河南口岸進(jìn)口綠豆截獲的偽粗野粉蠅鑒定

摘要 ［目的］應(yīng)用形態(tài)學(xué)分類和DNA條形碼技術(shù)鑒定入境綠豆中截獲的雌性蠅類。［方法］2023年2月23日，從裝載烏茲別克斯坦綠豆的集裝箱中截獲1只麗蠅科雌蟲，對其進(jìn)行DNA條形碼和形態(tài)鑒定，并與近似種粗野粉蠅進(jìn)行形態(tài)和條形碼比較。［結(jié)果］此次截獲蠅類為雌性偽粗野粉蠅，為河南口岸首次截獲。［結(jié)論］應(yīng)用DNA條形碼與形態(tài)分類相結(jié)合的方法可以準(zhǔn)確快速鑒定蠅類。

關(guān)鍵詞 粗野粉蠅；偽粗野粉蠅；DNA條形碼；形態(tài)鑒定

中圖分類號 S41-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）14-0066-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.014

Identification of Pollenia pediculate from Imported Mung Bean in Henan Port

ZHANG Fang，DANG Zhi-hao，MIAO Xiao-xing et al

（Zhengzhou Customs， Zhengzhou， Henan 450000）

Abstract ［Objective］ To identify the female fly intercepted from imported mung bean by morphological classification and DNA barcoding techniques. ［Method］ A female fly which were intercepted from mung bean on an container from Uzbekistan at Henan Port on February 23， 2023. And it was identified by using morphological classification and DNA barcoding techniques， and it was compared with its similar species Pollenia rudis. ［Result］ The intercepted fly was identified as Pollenia pediculate， female.It was intercepted for the first time at Henan Port. ［Conclusion］ Flies could be identified rapidly and accurately by using DNA barcoding and morphological classification.

Key words Pollenia rudis;Pollenia pediculate;DNA barcoding;Morphology identification

基金項(xiàng)目 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102110410）。

作者簡介 張芳（1985—），女，河南尉氏人，獸醫(yī)師，碩士，從事媒介生物學(xué)研究。*通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事外來入侵物種研究。

收稿日期 2023-05-17

2023年2月23日，從鄭州車站海關(guān)入境的裝載烏茲別克斯坦綠豆的集裝箱中截獲1只麗蠅科雌蟲，將其制作成針插標(biāo)本，通過形態(tài)鑒定和DNA條形碼技術(shù)與實(shí)驗(yàn)室已截獲標(biāo)本粗野粉蠅（拉丁學(xué)名Pollenia rudis，2016年4月從俄羅斯4B6485貨艙截獲）進(jìn)行DNA條形碼和形態(tài)比較，確定其為偽粗野粉蠅（Pollenia pediculata），雌性。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，該種在寧波、中山等口岸均有被截獲記錄［1-2］，但在河南并未有該蠅種的截獲記錄，從入境糧食中截獲該蟲為河南口岸首次。筆者利用分子生物學(xué)手段結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類來鑒定該蠅種，并防止其攜帶病原體造成擴(kuò)散，以期為后期在實(shí)際工作中有效鑒別偽粗野粉蠅奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用樣本為2023年2月23日在鄭州車站海關(guān)入境的烏茲別克斯坦綠豆中截獲活體雌性麗蠅科成蠅1只，將其制作成標(biāo)本，保存在鄭州海關(guān)媒介實(shí)驗(yàn)室。

1.2 形態(tài)鑒定

依據(jù)《中國蠅類》檢索表［3］，使用基恩士V-5000超景深顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并對其形態(tài)特征進(jìn)行描述。

1.3 DNA條形碼鑒定

DNA提取試劑盒購自凱杰公司，Taq酶購自大連某公司；取標(biāo)本后足1條，按照凱杰公司DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。蠅類COI擴(kuò)增引物F（COI 1490）為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，擴(kuò)增引物R（COI 2198）為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，由英杰公司合成。PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）如下：10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，Premix TaqTM 酶12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用毛細(xì)管電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

1.4 序列比對分析和發(fā)育樹構(gòu)建

擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司鄭州測序部進(jìn)行測序。用 SeqMan軟件［4］判斷COI基因序列峰圖質(zhì)量。去掉兩端引物拼接后獲得全長658 bp的序列，用于后續(xù)分析；用EditSeq軟件對所得序列進(jìn)行堿基成分分析。選取親緣關(guān)系較近的5條序列，以絲光綠蠅、反吐麗蠅和紅頭麗蠅為外群，共計(jì)9條序列使用Mega 7.0［5］軟件，選取鄰接法（neighbor-joining algorithm method，簡稱NJ法）、最大似然法（maximum likelihood method，簡稱ML法）、最小進(jìn)化法（minimum-evolution method，簡稱ME法）和最大簡約法（maximum parsimony method，MP法）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap test值選擇1 000，結(jié)合形態(tài)學(xué)和條形碼鑒定結(jié)果確定該蠅種。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

此次截獲蠅類的形態(tài)觀察見圖1。為方便后續(xù)實(shí)際工作中能快速鑒別該蠅種，現(xiàn)將該蠅種形態(tài)特征描述如下：該蠅種為雌性，體長8.0 mm左右，額鬃列外側(cè)有3行黑色小毛，頭部額和顏高約等，側(cè)額大于間額，頭前端粉被為金黃色，頰、后頭毛黑色，頰后方與下后頭覆黃毛，頰高達(dá)眼高1/2處，側(cè)顏寬側(cè)顏下端和下側(cè)顏紅棕色，且大部具毛。中顏板處覆蓋灰色粉被且略陷入，顏脊狹，新月片、鞭節(jié)為棕黃色，鞭節(jié)外側(cè)及前方黑色，顏堤下半部分為紅棕色，基部和內(nèi)側(cè)為棕黃色，梗節(jié)為鞭節(jié)的1/2，觸角短，觸角芒長羽狀，下側(cè)纖毛較短。下顎須為褐色。

胸：黑色，前盾前段覆金黃色薄粉被。胸部黃色綿毛被易擦落，胸部剛毛黑色。前中鬃和背中鬃2，后中鬃和背中鬃3，肩鬃3，肩后鬃2，翅后坡和小盾片下面均覆有黃色綿毛被，翅內(nèi)鬃1+2。下側(cè)鬃為6根。小盾片近邊緣為黑色毛，后小盾片不凸出。前胸側(cè)板中央凹陷無毛，前胸基腹片凹陷處裸，翅下大結(jié)節(jié)無毛，腹側(cè)片鬃1∶1。

前緣基鱗為棕黃色，翅前緣刺明顯且短，亞前緣骨片分布有小剛毛，肩橫脈與亞緣脈（hc-sc）結(jié)節(jié)腹面處具明顯淡色毛。m1+2脈呈角形彎曲，2R5室開放狹，約為r-m橫脈的1/3，r4+5脈基段1/2腹面具小剛毛。翅下腋瓣上面裸，黃白色。平衡棒黃色。

足呈黑色，各足股節(jié)基部均無黃毛。腹板和足中后股后面及后腹面著生黑色毛。前股后腹鬃1背鬃7；前脛后腹鬃2前背鬃6；中股前腹鬃1，后腹面僅基部有鬃列；后脛前腹面具少量倒伏黑色纖毛。

腹呈卵形且略帶暗棕色，覆有明顯灰被斑。背板腹面僅具黑色毛，第6背板短，第7背板中間膜狀部分比骨化部分寬。

為了區(qū)別相似種，將實(shí)驗(yàn)室已截獲的粗野粉蠅（Pollenia rudis）和此次截獲樣本進(jìn)行了形態(tài)比較，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，截獲蠅類肩橫脈與亞緣脈結(jié)節(jié)腹面有淡色毛，后脛前腹面僅具倒伏毛，中、后股具后腹鬃；粗野粉蠅亞緣脈與肩橫脈結(jié)節(jié)腹面無毛，后脛前腹面具大量長的直立纖毛，中、后股后腹面通常具黑毛。

地理分布：國外主要分布在大洋洲（新西蘭）；非洲（南非）；北美洲（加拿大、巴哈馬群島、美國）；歐洲（安道爾共和國、亞美尼亞 、葡萄牙、羅馬尼亞、俄羅斯、斯洛伐克、西班牙）；亞洲（南斯拉夫、沙特阿拉伯、印度、巴基斯坦）。國內(nèi)主要分布在新疆、上海、浙江等地［6］。

生態(tài)習(xí)性：該屬部分蠅類為傳粉昆蟲。偽粗野粉蠅的幼蟲能寄生蚯蚓，其成蠅一般3—10月份可在豬圈、草地、樹林、菜地等生境中采集到，偶爾也可在冬季發(fā)現(xiàn)。在北美和北歐其數(shù)量高峰期出現(xiàn)在早春，采獲成蠅地區(qū)海拔可達(dá)2 500 m［7］。

2.2 測序結(jié)果分析

測序序列經(jīng)過兩端引物掐除，獲得658 bp大小的目的序列。該序列分別在GenBank和Bold Systems v4上比對，發(fā)現(xiàn)截獲蠅類序列與GenBank中公布的偽粗野粉蠅（登錄號GU689853.1）COI序列相似度為100%，將測得的序列上傳至GenBank，獲得序列登錄號為OQ826444；在Bold Systems v4中顯示結(jié)果也是100%的偽粗野粉蠅（圖3）。

堿基成分分析結(jié)果顯示，T、A、C、G含量分別為38.50%、28.60%、16.00%、16.90%；A+T堿基的含量高達(dá)67.10%，G+C堿基含量為32.90%。此次堿基成分分析結(jié)果與昆蟲線粒體DNA中A+T含量偏高的結(jié)論［8-10］相符。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用Mega 7軟件對所測樣本序列、實(shí)驗(yàn)室已知粗野粉蠅序列和親緣關(guān)系較近、同屬于粉蠅屬的6條序列，以麗蠅科絲光綠蠅、反吐麗蠅和紅頭麗蠅為外群，共計(jì)9條序列，選取鄰接法（neighbor-joining algorithm method，簡稱NJ法）、最大似然法（maximum likelihood method，簡稱ML法）、最小進(jìn)化法（minimum-evolution method，簡稱ME法）和最大簡約法（maximum parsimony method，簡稱MP法）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4～7可知，試驗(yàn)樣本序列（GenBank登錄號為OQ826444）和偽粗野粉蠅［Pollenia hungarica（GU68853.1）］聚在一起，置信度為100%，與匈牙利粉蠅（Pollenia hungarica）、游蕩粉蠅（Pollenia vagabunda）、窄頰粉蠅（Pollenia angustigena）、粗野粉蠅（Pollenia rudis）共同聚成粉蠅屬，粉蠅屬和其他外群分開，條形碼判定該蠅為偽粗野粉蠅。

3 討論

病媒生物可攜帶乙型腦炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、黃熱病毒、鼠疫桿菌、霍亂弧菌等，給我國人民身體健康帶來嚴(yán)重危害［11］。粉蠅屬的成蟲是重要的傳粉者，因此得名Pollenia，但粉蠅屬蠅類尸體的堆積會引起人過敏，尸體可能成為皮鼬甲蟲和其他害蟲的繁殖材料，也可能是造成糞便大腸菌群污染的原因之一［12］。研究發(fā)現(xiàn)，偽粗野粉蠅（Pollenia pediculata）最早屬于P.rudis類群［13］；1987年Rognes［14-15］發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新種Pollenia pseudorudis，現(xiàn)在被認(rèn)為是 Pollenia pediculata Macquart 1834的異名，是同一個(gè)種類，最初使用的大多數(shù)標(biāo)本都是Pollenia pediculata。

資料顯示［15-16］，偽粗野粉蠅（Pollenia pediculata）在美國是很常見的種類，是常見的群集物種之一。在北美洲偽粗野粉蠅和粗野粉蠅是很常見的蠅種，據(jù)報(bào)道偽粗野粉蠅在南非

也有發(fā)現(xiàn)；每年4月和6月偽粗野粉蠅數(shù)量往往達(dá)到高峰［17］，也有報(bào)道該屬蠅種類越冬一代在4月中旬死亡，其后代在5月底和6月出現(xiàn)，其數(shù)量在7月中旬前保持較低水平，然后持續(xù)到秋季。

2014年珠江水域廣州口岸蠅類本底調(diào)查發(fā)現(xiàn)偽粗野粉蠅的記錄［18］，而河南口岸并未發(fā)現(xiàn)該物種；粉蠅屬的DNA條形碼研究也鮮有報(bào)道，僅見長陽粉蠅和粗野粉蠅等粉蠅屬個(gè)別種類的DNA條形碼鑒定［2，19］。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)，此次截獲的偽粗野粉蠅（Pollenia pediculata）是河南口岸的新紀(jì)錄種。

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