一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的在煙草葉片中實現(xiàn)外源基因瞬時表達的方法

摘要：煙草是一種被廣泛使用的模式植物，經(jīng)常被用于分子生物學(xué)研究。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)研究了一種新的外源基因在煙草葉片中瞬時表達的系統(tǒng)。首先，通過PCR擴增目的基因，與質(zhì)粒進行連接后與大腸桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，通過PCR、酶切驗證和測序確認基因插入，再轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。經(jīng)侵染后成功在煙草中實現(xiàn)了目的基因（GFP）的表達。本研究有助于推進利用煙草作為模式植物的分子生物學(xué)研究，并在各個領(lǐng)域都有應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：煙草；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；瞬時基因表達；分子生物學(xué)研究

植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)中，盡管存在轉(zhuǎn)化效率低等問題，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法仍因其高效且便捷被廣泛應(yīng)用于基因功能研究。農(nóng)桿菌注射技術(shù)作為新興手段，以其瞬時表達和操作簡便性，為高通量基因功能分析提供了可能。近年研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在植物中實現(xiàn)了外源基因的快速表達，為深入探索植物生物學(xué)提供了新的思路。這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達、基因相互作用、蛋白表達以及疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究。如唐伶俐等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功建立了厚皮甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系[1]。孫蔓莉等通過在本氏煙草上共表達RB和Avrblb1，探究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因瞬時表達效率的因素，如農(nóng)桿菌菌懸液OD600值、菌系、植物品種及生長發(fā)育階段等[2]。張悅婧等則以本氏煙草為材料，分析了不同農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度和侵染時間對瞬時轉(zhuǎn)化過程中報告基因GFP熒光表達量的影響[3]。蔡瀾峰通過基因質(zhì)粒pCAMBIA2301為載體，在模式作物煙草上測試了五種農(nóng)桿菌菌株侵染能力，以及5個甘蔗品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行了一系列優(yōu)化，包括愈傷組織、心葉和懸浮細胞三種靶組織類型[4]。這些研究展示了農(nóng)桿菌注射技術(shù)快速、靈活和高效的特點，為植物基因功能研究提供了新的思路和手段，為深入探索植物生物學(xué)提供了重要的技術(shù)支持。本研究基于此，構(gòu)建了一個農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片外源基因瞬時表達體系，并進行了一系列驗證，以期為植物基因表達提供新途徑。

1 方法與材料

1.1 質(zhì)粒提取與濃度測定

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌菌液（DH5α）：含有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

質(zhì)粒提取試劑盒（TRAN Code：EM101-02 Lot：R51030-V2）；離心機（eppendorf Centrifuge 5424）；恒溫金屬?。℅INGOh2O3-100C）；吸附柱；Nanodrop。

1.1.2 實驗方法

取1.5 mL大腸桿菌菌液，在10000G下離心1 min，棄去上清液，留下菌體。加入250μL預(yù)冷的Resuspension Buffer（RB），輕柔顛倒混勻。隨后加入250μL Lysis Buffer（LB）8aznQdkbxag/64A9RgBALQ==，輕柔顛倒混勻6～8次。加入350μL Neutralizing Buffer（NB），輕柔顛倒混勻約10次后在12 000 G常溫離心5 min，上清液移到吸附柱上，用12 000 G常溫離心上清液1 min，倒掉清液。加入650μL Wash Buffer（WB）后12 000 G常溫離心1 min，倒出液體再12 000 G常溫離心1 min。加入30μL預(yù)熱至65℃的Elution Buffer（EB），將質(zhì)粒從橡膠柱上洗下，靜置溶解1min，再10 000 G常溫離心1 min。最終，用2μL樣品進行分光光度計濃度檢測。

1.2 引物設(shè)計和目的基因的PCR擴增

1.2.1 試驗材料

上游引物pCB-GFP-F：5'- GGACTCTAGAGGAT

CCATGGTGAGCAAG -3'（BamHI酶切位點）。

下游引物pCB-GFP-R：5'- GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAG -3'（SacI酶切位點）。

質(zhì)粒模板：載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S-空-

GFP。pCAMBIA1300-35S-空-GFP質(zhì)粒含有GFP基因編碼區(qū)。

Taq Mix酶；PCR儀（BIO-RAD T100? Thermal

Cycler2）

1.2.2 試驗方法

以含有GFP基因的pCAMBIA1300-35S-空-GFP質(zhì)粒為模板進行GFP基因編碼區(qū)的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中，上下游引物（10μmol/L）各2μL，載體質(zhì)粒pFF19 DNA 1μL（XX ng），Taq Mix酶 25μL，加水補至50μL。

擴展條件：

預(yù)變性：95℃，5 min。

變性：95℃，30 s。

退火：55℃，30秒。

延伸：72℃，1 min。

循環(huán)次數(shù)：34個循環(huán)。

最終延伸：72℃，50 min。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

1.3.1 試驗材料

瓊脂粉（tsingke TSJ001）；1×TAE緩沖液；核酸膠染劑；PCR擴增產(chǎn)物；DNA Marker（tsingke DL2000 DNA Marker）；GoldenView染色劑；DNA loading（EDTA，溴酚藍）。

1.3.2 試驗方法

取0.4 g瓊脂糖，加入40 mL1×TAE緩沖液中。隨后，將混合物加熱至溶解，然后冷卻至65℃左右，加入4μL核酸膠染劑，充分混合。接著將膠板放入膠槽內(nèi)并插入梳子，倒入瓊脂糖凝膠溶液，等待其完全凝固后拔出梳子。將膠板放入電泳槽內(nèi)，槽內(nèi)加入足夠的1×TAE緩沖液使其覆蓋膠面。使用移液槍將樣品加入膠孔內(nèi)。隨后將電泳槽連接至電源并設(shè)定180V恒定電壓，直至溶液前端達到膠板底部。最后關(guān)閉電源，取出膠板，并進行照膠操作，以記錄和分析凝膠上的DNA遷移帶。

1.4 載體線性化與純化

1.4.1 試驗材料

大腸桿菌質(zhì)粒（DH5a）；DNA loading buffer

緩沖液；BamHI-HF酶（NEW ENGLAND BioLabs

R3136S）；SacI酶（NEW ENGLAND BioLabs

R0156L）。

1.4.2 試驗方法

線性化。在質(zhì)粒載體線性化的試驗中，加入37μL蒸餾水、6μL大腸桿菌質(zhì)粒（1μg）、5μL緩沖液、1μL Bam-HI酶和 1μL SacI-HF酶。反應(yīng)程序：37℃，1～2 h。

純化。如前所述進行核酸電泳后，將膠板取出，將目的條帶所在膠塊切下稱重，按照試劑所示流程進行膠回收，得到酶切產(chǎn)物。

1.5 線性化載體與目標(biāo)片段的連接與菌落培養(yǎng)

1.5.1 試驗材料

CE buffer（Vazyme 7E771E3）；EXuasell酶（Vazyme 7E771E3）；感受態(tài)大腸桿菌；LB培養(yǎng)基。

1.5.2 試驗方法

首先在離心管中加入0.42μL DNA 片段（按照最適插入片段使用量=[0.04x 插入片段堿基對數(shù)]ng（0.06pmol）配比）與 6.5μL 載體（最適克隆載體使用量=[0.2×克隆載體堿基對數(shù)]ng（0.03pmol）配比），再加入CE buffer 4μL，EXuasell酶2μL，與去離子水7.06μL。其次將上述體系用PCR儀37℃培育30 min。之后將同源重組產(chǎn)物使用感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化，37℃搖勻培養(yǎng)30 min后涂布在對應(yīng)抗性的固體培養(yǎng)基上，倒置37℃過夜。

1.6 基因重組后的菌落的PCR鑒定

1.6.1 試驗材料

Taq酶mix。

F端引物pCB-GFP-F：5’- GGACTCTAGAG

GATCCATGGTGAGCAAG -3’（BamHI酶切位點）。

R端引物NOS-R：5’- GATAATCATCGCA

AGACCGG -3’（在NOS終止子上）。

1.6.2 試驗方法

挑取單菌落至40μL無菌水中。每個板挑取3個陽性菌落，取4份劑量的F端引物、R端引物、去離子水和Taq酶混合在一起，即F端引物和R端引物各4μL，40μL Taq酶，混勻。

配制PCR反應(yīng)體系，進行核酸電泳，觀察目的條帶。

1.7 重組質(zhì)粒提取與重組質(zhì)粒的酶切驗證

首先取37μL的蒸餾水放入離心管，其次加入1μg

質(zhì)粒（按提取的濃度應(yīng)加入4μL），接著加入5μL cutsmart緩沖液，構(gòu)建cutsmart體系，再加入1μL BamHI，然后加入1μL XmaI，接著37℃金屬浴1 h，如上所述進行核酸電泳。

1.8 農(nóng)桿菌的重組DNA的導(dǎo)入

1.8.1 試驗材料

農(nóng)桿菌（GV301）；去離子水；含有GFP的質(zhì)粒；感受態(tài)細胞。

1.8.2 試驗方法

用提前培育2 d的農(nóng)桿菌（GV301）取2μL質(zhì)粒，與20μL感受態(tài)，在冰上靜置5 min，然后放入液氮5 min，再37℃金屬浴5 min，再在冰上靜置5 min。28℃搖床2 h。接著把搖好的菌5 000 r/min離心1 min，吸去上清液，將剩余部分吹打混勻，滴加到培養(yǎng)基上，涂勻，在28℃培養(yǎng)2 d。

1.9 農(nóng)桿菌侵染煙草

1.9.1 實驗材料

農(nóng)桿菌（GV301）；去離子水MgCl2溶液（1 mol/L）；

ASG-乙酰丁香酮（1 mol/L）；MES-2-嗎啉乙硫磺（15 mol/L）。

1.9.2 試驗方法

取提前培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌5 mL，5000rpm離心5 min。配置侵染液，1 mL MgCl2溶液（1mol/L）、1 mL ASG-乙酰丁香酮（1mol/L）、1 mL MES-2-嗎啉乙硫磺（15 mol/L）。接著將離心好的菌液上清液倒出，取100μL，與900μL侵染液混合，在光度儀中測出濃度，運用公式（測出濃度×體積/需求濃度-體積）算出所稀釋的量（2.15×5/1～5 mL）=5.75 mL。按這個濃度來配置所需溶液，將其放在搖床上培育2 h。然后將搖好的菌拿出，用針管吸取，將煙草葉子翻轉(zhuǎn)，背面朝上，用針尖扎一個孔，然后取下針尖，用食指抵住背面用注射器頭堵住葉片背面的孔，慢慢將注射器中的菌液到葉片里直至整個葉片都被菌液充滿（若一個孔不能使這個葉片布滿，則多扎幾個），最后繼續(xù)種植煙草約2 d。

2 試驗結(jié)果與分析

質(zhì)粒提取及濃度測定結(jié)果顯示，組別1的質(zhì)粒

濃度為247.956 g/μL，A260/A280為1.93左右，符合試驗要求。這說明提取的質(zhì)粒樣品具有足夠的濃度和較少的雜質(zhì)。

以pCAMBIA1300-35S-空-GFP質(zhì)粒為模板，使用pCB-GFP-F和pCB-GFP-R引物進行PCR擴增試驗，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察到明顯的、符合預(yù)期大小的PCR條帶（圖1），成功得到了預(yù)期大小為750 bp的擴增產(chǎn)物，說明PCR成功。

圖2的瓊脂糖電泳圖展示了載體線性化實驗的結(jié)果。通過瓊脂糖電泳圖可以發(fā)現(xiàn)1號泳道的上方較亮的條帶為10 000 bp左右的線性化后的載體，在下方較暗的條帶為750 bp的線性化載體；2號泳道僅有一條較亮條帶，長度約為750 bp，和BamHI位點與SacI位點之間的片段長度相符，應(yīng)為目的基因的PCR產(chǎn)物，說明載體線性化與PCR有效。

菌落擴培結(jié)果顯示，經(jīng)過37℃、12 h的培養(yǎng)，培養(yǎng)基上含有GFP片段的菌落生長良好，有較多菌落，說明轉(zhuǎn)化較為成功。

菌落PCR結(jié)果如圖3所示，1、2、3泳道分別為培育好的含有GFP段落的不同獨立菌落的樣品，4為加入了無菌水的對照組。發(fā)現(xiàn)1、2、3泳道的條帶大小、位置基本一致，說明其取樣菌落均為真陽性，而4泳道的空白對照沒有條帶，說明無菌水無污染且實驗有效。

（M為DNA marker DL2000，1、2、3為不同的獨立菌落樣本，4為加了無菌水的對照重組質(zhì)粒提取與重組質(zhì)粒的酶切驗證實驗結(jié)果如圖4所示，可以看到泳道1、2均有一條較亮、長度約在10 000 bp的條帶，但由于酶切位點BamHI與XbaI之間還未插入目標(biāo)基因序列，只有極少量bp的片段，切下來的片段過短，在瓊脂糖凝膠電泳圖上不可見。所以圖中沒有第二條較小條帶為正常情況，實驗有效。

M為DNA marker DL2000，泳道1、2為同一份樣品質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌試驗結(jié)果獲得了一盆（三片葉子）經(jīng)過含有GFP片段的根癌農(nóng)桿菌侵染的本氏煙草，菌液基本充滿了目標(biāo)葉子。

3 總結(jié)與展望

本研究通過構(gòu)建一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的在煙草葉片中實現(xiàn)外源基因瞬時表達的體系，成功地實現(xiàn)了外源基因在本氏煙草上的快速而有效的表達。該方法具有較高的操作效率，為研究者們提供了一種新的、迅速的基因外部表達方式。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達技術(shù)在植物基因工程領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。然而，在充分利用這一技術(shù)的同時，我們也要正視其存在的一些局限性。首先，農(nóng)桿菌介導(dǎo)并非百分之百成功，其轉(zhuǎn)化效率受到植物天然防御機制的制約，導(dǎo)致試驗失敗的風(fēng)險存在[5]。解決這一問題需要深入研究植物與農(nóng)桿菌互作的機制，尋找提高轉(zhuǎn)化效率的途徑。其次，瞬時表達的特性使得其在子代中無法穩(wěn)定遺傳。這對于作物改良和育種工作來說是一個挑戰(zhàn)。未來的研究可以嘗試通過進一步改良農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)，使得其表達能力更具持久性，能夠穩(wěn)定傳遞給后代。此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達在不同植物種類中可能存在差異。因此，未來的研究可以探索優(yōu)化該技術(shù)以適應(yīng)更廣泛的植物類型，提高其通用性和適應(yīng)性。通過克服其局限性，我們可以更好地利用這一技術(shù)，為未來植物科研和農(nóng)業(yè)發(fā)展提供更多可能性。

參考文獻

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