神經(jīng)肽S受體基因多態(tài)性與原發(fā)性失眠的相關性研究

[摘要]目的探討神經(jīng)肽S受體（neuropeptideSreceptor，NPSR）基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957）與原發(fā)性失眠（primaryinsomnia，PI）的相關性。方法選取2016年12月至2019年5月在甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學中心門診就診并確診的PI患者157例作為PI組，選取同期133名健康體檢者作為對照組。抽取受試者的靜脈血標本，并提取DNA、聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增、瓊脂糖凝膠電泳，目標位點測序?qū)s323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957單核苷酸位點進行基因分型，同時行標準多導睡眠監(jiān)測，分析基因多態(tài)性與PI的相關性。結(jié)果兩組受試者的NPSRSNP位點（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547）基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；rs324957位點基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.034）；兩組受試者不同單倍型頻率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論NPSRrs324957SNP位點基因型表達或與PI相關，且以AG基因型為主。

[關鍵詞]神經(jīng)肽S；原發(fā)性失眠；單核苷酸多肽性

[中圖分類號]R749；R596[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.001

StudyonthecorrelationbetweenneuropeptideSreceptorgenepolymorphismandprimaryinsomnia

FANJie1，2，HUIPeilin1，2，MAWei1，2，WANGXubin1，2，ZHAOYuan1，2，WANGJinfeng1，2，CHENXueping1，2，SUXiaoyan1，2，GUOBin1，2，XIEYuping1，2

1.CenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospital，Lanzhou730000，Gansu，China;2.GansuClinicalSleepMedicineResearch Center，Lanzhou730000，Gansu，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweenneuropeptideSreceptor（NPSR）singlenucleotidepolymorphism（SNP）（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957）andprimaryinsomnia（PI）.MethodsAtotalof157patientsdiagnosedwithPIintheoutpatientdepartmentofCenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospitalfromDecember2016toMay2019wereselectedasPIgroup，and133healthyphysicalexaminationsubjectsduringthesameperiodwereselectedascontrolgroup.VenousbloodsampleswerecollectedandDNA，polymerasechainreaction（PCR）amplificationandagarosegelelectrophoresiswereextracted.rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957singlenucleotidelociweregenotypizedbytargetsitesequencing.Meanwhile，standardpolysomnosismonitoringwasperformedtoanalyzethecorrelationbetweengenepolymorphismandPI.ResultsTherewerenosignificantdifferencesinthegenotypedistributionofNPSRSNPsites（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547）andallelefrequencyandrs324957allelefrequencybetweentwogroups（P>0.05）.Therewassignificantdifferenceingenotypedistributionofrs324957（P=0.034）.Therewasnosignificantdifferenceinthefrequencyofdifferenthaplotypesbetweentwogroups（P>0.05）.ConclusionTheexpressionofrs324957SNPgenotypesinNPSRmayberelatedtoPI，andAGgenotypeisdominant.

[Keywords]NeuropeptideS;Primaryinsomnia;Singlenucleotidepolymorphism

失眠是一種常見的睡眠障礙，分為原發(fā)性失眠（primaryinsomnia，PI）和繼發(fā)性失眠。PI幾乎以睡眠障礙[難以進入睡眠和（或）難以維持或睡眠后精力不能恢復]為唯一的癥狀，盡管有足夠的睡眠時間，但仍會出現(xiàn)睡眠問題，并導致至少一種相關的日間障礙，影響社交、工作或其他重要領域，每周至少發(fā)生3次，持續(xù)時間>3個月，并排除由其他心理/精神障礙及軀體疾病、藥物或酒精等導致的失眠[1]。關于PI的成因，有研究發(fā)現(xiàn)PI患者有家族聚集現(xiàn)象[2]。Beaulieu-Bonneau等[3]對953例成人患者的調(diào)查顯示，35%的患者至少有一個一級親屬曾罹患或正罹患失眠，提示PI具有遺傳特征[4]。神經(jīng)肽S（neuropeptideS，NPS）及神經(jīng)肽S受體（neuropeptideSreceptor，NPSR）是最新發(fā)現(xiàn)的一種睡眠調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它們可激活下丘腦后部組胺能、食欲素能神經(jīng)元產(chǎn)生覺醒，這為深入研究失眠的發(fā)病機制提供新的思路[5-6]。

本研究通過選擇NPSR基因的5個標簽單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點rs323917、rs323920、rs323922、rs324957及rs2530547進行基因分型，探討PI與基因多態(tài)性的關系，為PI診斷和治療提供一定的理論基礎。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年12月至2019年5月在甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學中心門診就診并確診的PI患者157例作為PI組，選擇年齡、性別與PI組相匹配且保證兩組間無血緣關系的133名健康體檢者作為對照組。對兩組受試者進行紅外線音視頻同步記錄整夜多導睡眠監(jiān)測（audioandvideopolysomnosis，AV-PSG），受試者監(jiān)測當晚不服用睡眠藥物，按平時作息時間進入監(jiān)測室，整夜多導睡眠監(jiān)測（polysomnosis，PSG）記錄的時間不低于7h。多導睡眠圖指標包括清醒期（W期）、非快速眼動1期（N1期）、非快速眼動2期（N2期）、非快速眼動3期（N3期）、快速眼動期（R期）。本研究經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：syll20150043）。所有受試者均簽署知情同意書。

病例組納入標準：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》[1]第5版的PI診斷標準，至少滿足以下1項：a.入睡困難；b.維持睡眠困難，表現(xiàn)為頻繁覺醒或醒后難以入睡；c.早醒且不能再入睡。②每周睡眠困難≥3次。③失眠不是因某種物質(zhì)（如濫用毒品、藥物）等導致的生理效應。排除標準：①由其他原因引起的繼發(fā)性失眠，尤其是根據(jù)《中國失眠癥診斷和治療指南》[7]鑒別排除焦慮障礙所致失眠；②有其他嚴重軀體疾病者，如高血壓病、心臟病、甲狀腺功能異常、糖尿病等；③有其他明確的失眠原因，如近期有重大心理應激而致失眠者；④不適合量表評估的低齡和高齡人群；⑤PSG結(jié)果為主觀性失眠患者；⑥PSG結(jié)果呼吸暫停低通氣指數(shù)（apnea-hypopneaindex，AHI）>15次/h者；⑦有與國外種族聯(lián)姻家族史者；⑧未簽署知情同意書者。對照組納入標準：①年齡、性別與PI組相匹配正常人群；②兩組間無血緣關系。

1.2方法

1.2.1SNP位點的選擇從美國國立生物技術信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）SNP數(shù)據(jù)庫及HapMap計劃選擇NPSR基因功能性SNP。納入標準：①外顯子區(qū)能改變氨基酸表達，在中國人群中最小等位基因頻率>5%；②在非翻譯區(qū)，中國人群中最小等位基因頻率>5%；③在5'啟動子2kb內(nèi)，中國人群中最小等位基因頻率>5%。共得到13個標簽SNP，本研究選擇5個標簽SNP位點。

1.2.2標本采集和DNA提取采集受試者外周靜脈血2ml用以提取DNA。

1.2.3引物設計及合成5個SNP位點的引物序列5個SNP位點的引物序列見表1。

1.2.4聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增目的片段將擴增產(chǎn)物送往博淼生物科技（北京）有限公司進行測序，測序結(jié)果用chromas軟件進行分析處理。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用c2檢驗；采用SHEsis軟件在線檢測基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE）檢驗，單倍型分析及連鎖不平衡檢驗分析5個標簽SNP是否具有獨立代表意義；行×列表c2檢驗比較組間單個基因型及等位基因頻率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1兩組受試者的一般資料比較

兩組受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（bodymassindex，BMI）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；睡眠效率、總睡眠時間、睡眠持續(xù)時間、睡眠覺醒次數(shù)、N1期占比、N2期占比、N3期占比、R期占比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見表2。

2.2HWE檢驗

本研究所選取的5個標簽SNP位點已在HapMap中國漢族人群基因數(shù)據(jù)庫中進行連鎖不平衡篩查，為防止偏倚，對入選的5個標簽SNP再次進行HWE檢驗，結(jié)果顯示P>0.05，5個SNP位點基因型符合HWE，樣本具有群體代表性。

2.3兩組受試者的5個SNP位點基因型和等位基因頻率分布

兩組受試者的rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547位點基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；rs324957位點基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.034）；兩組受試者不同單倍型頻率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

2.45個SNP位點連鎖不平衡檢驗分析

應用基于最大似然算法的SHEsis軟件進行連鎖不平衡檢驗分析，發(fā)現(xiàn)由rs323920-rs323922構成的單倍型高度連鎖（D'>0.9，r2>0.8），見圖1和圖2。

2.5兩組受試者的5個SNP位點組成的常見單倍型頻率比較

同樣應用基于最大似然算法的SHEsis軟件進行單倍型推斷，比較兩組受試者不同單倍型頻率的差異。兩組受試者5個標簽SNP位點組成的常見單倍型（單倍型頻率>5%）有7種，P>0.05，見表4。

3討論

NPS是一種新型的20種氨基酸肽，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌組織中表達，NPS與NPSR特異性結(jié)合，是一種G蛋白偶聯(lián)受體[8]。NPSR前體mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，包括大鼠的運動皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、前嗅核、丘腦、下丘腦、杏仁核及海馬結(jié)構下托復合體等[9]。NPSR的廣泛分布暗示NPS-NPSR系統(tǒng)在多種生理活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[10]。動物研究表明，NPS-NPSR系統(tǒng)具有明顯的促覺醒作用，主要表現(xiàn)為延長睡眠潛伏期、減少覺醒向慢波睡眠的轉(zhuǎn)換次數(shù)、相應增加覺醒時間、縮短慢波睡眠和快速眼動睡眠時間[11-12]。研究表明將NPS輸注到雙側(cè)前下丘腦，包括腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateralpreopticarea，VLPO）可顯著增加清醒發(fā)作的持續(xù)時間，并特別減少非快速眼動睡眠，這表明NPS通過抑制VLPO中促進睡眠的神經(jīng)元誘導清醒[13]。NPSR的基因突變抑制嚙齒類動物的睡眠，然而，睡眠需求依然存在，這些動物沒有表現(xiàn)出與睡眠障礙相關的記憶障礙[14]。以上結(jié)果表明NPS的促醒作用在不同物種之間是一致的?？傊?，基于NPS-NPSR與睡眠相關性基礎研究結(jié)論已較為一致，但關于NPSR基因研究較少，目前關于研究多態(tài)性位點與PI的致病機制尚無統(tǒng)一定論，少量研究顯示NPSR基因的突變可導致人類原發(fā)性失眠，SNP變異導致人類睡眠變化[15]。以往研究證明遺傳因素是睡眠障礙的主要因素之一；雙胞胎研究表明睡眠特征和失眠有遺傳基礎[17]；PI患者的一級親屬患失眠的風險增加6.65倍[16-17]；成人自我報告睡眠時間和失眠的遺傳率分別為0.25%～0.44%和0.22%～0.59%[18-19]。盡管有證據(jù)表明存在相當大的遺傳成分（遺傳率為38%～59%），但迄今為止，只有少數(shù)遺傳基因座可調(diào)節(jié)失眠的風險[20]。針對失眠主訴（n=113006）的全基因組關聯(lián)研究證明其多基因結(jié)構，并涉及3個全基因組顯著性基因座和7個基因[21-22]。

本研究團隊前期關于NPSR基因多態(tài)性和原發(fā)性失眠之間關聯(lián)的研究結(jié)果表明，兩種不同的等位基因組合（CATGTC和GCCAAT）可能是原發(fā)性失眠的致病因素[23]。NPS基因多態(tài)性rs323920位點和rs324957位點可能是原發(fā)性失眠的易感基因位點，NPSR-SNP位點CACGGTCCCCAGC單倍型組合為原發(fā)性失眠人群的危險基因[24]；而筆者通過對NPSR基因的5個SNP位點進一步研究，發(fā)現(xiàn)4個位點基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義，但rs324957基因型分布差異有統(tǒng)計學意義，在PI患者中rs324957位點基因型以AG型為主，因此NPSR基因rs324957位點多態(tài)性可能與PI具有相關性，即本研究進一步證實NPSR基因多態(tài)性rs324957與漢族PI的關系，發(fā)現(xiàn)NPSR基因多態(tài)性rs324957的等位基因和基因型頻率分布在PI組與對照組之間及兩組不同性別間的顯著差異，支持rs324957SNP是PI易感位點的假設。

綜上所述，本研究在前期研究基礎上進一步發(fā)現(xiàn)NPSR基因多態(tài)性SNP位點rs324957與PI之間的相關性，但仍需高質(zhì)量、大樣本量的研究進一步驗證。未來通過增加樣本量對NPSR基因位點進行篩選及研究，有望進一步豐富PI發(fā)生機制與基因多態(tài)性之間的關系，從而指導臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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