西瓜蔓枯?。⊿tagonosporopsiscucurbitacearum）產(chǎn)孢及接種方法比較

摘要 為了明確西瓜蔓枯?。⊿tagonosporopsis cucurbitacearum）的最佳產(chǎn)孢方法和最佳接種方法，為西瓜蔓枯病抗病種質(zhì)資源的篩選與鑒定奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，圍繞西瓜蔓枯病的產(chǎn)孢及接種方法展開研究。從蔓枯病分生孢子的產(chǎn)孢時(shí)間、產(chǎn)孢量、孢子形態(tài)等方面比較2種常見的產(chǎn)孢方法，發(fā)現(xiàn)紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法與黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢法相比產(chǎn)孢時(shí)間短、產(chǎn)孢量多且穩(wěn)定、孢子形態(tài)正常、成本低，是目前西瓜蔓枯病的最佳產(chǎn)孢方法。分別用離體菌餅接種法、活體孢子懸浮液點(diǎn)接法、活體孢子懸浮液噴霧接種法接種西瓜抗感材料，從操作難易程度、準(zhǔn)確性等方面對3種接種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)3種接種方法各有優(yōu)劣。離體菌餅接種法和活體孢子懸浮液點(diǎn)接法接種后，西瓜抗感材料抗感差異明顯，而活體孢子懸浮液噴霧接種法接種后有感病材料表現(xiàn)為中抗。通過比較發(fā)現(xiàn)，離體菌餅接種法和活體孢子懸浮液點(diǎn)接法較為可靠，但離體菌餅接種法病情分級標(biāo)準(zhǔn)劃分不夠精細(xì)，材料間抗性的微小差別難以體現(xiàn)；活體孢子懸浮液點(diǎn)接法準(zhǔn)確性較高，但操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力；活體孢子懸浮液噴霧接種法操作簡單，但難以準(zhǔn)確控制接種體的量，準(zhǔn)確性一般。因此建議大批量材料進(jìn)行蔓枯病抗性鑒定時(shí)可采用活體孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行初步篩選，少量材料進(jìn)行蔓枯病抗性鑒定時(shí)可采用活體孢子懸浮液點(diǎn)接法，離體菌餅接種法可作為輔助方法進(jìn)一步驗(yàn)證接種結(jié)果。

關(guān)鍵詞 西瓜；蔓枯??；產(chǎn)孢；接種；比較

中圖分類號 S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）14-0109-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.024

Comparison of Spore Production and Inoculation Methods of Watermelon Stem Blight

BAI Tian，LIU Lu，HUANG Da-yue et al

（Huaiyin Agricultural Science Research Institute in Xuhuai District，Jiangsu Province， Huai’an，Jiangsu 223001 ）

Abstract In order to clarify the optimal spore production and inoculation methods for watermelon stem blight （Stagonosporosis cucurbitaceae），and to lay a solid foundation for the screening and identification of watermelon stem blight resistant germplasm resources，this article focuses on the spore production and inoculation methods of watermelon stem blight.Two common spore production methods were compared from the aspects of spore production time，spore yield，and spore morphology of stem blight.It was found that the UV induced spore production method had shorter spore production time，more stable spore yield，normal spore morphology，and lower cost compared to the cucumber induced spore production method.Currently，it was the best spore production method for watermelon stem blight.Watermelon resistant and susceptible materials were also inoculated with the methods of inoculum cake in vitro，spot inoculation with live spore suspension，and spray inoculation with live spore suspension，respectively.The three inoculation methods were compared in terms of operation difficulty and accuracy，and it was found that each of the three inoculation methods had advantages and disadvantages.The difference of resistance and susceptibility of watermelon resistant and susceptible materials was obvious after inoculating in vitro with cake inoculation and in vivo spore suspension spot inoculation，while the susceptible materials showed moderate resistance after inoculating in vivo spore suspension spray inoculation.Through comparison，it was found that the in vitro bacterial cake inoculation method and the live spore suspension point grafting method were more reliable，but the disease grading standards of the in vitro bacterial cake inoculation method were not precise enough，and the small differences in resistance between materials were difficult to reflect;the live spore suspension point grafting method had high accuracy，but the operation was complex，time-consuming，and labor-intensive;in vivo spore suspension spray inoculation method was simple in operation，but it was difficult to accurately control the amount of inoculum，and the accuracy was general.Therefore，it was suggested that the live spore suspension spray inoculation method could be used for preliminary screening when identifying the resistance of large quantities of materials to Fusarium wilt，and the live spore suspension spot connection method could be used when identifying the resistance of a small number of materials to Fusarium wilt，and the isolated cake inoculation method could be used as an auxiliary method to further verify the inoculation results.

Key words Watermelon;Vine wilt disease;Spore production;Vaccination;Comparison

基金項(xiàng)目 淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科研發(fā)展基金項(xiàng)目（HNY202104）；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-25）;江蘇省種業(yè)振興揭榜掛師項(xiàng)目（JBGS〔2021〕072）。

作者簡介 白甜（1996—），女，山西呂梁人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事西甜瓜種質(zhì)創(chuàng)新與抗病育種研究。*通信作者，研究員，從事西甜瓜育種及栽培技術(shù)研究。

收稿日期 2023-08-25

西瓜蔓枯病分布范圍很廣，在亞洲、歐洲、大洋洲、南美洲及非洲等世界各地區(qū)均有發(fā)生，是一種全球性的真菌病害［1-2］。西瓜整個(gè)生育期都會(huì)發(fā)生蔓枯病，侵染西瓜葉片、莖蔓和果實(shí)［3］。西瓜蔓枯病的發(fā)病率為15%～25%，嚴(yán)重時(shí)為60%～80%，該病害發(fā)生會(huì)致使西瓜減產(chǎn)15%～30%，大面積流行時(shí)可減產(chǎn)80%，對西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)以及我國的瓜類產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成極大影響［4-5］。防治西瓜蔓枯病最安全有效且經(jīng)濟(jì)的方法是培育抗病品種［6-7］?？共》N質(zhì)資源的篩選與鑒定是抗病育種工作的基礎(chǔ)，而抗病種質(zhì)資源的篩選與鑒定的關(guān)鍵是使用恰當(dāng)?shù)娜斯そ臃N方法，因此開展西瓜蔓枯病產(chǎn)孢及接種方法的研究至關(guān)重要。

西瓜蔓枯病的產(chǎn)孢和接種較為復(fù)雜，筆者對西瓜蔓枯病的2種產(chǎn)孢方法和3種人工接種方法進(jìn)行了比較，以期找到西瓜蔓枯病的最佳產(chǎn)孢和接種方法，從而省時(shí)高效地開展西瓜蔓枯病抗病種質(zhì)資源的篩選與鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜蔓枯病DB-20［Stagonosporopsis cucurbitacearum（syn.Didymella bryoniae）］由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院饋贈(zèng)。

蔓枯病抗病材料PI482276是從美國引進(jìn)的抗性材料；蔓枯病感病材料G48、G38和G22是江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜中心的穩(wěn)定自交系材料。

1.2 方法

1.2.1 西瓜蔓枯病產(chǎn)孢方法。

（1）紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法。挑取蔓枯病菌絲塊于含有磷酸二氫氨的馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，再通過4 d 間歇紫外燈（12 h紫外/12 h黑暗）處理，即可產(chǎn)生大量蔓枯病分生孢子［8-9］。

（2）黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢法。將蔓枯病菌接種于PDA固體平板培養(yǎng)基上，置于26～28 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d；選取新鮮無傷口且大小盡量一致的黃瓜，用滅菌蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇擦拭表面，晾干；用直徑0.7 cm的滅菌打孔器在黃瓜上有間隔的輕輕打孔，用滅菌刀片輕微去除打孔后形成的直徑大小為0.7 cm的黃瓜圓形表皮；用直徑0.7 cm的滅菌打孔器打蔓枯病菌餅，挑取蔓枯病菌餅置于黃瓜去除表皮的位置，菌絲面朝下且與黃瓜表皮接觸；將接種好蔓枯病菌餅的黃瓜放入接種盤中，在接種盤上包好保鮮膜，放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d即可產(chǎn)生分生孢子；用刀片刮取發(fā)病部位，研磨，然后用4層紗布過濾，得到蔓枯病菌的分生孢子懸浮液［10］。

1.2.2 西瓜蔓枯病接種方法。

（1）離體菌餅接種法。在接種盤下層鋪滿浸濕的吸水紙，剪取西瓜材料的第二片真葉，葉背朝上置于接種盤上層網(wǎng)格架，在葉柄處包裹濕潤的脫脂棉保濕；用打孔器沿蔓枯病培養(yǎng)基菌落邊緣打菌餅，將菌餅菌絲面朝下置于西瓜葉片背面，用移液槍在菌餅與葉片的接觸面加10 μL純水，用保鮮膜將接種盤包起來，置于25 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中，于接種36 h后統(tǒng)計(jì)病斑直徑。

（2）活體孢子懸浮液點(diǎn)接法。

接種步驟：西瓜材料第三片真葉完全展開后，即可接種蔓枯病菌。接菌前1 d調(diào)整生長室溫度（25±2） ℃16 h/（18±2） ℃8 h晝夜，濕度（90±10）%。苗澆足水，用保濕罩罩起保證濕度達(dá)100%。接菌時(shí)挑選長勢一致的苗子，接種采用點(diǎn)滴接菌法，用微量移液器在葉片表面點(diǎn)滴10 μL蔓枯病菌孢子懸浮液。接種部位為第1、2、3片真葉，每個(gè)葉片滴5滴病菌孢子懸浮液，每個(gè)葉片葉柄中間滴1滴，第2片葉腋處滴加1滴，每株共19個(gè)接種點(diǎn)。接種完用噴壺均勻噴灑清水保持葉片濕潤，并用保濕罩罩住，不要挪動(dòng)，防治孢子懸浮液滴落。接種后保持24 h黑暗，保濕72 h。中間持續(xù)觀察西瓜發(fā)病情況，感病材料完全發(fā)病即可揭開保濕罩，如果發(fā)病不明顯可以繼續(xù)保濕至完全發(fā)病，但保濕時(shí)間不宜超過5 d。保持生長室溫度（25±2）℃16 h/（18±2）℃8 h晝夜，濕度（90±20）%。

發(fā)病等級標(biāo)準(zhǔn)：0級無癥狀；1級接菌位置零星可見點(diǎn)狀病斑，植株長勢健康；3級接菌位置可見點(diǎn)狀病斑不擴(kuò)展，植株長勢健康；5級接菌葉片均發(fā)病且病斑擴(kuò)展，病斑面積<1/2接菌面積；7級接菌第2或第3葉片死亡或病斑擴(kuò)展連片，病斑面積>1/2接菌面積；9級接菌第2和第3葉片死亡或植株死亡。

抗性評價(jià)指標(biāo)：以病情指數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行抗性評估，病情指數(shù)（DI）=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）。西瓜材料對蔓枯病的抗性等級根據(jù)病情指數(shù)分為5級，分別為高抗（HR）0＜DI≤20；抗病（R）20＜DI≤40；中抗（MR）40＜DI≤60；感?。⊿）60＜DI≤80；高感（HS）80＜DI≤100。

（3）活體孢子懸浮液噴霧接種法。待西瓜長出3～4片真葉時(shí)將西瓜蔓枯病孢子懸浮液均勻噴灑到西瓜葉片表面直至孢子懸浮液往下滴落，接種后置于黑暗條件下18～24 h，且相對濕度保持95%以上，7～10 d開始進(jìn)行病害調(diào)查，計(jì)算平均病級［11］。

葉片發(fā)病等級標(biāo)準(zhǔn)：0級沒有肉眼可見癥狀；1級老葉上邊緣壞死或斑點(diǎn)<10 mm，新葉無癥狀；2級老葉同上，新葉邊緣壞死；3級所有葉均有感染，葉壞死面積<25%；4級25%<葉壞死面積≤50%，5級葉壞死面積>50%［11］。

抗性評價(jià)指標(biāo)：根據(jù)平均病情級別數(shù)確定蔓枯病抗性級別，高抗（HR）RI<1.0，抗（R）1.0≤RI<2.0，中抗（MR）2.0≤RI<3.0，感?。⊿）3.0≤RI<4.0，高感（HS）RI≥4.0。平均病級計(jì)算公式：RI=∑（級值×株數(shù)）/總株數(shù)［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜蔓枯病不同產(chǎn)孢方法比較

選用常用的2種西瓜蔓枯病產(chǎn)孢方法黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢法和紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法，產(chǎn)孢情況見圖1。從產(chǎn)孢時(shí)間、產(chǎn)孢量、孢子形態(tài)等方面對2種產(chǎn)孢方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢共需要14 d，紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢需要11 d；1個(gè)易感黃瓜的產(chǎn)孢量為（1.87±0.97）×108個(gè)，產(chǎn)孢量受黃瓜品種的影響，而1個(gè)平板的產(chǎn)孢量為（2.92±0.58）×108個(gè)，該方法產(chǎn)孢量穩(wěn)定；2種方式產(chǎn)生的孢子形態(tài)均正常；黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢時(shí)需購買大量黃瓜，成本較紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法稍高。比較2種常見的西瓜蔓枯病產(chǎn)孢方法可知，紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法時(shí)間較短，產(chǎn)孢量多且產(chǎn)孢穩(wěn)定，孢子形態(tài)正常，成本較低，是目前西瓜蔓枯病產(chǎn)孢的最佳方法。

2.2 西瓜蔓枯病不同接種方法比較

2.2.1 離體菌餅接種法。

以西瓜蔓枯病抗病材料PI482276、感病材料G48、G38和G22為接種對象，分別剪取每個(gè)材料的第二片真葉，接種蔓枯病DB-20的菌餅，于接種36 h后統(tǒng)計(jì)病斑直徑，接種情況見圖2。結(jié)果表明，離體菌餅接種后，抗病材料與感病材料相比，病斑明顯較小。說明該離體接種方法可行，可以區(qū)別抗感材料。

2.2.2 活體孢子懸浮液點(diǎn)接法。

以西瓜蔓枯病抗病材料PI482276、感病材料G48、G38和G22為接種對象，采用活體點(diǎn)接法進(jìn)行蔓枯病孢子懸浮液接種，于接種5 d后進(jìn)行病情等級統(tǒng)計(jì)，接種結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，孢子懸浮液活體點(diǎn)接后，抗病材料PI482276發(fā)病很輕，葉片只有少部分接種位置發(fā)黃；感病材料發(fā)病較重，莖稈發(fā)病處折斷。與感病材料相比，抗病材料病情指數(shù)明顯偏低（表2）。

2.2.3 活體孢子懸浮液噴霧接種法。

以西瓜蔓枯病抗病材料PI482276、感病材料G48、G38和G22為接種對象，采用活體孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行蔓枯病接種，于接種10 d后進(jìn)行病情等級統(tǒng)計(jì)，接種結(jié)果見表3。結(jié)果表明，活體孢子懸浮液噴霧接種后，抗病材料PI482276和感病材料G22表現(xiàn)為中抗，抗病材料G48和G38表現(xiàn)為感病。可能由于該方法接種量無法準(zhǔn)確控制，導(dǎo)致與上述2種方法的接種結(jié)果有差異。

2.2.4 不同接種方法比較。

對上述3種西瓜蔓枯病接種方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3種接種方法各有優(yōu)劣。離體菌餅接種法相對可靠，發(fā)病時(shí)間短，但離體接種病情分級標(biāo)準(zhǔn)劃分不夠精細(xì)，材料間抗性的微小差別難以體現(xiàn)；活體孢子懸浮液點(diǎn)接法操作復(fù)雜，發(fā)病時(shí)長中等，準(zhǔn)確性較高；活體孢子懸浮液噴霧接種法操作簡單，發(fā)病時(shí)長較長，由于無法準(zhǔn)確控制不同材料的接種量，導(dǎo)致接種結(jié)果準(zhǔn)確性偏低（表4）。

3 討論

西瓜蔓枯病是目前西瓜生長中最常見的病害之一，近年來該病害的發(fā)生日益嚴(yán)重，對西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重影響。選育抗蔓枯病品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效且最安全的方法，選育抗蔓枯病品種則需要進(jìn)行抗蔓枯病種質(zhì)資源的篩選與鑒定。目前關(guān)于西瓜蔓枯病的抗性鑒定大多數(shù)采用苗期人工接種法，因此開展西瓜蔓枯病產(chǎn)孢及接種方法的研究是蔓枯病人工接種的關(guān)鍵。

合適的蔓枯病產(chǎn)孢方法可以穩(wěn)定大量地產(chǎn)生孢子，這對于蔓枯病人工接種至關(guān)重要。該研究對常用的2種西瓜蔓枯病產(chǎn)孢方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法與黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢法相比產(chǎn)孢時(shí)間短、產(chǎn)孢量多且穩(wěn)定、孢子形態(tài)正常、成本低。另外，黃瓜誘導(dǎo)產(chǎn)孢法除耗時(shí)長、成本偏高外，受黃瓜品種的影響，有的品種不易產(chǎn)孢。因此筆者認(rèn)為目前西瓜蔓枯病的最佳產(chǎn)孢方法是紫外誘導(dǎo)產(chǎn)孢法。

近年來，關(guān)于西瓜蔓枯病人工接種方法采用最多的是活體孢子懸浮液噴霧接種法，但由于孢子懸浮液噴霧接種法無法準(zhǔn)確控制接種量，使接種結(jié)果缺少準(zhǔn)確性，也致使西瓜蔓枯病抗性遺傳機(jī)理尚不清晰。該研究除采用孢子懸浮液噴霧接種法外，也采用離體菌餅接種法和活體孢子懸浮液點(diǎn)接法，這2種方法與噴霧法相比，可以準(zhǔn)確控制接種量，增加接種結(jié)果的可信度。離體菌餅接種法接種后，抗病材料的病斑明顯比感病材料小，說明離體菌餅接種法也可作為蔓枯病接種的輔助驗(yàn)證方法，可用于進(jìn)一步驗(yàn)證活體接種結(jié)果?；铙w孢子懸浮液點(diǎn)接法接種后，抗病材料發(fā)病程度明顯比感病材料輕，且可以保證不同材料的接種體量一致，該方法準(zhǔn)確可信，但該接種方法中每株植株都有不少接種點(diǎn)，操作復(fù)雜。綜上所述，3種接種方法各有優(yōu)劣。筆者認(rèn)為，如果有大量材料需要進(jìn)行蔓枯病抗性鑒定，可先采用活體孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行初步篩選；根據(jù)初步篩選結(jié)果對部分感興趣的材料采用活體孢子懸浮液點(diǎn)接法，進(jìn)行準(zhǔn)確表型鑒定；而離體菌餅接種法可以用于輔助驗(yàn)證接種結(jié)果。另外，也需要繼續(xù)探索既簡單又準(zhǔn)確的接種方法。

開展西瓜材料蔓枯病抗性鑒定工作是西瓜抗蔓枯病育種工作的關(guān)鍵，采用合適的西瓜蔓枯病產(chǎn)孢方法及接種方法將為抗病育種工作的開展提供有力支持。

參考文獻(xiàn)

［1］ BASIM E，BASIM H，ABDULAI M，et al.Identification and characterization of Didymella bryoniae causing gummy stem blight disease of watermelon （Citrullus lanatus） in Turkey［J］.Crop protection，2016，90：150-156.

［2］ 程瑞，王學(xué)征，徐兵劃，等.西瓜蔓枯病抗性遺傳、基因定位及育種研究進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（1）：23-31.

［3］ 胡鳳云，莫賤友，韋繼光，等.西瓜甜瓜蔓枯病防治研究進(jìn)展［J］.中國瓜菜，2011，24（6）：40-44.

［4］ 杜公福，李漢豐，詹園鳳，等.海南西瓜蔓枯病病原菌的鑒定及8種殺菌劑對其室內(nèi)毒力測定［J］.長江蔬菜，2021（14）：65-69.

［5］ BABADOOST M，ZITTER T A.Fruit rots of pumpkin：A serious threat to the pumpkin industry［J］.Plant disease，2009，93（8）：772-782.

［6］ 易麗聰，王運(yùn)強(qiáng)，龔鈺，等.西瓜種質(zhì)抗病性的分子標(biāo)記檢測和人工接種鑒定［J］.中國瓜菜，2021，34（9）：7-14.

［7］ 黃大躍，程瑞，徐兵劃，等.西瓜蔓枯病研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（22）：1-3，6.

［8］ 李英，張永兵，WOLUKAU J N，等.甜瓜蔓枯病菌子實(shí)體法分離及A型菌株產(chǎn)孢條件研究［J］.果樹學(xué)報(bào)，2007，24（1）：84-88.

［9］ 畢研飛，徐兵劃，錢春桃，等.分子標(biāo)記輔助甜瓜抗蔓枯病基因的聚合及品種改良［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（3）：523-533.

［10］ LI P F，REN R S，YAO X F，et al.Identification and characterization of the causal agent of gummy stem blight from muskmelon and watermelon in East China［J］.Journal of phytopathology，2015，163（4）：314-319.

［11］ ZHANG Y P，KYLE M，ANAGNOSTOU K，et al.Screening melon（Cucumis melo） for resistance to gummy stem blight in the greenhouse and field［J］.HortScience，1997，32（1）：117-121.