QuEChERS凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅棗中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

摘要 ［目的］建立1%甲酸-乙腈提取結(jié)合QuEChERS凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定紅棗中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的方法。［方法］比較不同提取試劑、凈化材料等對(duì)提取凈化效果的影響。在ESI源正/負(fù)離子模式下，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行定性和定量分析。［結(jié)果］5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在1～50 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.999），方法檢出限和定量限分別為0.1～0.2和0.3～0.6 μg/kg?？瞻准t棗3個(gè)不同的添加水平回收率為82.5%～106.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～8.4%。通過對(duì)市售紅棗樣品檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確測(cè)定紅棗中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平。［結(jié)論］該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確可靠，適用于紅棗中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞 紅棗；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；QuEChERS

中圖分類號(hào) TS255.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）14-0165-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.036

Determination of Five Plant Growth Regulator in Red Jujube by QuEChERS Purification High-performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LU Li-liang， CHEN Yong-fa， ZHANG Jin-lei et al

（Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Food Quality Inspection and Testing Center（Shihezi），Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］A method was developed for the simultaneous determination of 5 plant growth regulators （PGRs） in red jujube by using 1% formic acid-acetonitrile extraction and QuEChERS cleanup with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） detection. ［Method］The effects of different extraction reagents， purification materials， etc. on the extraction and purification efficiency were compared. Data were collected in multiple response monitoring （MRM） mode in ESI source positive/negative ion mode for qualitative screening and quantitative analysis. ［Result］The linear relationship of the five plant growth regulators was good within the mass concentration range of 1-50 ng/mL （R2>0.999），the detection and quantification limits were 0.1-0.2 and 0.3-0.6 μg/kg， respectively. The recovery rates of three different addition levels of blank red jujube were 82.5%-106.1%， the relative standard deviation （RSD） was 1.0%-8.4%.Through the detection of actual samples in the market， the level of PGRs in red jujube could be accurately quantified. ［Conclusion］The method is simple， rapid， accurate and reliable， and suitable for the rapid determination of five plant growth regulators in jujube.

Key words Red jujube;PGRs;HPLC-MS/MS;QuEChERS

作者簡(jiǎn)介 魯立良（1981—），男，安徽潁上人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，從事食品安全與工程研究。

收稿日期 2023-09-20

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGRs）是人工合成或從微生物中提取的與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的有機(jī)化合物，也稱為植物外源激素［1-2］，如赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸、2，4-D等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，使用適量的PGRs，可以有效調(diào)控農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，促進(jìn)農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性等［3-4］。但過量使用可能會(huì)使農(nóng)作物過快生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)受到抑制，嚴(yán)重的可能會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物死亡，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量；另外，不規(guī)范的使用還容易造成土壤和水體等的環(huán)境污染，同時(shí)易導(dǎo)致PGRs在農(nóng)作物中的殘留，并通過食物鏈的傳遞和富集進(jìn)入人體，給人們的健康帶來巨大危害。因此，PGRs的使用已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注［5-7］。

紅棗含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。在紅棗的種植生產(chǎn)過程中會(huì)使用到多種PGRs，由于使用不規(guī)范容易導(dǎo)致PGRs在紅棗中殘留。為了減少潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，急需對(duì)紅棗中PGRs進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查。目前，用于檢測(cè)PGRs含量的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較少，前處理過程復(fù)雜，耗費(fèi)大量的有機(jī)試劑，且紅棗含有大量的糖分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)十分復(fù)雜，PGRs的提取和凈化成為紅棗中PGRs殘留分析的關(guān)鍵。PGRs的提取主要使用有機(jī)溶劑，如甲醇［8］、乙腈［9］等，甲醇的極性相對(duì)較小，提取的共萃物較多；乙腈提取時(shí)回收率高、干擾物較少，是廣泛使用的有機(jī)污染物提取試劑；PGRs凈化方法主要有固相柱凈化法和 QuEChERS［10］等，固相柱凈化法需要對(duì)固相柱進(jìn)行活化，使用較多的有機(jī)試劑，QuEChERS法具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、回收率高、試劑用量少等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于有機(jī)污染物的凈化。PGRs的測(cè)定方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）和離子色譜法（IC）等［11-13］。GC和GC-MS通常要進(jìn)行待測(cè)物衍生化，操作復(fù)雜；HPLC靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)確證分析；HPLC-MS/MS具有高特異性和高靈敏度，具有定性、定量分析準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適合復(fù)雜樣品中痕量成分的定性定量分析［14-15］。

目前，紅棗中的PGRs檢測(cè)存在一定的不足，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法，對(duì)紅棗中的PGRs風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控具有重要的意義。該研究采用有機(jī)溶劑提取、QuEChERS方法凈化處理，結(jié)合HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定鮮棗中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，同時(shí)，通過對(duì)市售鮮棗的實(shí)際檢測(cè)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，獲得了低檢出限、快速、簡(jiǎn)便的PGRs檢測(cè)方法，為市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP5500+高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；N-EVAPTM112氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；3-30K高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；IKA MS3渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；SBL-30PT超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IQ7000超純水儀（美國(guó)MilliQ公司）。

5種標(biāo)準(zhǔn)品：赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），純度均大于97%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；無(wú)水硫酸鎂（分析純）；無(wú)水乙酸鈉（分析純）；C18（分析純）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確稱取適量的赤霉素、多效唑、矮壯素、萘乙酸和2，4-D于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2

混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。準(zhǔn)確量取“1.2.1”各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成100.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液，于-18 ℃儲(chǔ)存。

1.3 儀器條件

1.a1a5d148eba65891504b9654f475ea6f3.1 色譜條件。色譜柱為ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm，美國(guó)Waters公司）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速0.30 mL/min；進(jìn)樣量5 μL，柱溫30 ℃。梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.3.2

質(zhì)譜條件。離子化模式為電噴霧離子源（±ESI源），掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），IS電壓4 500 V，源溫度500 ℃，霧化氣溫度50 ℃，氣簾氣241.32 kPa，輔助氣344.74 kPa，碰撞氣55.16 kPa。采集方式為正/負(fù)離子，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 PGRs提取。

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的鮮棗樣品10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿 2 min，加入4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g無(wú)水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5 min，使乙腈和水相分層。

1.4.2 QuEChERS凈化。

取4 mL上層乙腈溶液于QuEChERS離心管（含300 mg無(wú)水硫酸鎂和100 mg C18）中，渦旋混合2 min，以10 000 r/min 離心5 min，移取全部上清液于15 mL玻璃管中，45 ℃水浴，氮?dú)獯抵两?，甲醇定容? mL，渦旋混勻1 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

首先比較了ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm）、XSelect csh C18（2.5 μm，100 mm×2.1 mm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，3.0 mm×150 mm）3款色譜柱對(duì)5種PGRs的分離效果和色譜峰型的影響，結(jié)果表明，XSelect csh C18和ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱對(duì)萘乙酸的保留性能較差；而ACQUITY HPLC BEH C18色譜柱為三鍵鍵合式烷基柱，具有較寬的pH適應(yīng)性，對(duì)離子化化合物具有較強(qiáng)的選擇性，能較好地分離5種PGRs，且峰形尖銳，分析時(shí)間較短。因此，該研究選擇ACQUITY HPLC BEH C18色譜柱為分離柱。

分別比較了水-乙腈、水-甲醇體系作為流動(dòng)相時(shí)5種PGRs的分離效果，結(jié)果表明，以水-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，5種化合物出峰時(shí)間較快且分離效果和峰型較差，而以水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，5種化合物的色譜峰分離度好，峰型對(duì)稱。在流動(dòng)相中加入一定量酸，可促進(jìn)化合物電離，提高其離子化效率和靈敏度。當(dāng)加入0.1%甲酸時(shí)，能有效抑制赤霉素、萘乙酸、2，4-D中羧酸官能團(tuán)的電離，提高在流動(dòng)相中的溶解度，故該試驗(yàn)選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相。5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖如圖1所示。

2.2 提取溶劑的選擇

比較了不同試劑對(duì)5種PGRs提取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，甲醇和水作為提取溶劑時(shí)，較為渾濁，說明共萃物較多，不利于后續(xù)的凈化。而乙腈具有更強(qiáng)的極性，對(duì)5種PGRs的提取效果更佳。同時(shí)，在乙腈中添加少量的甲酸可以抑制赤霉素、萘乙酸、2，4-D中羧酸官能團(tuán)的電離，增大在乙腈中的溶解度。因此，該研究選擇1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

比較了C18柱、HLB柱和QuEChERS這3種凈化方式對(duì)5種PGRs凈化回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，HLB柱與QuEChERS的回收率相差不大，均高于C18柱，但使用固相小柱時(shí)需要先后用有機(jī)試劑活化和淋洗，有機(jī)試劑用量較大且耗時(shí)。QuEChERS凈化法具有快速、簡(jiǎn)便、有機(jī)試劑用量少、回收率高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，常用的凈化材料有C18、石墨化炭黑、無(wú)水硫酸鎂、氟羅里硅土等，可根據(jù)實(shí)際凈化樣品選擇合適的凈化材料，可操作性強(qiáng)。因此，綜合考慮，該研究采用QuEChERS凈化方法，以無(wú)水硫酸鎂和C18為凈化材料，無(wú)水硫酸鎂具有很強(qiáng)的吸水性，能去除提取溶劑里的水分，C18可以去除色素等弱極性小分子。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限和定量限

按“1.3”儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以5種PGRs的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出線性方程（表3）。結(jié)果表明，5種PGRs在1～50 ng/mL線性關(guān)系良好（R2>0.999）。

在空白紅棗樣品中添加不同濃度的5種PGRs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（n=6），按“1.4”方法處理后檢測(cè)，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限（LOD），S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），得到5種PGRs的LOD和LOQ，見表3。從表3可以看出，5種PGRs的LOD為0.1～0.2 μg/kg，LOQ為0.3～0.6 μg/kg。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

在優(yōu)化的條件下，在空白紅棗樣品中進(jìn)行5種PGRs的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為5、10和20 μg/kg，按前處理過程測(cè)定6個(gè)加標(biāo)平行樣，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表4。從表4可以看出，5種PGRs在5、10、

20 μg/kg加標(biāo)水平下的回收率分別為82.5%～106.1%、97.0%～103.5%和89.9%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.6%～6.4%、1.0%～8.4%和1.2%～5.5%，回收率和精密度均滿足分析方法的要求。

2.6 實(shí)際紅棗樣品測(cè)定

研究了當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)銷售的2個(gè)批次共20個(gè)紅棗中PGRs的殘留情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），市售紅棗中有不同程度的PGRs檢出，其中有9個(gè)樣品檢出矮壯素，檢出含量在4.98～6.32 μg/kg，有3個(gè)樣品檢出赤霉素，檢出含量在8.75～10.00 μg/kg，這可能與矮壯素和赤霉素的使用量較大相關(guān)，樣品色譜圖見圖5～6。

3 結(jié)論

采用有機(jī)溶劑為提取溶劑，QuEChERS凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定紅棗中矮壯素、赤霉素、萘乙酸、2，4-D、多效唑這5種PGRs，比較了不同提取溶劑、凈化方法對(duì)提取凈化效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，1%甲酸乙腈溶劑為提取溶劑時(shí)提取效果更好，QuEChERS凈化效果整體優(yōu)于固相柱，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析，5種PGRs得到有效分離，重現(xiàn)性好，方法檢出限和精密度均能滿足分析要求。該方法前處理簡(jiǎn)單，縮短了樣品前處理時(shí)間，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，適用于紅棗中5種PGRs的快速定性篩查及準(zhǔn)確定量測(cè)定。

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