噬菌體TM4中LysinB蛋白的特征及抗菌特性研究

[摘要]目的對分枝桿菌噬菌體TM4LysinB蛋白序列進(jìn)行生物學(xué)分析，原核表達(dá)LysinB蛋白并評估其體外殺菌特性。方法合成噬菌體TM4LysinB基因，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)蛋白可溶表達(dá)、純化，通過在線軟件程序分析噬菌體TM4LysinB蛋白的生物學(xué)特征；在7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)恥垢分枝桿菌，檢測其殺菌效果及穩(wěn)定性。結(jié)果LysinB蛋白理論等電點為6.66，不穩(wěn)定指數(shù)為28.71，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，且為兩親性蛋白。二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲、a-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角分別占42.00%、40.25%、12.00%和5.75%；三級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲含量高，由11～73位AA組成的肽段構(gòu)成肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。預(yù)測出B細(xì)胞抗原表位區(qū)段和T細(xì)胞抗原表位的強(qiáng)結(jié)合肽段。LysinB蛋白具有顯著的體外殺恥垢分枝桿菌的能力，pH8.0的PBST蛋白緩沖液有利于在實驗周期內(nèi)維持LysinB蛋白的殺菌效果。結(jié)論進(jìn)一步了解分枝桿菌噬菌體TM4裂解酶LysinB蛋白，為研制可穩(wěn)定貯存的噬菌體酶制劑及其臨床應(yīng)用提供參考。

[關(guān)鍵詞]噬菌體TM4；LysinB蛋白；恥垢分枝桿菌；生物信息學(xué)

[中圖分類號]R378.91[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.002

CharacterizationandantibacterialpropertiesofLysinBproteininbacteriophageTM4

PANZhifen1，ZHOUZiwei2，XUHaiping1，WANGWei1

1.DepartmentofTuberculosis，theFirstHospitalofJiaxing，AffiliatedHospitalofJiaxingUniversity，Jiaxing314001，Zhejiang，China;2.SchoolofLifeSciences，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200438，China

[Abstract]ObjectiveToanalyzethesequenceofLysinBproteininbacteriophageTM4，expressLysinBproteininE.coliandevaluateitsbactericidalactivityinvitro.MethodsBacteriophageTM4LysinBgenewassynthesizedandtherecombinantprokaryoticexpressionplasmidwasconstructed.Thesolubleproteinwasinducedandpurified.ThebiologicalcharacteristicsofbacteriophageTM4LysinBproteinwereanalyzedbyonlinesoftwareprogram.Mycobacteriumsmegmatiswasculturedin7H9medium，anditsbactericidaleffectandstabilityweredetected.ResultsThetheoreticalisoelectricpointwas6.66，theinstabilityindexwas28.71，whichwasastableandamphiphilicprotein.Inthesecondarystructure，Therandomcoil，a-helix，β-foldandturnAngleaccountedfor42.00%，40.25%，12.00%and5.75%;Inthetertiarystructure，thecontentofrandomcoilwashigh.ThepeptidecomposedofAAatpositions11to73constitutedthepeptidoglycanbindingdomain.TheregionsofBcellepitopesandthestrongbindingpeptidesofTcellepitopeswerepredicted.LysinBproteinhasasignificantabilitytokillMycobacteriumsmegmatisinvitro.PBSTproteinbufferwithpH8.0wasbeneficialtomaintainthebactericidaleffectofLysinBproteinsduringtheexperimentalcycle.ConclusionThisstudyexpandsthecomprehensiveunderstandingoftheLysinBproteinofmycobacterialphageTM4lyase，andalsoprovidesreferenceforthedevelopmentofstablestorageofphageenzymepreparationanditsclinicalapplication.

[Keywords]BacteriophageTM4;LysinBprotein;Mycobacteriumsmegmatis;Bioinformatics

由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tb）引起的肺結(jié)核是呼吸系統(tǒng)傳染病。2022年WHO結(jié)核病報告顯示：2021年耐多藥（multidrug-resistance，MDR）/利福平耐藥（rifampicinresistance，RR）的病例增加到45萬例，耐藥菌株的傳播仍然是“終止結(jié)核病戰(zhàn)略”的重大挑戰(zhàn)[1]。

隨著噬菌體研究的進(jìn)展，噬菌體治療耐多藥細(xì)菌及慢性和持續(xù)性感染備受關(guān)注，分枝桿菌噬菌體也被成功地用于治療耐藥膿腫分枝桿菌感染[2-5]。迄今為止，已有近2000個分枝桿菌噬菌體基因組完成測序[6]；功能基因編碼的噬菌體裂解酶（bacteriophagelysin）是噬菌體感染細(xì)菌末期合成的作用于胞壁質(zhì)的水解酶，其中LysinB是阿拉伯半乳聚糖酯酶，可特異性裂解肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖復(fù)合物與霉菌酸的連接，從而破壞分枝桿菌細(xì)胞壁，發(fā)揮裂解分枝桿菌的作用；還可水解海藻糖二甲酸酯（trehalosedimethylate，TDM）降低結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的致病力。研究表明分枝桿菌噬菌體間同源性裂解酶基因低于50%[7]。Abouhmad等[8]比較4種分枝桿菌噬菌體（D29、Omega、Saal、Obama12）中LysinB蛋白的催化特性，發(fā)現(xiàn)同源性30%～76%的這些蛋白的催化能力存在差異。烈性噬菌體TM4可裂解結(jié)核菌細(xì)胞壁及生物膜，同時也對缺氧型結(jié)核休眠菌具有復(fù)蘇作用，但其編碼的LysinB蛋白的殺菌能力未見系統(tǒng)報道[9-10]。因此，本研究對噬菌體TM4的LysinB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時原核表達(dá)并純化蛋白，分析其殺菌功能。本研究經(jīng)嘉興市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（倫理審批號：LS2020-337）。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis，M.smeg）、大腸桿菌6xhis標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒pET28a由復(fù)旦大學(xué)張鷺課題組贈送；E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5a購自北京全式金生物公司。

1.1.2試劑限制內(nèi)切酶、T4DNA購自NEB公司，DNAmarker、異丙基-B-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-B-D-thiogalactoside，IPTG）購自TaKaRa公司；蛋白預(yù)染Marker購自ThermoFisher公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取盒購自TIANGEN公司；Middlebrook7H9、7H10購自美國Gibco公司；Ni-NTAHis·Bind?Resin鎳柱填料介質(zhì)、細(xì)胞裂解液Bugbuster?蛋白提取劑購自Novagen公司；其余試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1噬菌體TM4LysinB蛋白的生物信息學(xué)分析利用Prot-Param軟件分析噬菌體TM4LysinB蛋白的氨基酸序列、理化性質(zhì)，利用Protscale了解蛋白的親水性或疏水性；利用SOPMA預(yù)測二級結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋；利用TMHMM和SignalIP5.0預(yù)測跨膜區(qū)和信號肽；利用SWISS-MODEL模擬三級結(jié)構(gòu)；采用BepipredLinearEpitopePrediction2.0和ABCpred預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，用NetMHCⅡpan3.2Server和NetMHCpan-4.0Server測T細(xì)胞表位。

1.2.2噬菌體TM4LysinB重組表達(dá)載體的構(gòu)建從美國國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）獲取分枝桿菌噬菌體TM4LysinBDNA序列，根據(jù)pET-28a質(zhì)粒多克隆位點，選擇NdeⅠ和NotⅠ酶切位點。經(jīng)擎科生物公司進(jìn)行原核表達(dá)密碼子優(yōu)化后添加雙酶切位點，人工合成DNA片段。LysinB基因片段與pET-28a質(zhì)粒載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)嫁E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素50μg/ml抗性平板上挑取陽性單克隆，提取重組質(zhì)粒并用NdeⅠ/NotⅠ雙酶切檢驗，進(jìn)一步通過測序確定載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3重組LysinB蛋白的表達(dá)及純化從含卡那霉素的培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）平板上挑取BL21（DE3）/pET28a-LysinB陽性克隆接種入LB，37℃220轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)至光密度（opticaldensity，OD）600（OD600）值為0.6時加入0.05mmol/LIPTG，25℃誘導(dǎo)16h。4℃5000轉(zhuǎn)/min分別離心10min收集誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的細(xì)菌沉淀，Bugbuster?裂解后離心，分別取上清液與等量磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）重懸的沉淀加入蛋白預(yù)制膠（loadingbuffer），100℃水浴10min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE），分析重組LysinB蛋白表達(dá)及可溶性。

2LLB培養(yǎng)液大量培養(yǎng)BL21（DE3）/pET28a-LysinB菌株。37℃200轉(zhuǎn)/min至OD600值為0.6時冰浴降溫，加入0.05mmol/LIPTG，25℃過夜誘導(dǎo)。離心收集菌體（5000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min），并重懸于40mlPBS緩沖液。40W、開4s、關(guān)5s超聲破碎40min，12000轉(zhuǎn)/min、4℃離心15min取上清液，在鎳柱純化目標(biāo)蛋白。用含不同濃度咪唑的緩沖液洗脫，選取100mmol/L、300mmol/L洗脫液在含10%甘油的PBS中進(jìn)行透析。15%SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的純度，采用布拉得福（Bradford）法測定蛋白濃度。

1.2.4TM4LysinB蛋白的殺分枝桿菌效果在7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)M.smeg至OD600值為0.6，用無菌7H9稀釋100倍，25℃、10000轉(zhuǎn)/min離心10min后，用等體積磷酸鹽吐溫緩沖液PBST（PBS+0.1%Tween80，pH7.4）洗滌1次，離心后2倍初始體積PBST重懸，50μl/管分裝。25℃、10000轉(zhuǎn)/min再次離心10min后，對照組用100μlPBS重懸菌體，實驗組用等體積LysinB溶液重懸菌體、37℃孵育1h后用PBST終止反應(yīng)；系列稀釋后取5μl在7H10平板點樣，37℃培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。實驗組中，LysinB蛋白用不同pH值的PBST緩沖液溶解，這些蛋白溶液與恥垢分枝桿菌在37℃共孵育1h，之后用pH7.4的PBST緩沖液置換LysinB溶液以終止反應(yīng)。后續(xù)恥垢分枝桿菌在7H10平板上培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。用不含LysinB蛋白的pH8.0的PBST溶液與恥垢分枝桿菌作用1h后涂板，作為陰性對照。

1.2.5TM4LysinB蛋白的穩(wěn)定性實驗配制pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5的PBST緩沖液，溶解和稀釋LysinB蛋白后，4℃貯存7d、15d，按1.2.4的實驗方法開展體外殺菌試驗，根據(jù)7H10平板上恥垢分枝桿菌生長情況，評估LysinB在4℃貯存條件下維持穩(wěn)定殺菌活性的最適pH。

在最適pH值條件下，分別向PBST緩沖液中添加終濃度為0.5mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L的NaCl，或終濃度為1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L的EDTA-Na2，比較緩沖液中鹽和金屬螯合劑對LysinB蛋白殺菌穩(wěn)定性的影響。以最適pH值的PBST緩沖液作為陰性對照，以含等量LysinB蛋白的最適pH的PBST緩沖液作為陽性對照。

2結(jié)果

2.1噬菌體TM4LysinB蛋白理化性質(zhì)

經(jīng)ProtParam分析，噬菌體TM4LysinB蛋白的400個氨基酸中，堿性氨基酸（K，R）31個，酸性氨基酸（D，E）32個。疏水氨基酸（A，V，L，I，P，F(xiàn)，W，M，G）共250個，占62.5%；親水氨基酸（Y，S，T，C，N，Q，K，R，H，D，E）共150個，占37.5%。分子式C1915H2978N520O543S12，理論等電點為6.66。不穩(wěn)定指數(shù)為28.71，蛋白質(zhì)歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂溶性指數(shù)92.22，親水性總平均值0.067，280nm波長處吸光度值為1.438。Protscale分析顯示蛋白具有兩親性，見圖1。

2.2噬菌體TM4LysinB蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)

SOPMA分析噬菌體TM4LysinB蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲、a-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角分別占42.00%、40.25%、12.00%和5.75%。卷曲螺旋分析表明該蛋白無卷曲螺旋。TMHMM跨膜區(qū)分析顯示LysinB蛋白存在較少跨膜區(qū)，見圖2，SignalP預(yù)測值<閾值0.5，即LysinB蛋白無信號肽序列。

利用SWISS-MODEL模擬噬菌體TM4LysinB蛋白的三級結(jié)構(gòu)中，結(jié)果顯示無規(guī)則卷曲含量高，結(jié)構(gòu)較緊密，見圖3A；由11～73位氨基酸（aminoacid，AA）組成的肽段包含3個α-螺旋，構(gòu)成肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，見圖3B。

2.3噬菌體TM4LysinB蛋白的B細(xì)胞、T細(xì)胞抗原表位

采用BepipredLinearEpitopePrediction2.0和ABCpred預(yù)測噬菌體TM4LysinB蛋白，共有13個B細(xì)胞抗原表位（臨界值0.65），分別為5～17、27～43、58～63、68～82、122～132、148～154、200～233、244～252、298～310、313～327、362～366、372～379、387～396。同時結(jié)合LysinB蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲存在的區(qū)段，探測B細(xì)胞抗原表位可能位于5～17、27～43、58～63、122～132、200～233、244～252、362～366等氨基酸區(qū)段。

采用NetMHCⅡpan3.2Server軟件測LysinB蛋白的CD4+T細(xì)胞表位。將肽段的長度設(shè)置為15個AA，選取人類白細(xì)胞Ⅱ類抗原（humanleukocyteantigen，HLA-Ⅱ）基因分布較廣的亞型（HLA-DRB1-0101、0301、0401、0701、0801、0901、1101、1302、1501）評估親和值。預(yù)測結(jié)果顯示HLA-DR蛋白的總肽段數(shù)149，見表1。除DRB1-0301外，LysinB共有26個強(qiáng)結(jié)合肽段，HLA-DRB1-0101的強(qiáng)弱結(jié)合肽段總數(shù)最多。在強(qiáng)結(jié)合肽段中，YATQVRLGA（68～76）是DRB1-0801和DRB1-1101的結(jié)合表位；LQRFKSKLI（182～190）是DRB1-0701和DRB1-1501的結(jié)合表位；FIATNPPTA（356～364）是DRB1-0401、DRB1-0701和DRB1-0901的結(jié)合表位。

利用在線軟件NetMHCpan4.00Server預(yù)測LysinB的CD8+T細(xì)胞表位。將肽段的長度設(shè)置為9個AA，選擇人類可能性最大的Ⅱ類白細(xì)胞抗原：A2（HLA-A0201）和A3（HLA-A0301）進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果得到6條HLA-A0201結(jié)合能力較強(qiáng)的肽段，分別為GMQGEQVKV（8～16）、KLIAKYQWV（20～28）、GIADYATQV（62～70）、VLIGYSQGA（158～166）、GLVEAVLAL（334～342）、FIATNPPTA（356～364）；2條HLA-A0301的強(qiáng)結(jié)合肽段：VIQQKLIAK（16～24）、RILSGDLQR（175～183）。

2.4噬菌體TM4LysinB蛋白的原核表達(dá)

人工合成LysinB基因片段，與pET-28a質(zhì)粒載體連接后，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃用1mmol/LIPTG小劑量誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)置不加誘導(dǎo)劑的對照組，見圖4A，顯示44kDa的重組LysinB蛋白能夠表達(dá)，但主要為包涵體形式。優(yōu)化IPTG濃度和細(xì)菌培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在25℃、IPTG濃度為0.05mmol/L時，蛋白表達(dá)相對較多，且更多以可溶狀態(tài)存在。

擴(kuò)大至2LLB培養(yǎng)體系，收集菌體純化蛋白。Ni-NTA親和層析柱中孵育菌體蛋白，依次用含20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、300mmol/L咪唑的洗脫液洗脫，收集100mmol/L、300mmol/L洗脫液進(jìn)行透析，獲得蛋白約10mg，SDS-PAGE電泳顯示目標(biāo)蛋白純度符合實驗要求，見圖4B。

2.5TM4LysinB蛋白的體外殺菌能力及穩(wěn)定性

純化獲得的LysinB重組蛋白溶解在pH7.5的PBST緩沖液中，比較不同蛋白工作濃度，發(fā)現(xiàn)0.1mg/ml的LysinB蛋白具有最強(qiáng)殺滅恥垢分枝桿菌的活力，后續(xù)實驗采用這一工作濃度。

為進(jìn)一步優(yōu)化蛋白的殺菌和貯存條件，本研究比較蛋白儲存液的不同pH值、4℃下貯存時間、儲存液中NaCl、金屬螯合劑的添加等因素。

A.LysinB蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)。泳道1：重組菌株未誘導(dǎo)培養(yǎng)后裂解液可溶部分；泳道2、3：重組菌株IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后裂解液可溶部分，為2個單克隆重復(fù)；泳道4：重組菌株未誘導(dǎo)培養(yǎng)后裂解液包涵體部分；泳道5、6、7：重組菌株IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后裂解液包涵體部分，為3個單克隆重復(fù)；泳道8：Marker。B.LysinB蛋白的純化。泳道1：LysinB蛋白純化結(jié)果；泳道2、3、4：細(xì)菌裂解液可溶部分掛柱流出液、洗滌液對照；泳道5：Marker

在4℃貯存7d，蛋白活性基本不變，pH8.0的貯存液中蛋白殺菌活力最強(qiáng)，見圖5A。15d后，這一緩沖液中的LysinB蛋白殺菌活性基本不變。在pH為8.0的PBST緩沖液中添加NaCl或EDTA-Na2，對LysinB的殺菌能力沒有影響，見圖5B。

3討論

分枝桿菌噬菌體來源廣泛，其裂解酶也成為新型抗菌制劑的研究熱點[11]。裂解酶作為一種蛋白質(zhì)，可通過基因工程的方法獲得。雖然已對部分噬菌體裂解酶的功能進(jìn)行探索，但研究工作更多集中在不同蛋白的酶學(xué)驗證階段，臨床試驗進(jìn)展緩慢。面對耐藥結(jié)核菌復(fù)雜的表型特征，不僅需要篩選、獲得更大量的分枝桿菌噬菌體，而且需要對其裂解酶蛋白質(zhì)特征和抗菌特性開展全面而深入的研究。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和抗原表位的預(yù)測為蛋白質(zhì)功能研究提供極大便利[12-13]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)TM4噬菌體來源的LysinB蛋白N端11～73位AA組成蛋白的肽聚糖結(jié)合位點，決定LysinB蛋白的酶解場所，也是噬菌體特異性識別并裂解分枝桿菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。蛋白B細(xì)胞和T細(xì)胞表位的分析結(jié)果有助于預(yù)測噬菌體治療過程中誘發(fā)的潛在免疫反應(yīng)[5，13]。LysinB蛋白預(yù)測的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位不存在交叉，但FIATNPPTA（356～364）肽段作為T細(xì)胞表位，可同時與HlA-Ⅰ和HLA-Ⅱ型受體結(jié)合，激起CD4和CD8型細(xì)胞免疫反應(yīng)。暗示LysinB蛋白在殺菌作用的同時，還具有免疫調(diào)節(jié)的功能，可為結(jié)核早期快速診斷和候選疫苗的篩選提供候選肽表位。

分枝桿菌噬菌體裂解酶被認(rèn)為是應(yīng)對細(xì)菌耐藥性的有效解決手段，但在進(jìn)入臨床應(yīng)用前，作為蛋白多肽類藥物，裂解酶也存在貯存期間保持穩(wěn)定性以防止蛋白失活的問題。誘發(fā)蛋白酶類變性失活的因素主要包括溫度、pH、鹽類、表面活性劑等[14]。本研究重點考察pH調(diào)節(jié)劑（緩沖體系）、鹽類、表面活性劑類在內(nèi)的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)在水中發(fā)生表面吸附、聚集、沉淀，從而失活，而螯合劑可減少對酶的氧化還原反應(yīng)起催化作用的金屬離子，同樣也可提高蛋白多肽類藥物的化學(xué)穩(wěn)定性。本研究為上述各組分的優(yōu)化提供前期定性試驗證據(jù)，進(jìn)一步的定量結(jié)果則可能需要通過更嚴(yán)格地控制實驗條件、延長實驗周期，或改用可定量反映殺菌活性的試驗方法進(jìn)行確定。

總之，目前已上市的裂解酶制劑主要針對常見的革蘭陽性菌及陰性菌感染，還未見分枝桿菌裂解酶制劑注冊上市[15]。本研究建立的基于LysinB蛋白特征的免疫反應(yīng)預(yù)測及LysinB蛋白殺菌特性的觀察，不僅有助于深入了解分枝桿菌噬菌體裂解酶，也為研制可穩(wěn)定貯存的噬菌體酶制劑及其臨床應(yīng)用提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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