(xiàn)BXW12蛋白過表達可顯著抑制胰腺癌細胞的侵襲和遷移進程，提示FBXW12在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，因此，F(xiàn)BXW12或可成為診斷和預測胰腺癌患者預后的重要腫瘤標志物和潛在的治療靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–01–30）

（修回日期：2024–07–12）