貝-魚-草生產(chǎn)型濕地沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

摘要 ［目的］研究“貝-魚-草”生產(chǎn)型濕地處理養(yǎng)殖尾水工藝中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化特征。［方法］采用Illumina-MiSeq高通量測序技術(shù)對濕地不同單元沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。［結(jié)果］幼貝高效凈化單元和高密度貝類凈化單元中的多樣性和菌群豐度明顯高于其他處理單元。在門水平分類單元上，濕地沉積物中的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。冗余分析發(fā)現(xiàn)各單元沉積物中的TP含量是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。［結(jié)論］濕地中投放的貝類可以減少沉積物中的氮磷營養(yǎng)鹽，并且通過貝類的生物擾動作用可以提高沉積物中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度，研究結(jié)果為“貝-魚-草”生產(chǎn)型濕地處理養(yǎng)殖尾水提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 養(yǎng)殖尾水；貝-魚-草生產(chǎn)型濕地；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；生物擾動作用

中圖分類號 Q938 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）14-0058-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.012

Characterization of Bacterial Community Structure in Sediments of Shellfish-fish-grass Productive Wetlands

GAO Na1，ZHAN Ming-fei2，ZHANG Huan2 et al

（1.Fisheries Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Freshwater Aquaculture and Enhancement of Anhui Province，Hefei，Anhui 230000;2.Anhui Shuiyun Environmental Protection Co.，Ltd.，Wuhu，Anhui 241000）

Abstract ［Objective］To study the bacterial community structure in sediments of “shellfish-fish-grass” productive wetlands.［Method］ The Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology was used to analyze the bacterial community structure in sediments of different units.［Result］ The diversity and richness of the bacterial community were significantly higher in the unit composed of juvenile shellfish and high-density shellfish purification unit than in the other treatment units.Proteobacteria，Chloroflexi，Acidobacteriota，Actinobacteriota and Bacteroidota were the dominant phylum of the bacterial community in the sediments.Redundancy analysis showed that the main driving factors of the change of bacterial community was the total phosphorus.［Conclusion］ The shellfish placed in the wetland can reduce the nitrogen and phosphorus content in the sediment，and the diversity and richness of the bacterial community in the sediment can be improved through the bioturbation of the shellfish，and the results of this study provide a scientific basis for the treatment of aquaculture tailwater in the “shellfish-fish-grass” productive wetlands.

Key words Aquaculture tail water;Shellfish-fish-grass productive wetlands;Bacterial community structure;Bioturbation

基金項目 安徽省重點研究與開發(fā)計劃項目（2022107020008）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計劃項目（QNYC-202108）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-46）; 安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（皖農(nóng)科函〔2021〕711號）。

作者簡介 高娜（1989—），女，安徽阜陽人，助理研究員，博士，從事分子微生物學(xué)與生物技術(shù)研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事養(yǎng)殖尾水治理研究。

收稿日期 2023-09-11

水產(chǎn)養(yǎng)殖是全球糧食安全和可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵部分，目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量占全球魚類總產(chǎn)量的50%以上，預(yù)計在未來10年中這一比例將超過60%［1］。然而高密度的養(yǎng)殖伴隨而來的水資源的過度使用、養(yǎng)殖排污、飼料浪費(fèi)、成本增加等問題［2-4］，使得當(dāng)下水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨量質(zhì)提升和綠色發(fā)展的雙重挑戰(zhàn)。

2019 年初，十部委共同提出《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的意見》，其中重點強(qiáng)調(diào)了改善養(yǎng)殖環(huán)境，推進(jìn)養(yǎng)殖尾水治理。雖然目前常用的穩(wěn)定塘和人工濕地等工藝能在一定程度上滿足養(yǎng)殖尾水的處理要求，但穩(wěn)定塘凈化系統(tǒng)存在需要較長的水力停留時間以及處理效果受天氣制約等缺陷［5］。人工濕地采用土建結(jié)構(gòu)，占地面積大，構(gòu)建和拆除的過程比較麻煩，且易受季節(jié)的影響，處理效率不高［6］。因此，在原有技術(shù)基礎(chǔ)上迫切需要高效的養(yǎng)殖尾水深度處理技術(shù)。

安徽水韻環(huán)保股份有限公司發(fā)明的“貝-魚-草”異位高效處理技術(shù)是一種以淡水貝類為核心的水質(zhì)凈化技術(shù)，它不同于傳統(tǒng)的人工濕地凈化技術(shù)，屬于改進(jìn)型人工濕地凈化系統(tǒng)，其污染物削減負(fù)荷高于傳統(tǒng)人工濕地。濕地中的貝類通過其濾水作用，吸收水體中的微藻和懸浮有機(jī)顆粒，還可通過生物擾動作用改變沉積物/水界面的物質(zhì)交換，進(jìn)而改變水生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境。

在濕地生態(tài)系統(tǒng)中，沉積物是微生物和濕地系統(tǒng)中營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)交換的載體。微生物是自然界物質(zhì)循環(huán)的主要驅(qū)動力，在全球碳、氮、硫及其他各種元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起到了關(guān)鍵作用［7］。該研究擬利用高通量測序技術(shù)研究濕地表層沉積物中細(xì)菌群落組成及分布特征，探討在不同處理單元中沉積物細(xì)菌群落對沉積環(huán)境變化的響應(yīng)，以期為“貝-魚-草”生產(chǎn)型濕地工藝高效處理養(yǎng)殖尾水提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

該研究采用的工藝流程如圖1所示，“貝-魚-草”生產(chǎn)型濕地占地5 hm2。設(shè)計日處理水量為15 000 m3/d，收集周邊連片20 hm2的青蝦養(yǎng)殖尾水。該工藝模式包括依次連接的“幼貝高效凈化單元、魚菌藻凈化單元、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘1、低密度貝類凈化單元、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘2、高密度貝類凈化單元、水下森林”等處理單元。各單元的配置如圖1所示。

1.2 沉積物的采集及理化因子分析

2023年4月中旬，分別從幼貝高效凈化單元、魚菌藻凈化單元、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘1、低密度貝類凈化單元、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘2、高密度貝類凈化單元采集沉積物樣品，命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)。采集的樣品分成2份，一份用于沉積物理化因子測定，一份用于高通量測序分析。沉積物樣品自然風(fēng)干后，參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］進(jìn)行pH、有機(jī)質(zhì)（OM）、總氮（TN）和總磷（TP）的分析。

1.3 DNA提取及高通量測序

采用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，USA）試劑盒進(jìn)行沉積物總DNA的提取。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。測序得到的原始序列通過拼接、過濾去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體后得到有效序列。利用QIIEME軟件將相似度>97%的序列定義為一個操作分類單元（OTU），采用RDP classifier對OTU進(jìn)行物種分類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用測序公司提供的在線軟件包（Majorbio cloud，https：//cloud.majorbio.com/）進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。利用MOTHUR計算α多樣性。細(xì)菌群落柱狀圖用于比較所有樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，樣本之間的相似性通過主坐標(biāo)分析（PCoA）來衡量。使用Vegan進(jìn)行環(huán)境因子與細(xì)菌群落的冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理單元中沉積物的理化性質(zhì) 從表1可以看出，沉積物理化性質(zhì)指標(biāo)TN、TP、OM的含量在生產(chǎn)型濕地處理系統(tǒng)中存在空間異質(zhì)性。魚菌藻凈化單元（S2）沉積物中的TN、TP含量最高，幼貝高效凈化單元（S1）沉積物中的TN、TP、OM含量最低。魚菌藻凈化單元中可能由于水生植物殘餌及草魚產(chǎn)生的糞便沉積導(dǎo)致較高濃度的氮磷。與李乾崗等［9］的研究一致，在幼貝高效凈化單元中，幼貝的生物擾動作用使得沉積物中相當(dāng)一部分氮磷釋放到了上覆水中，還有一部分氮、磷可能通過貝類自身的吸附作用以及微生物活動從系統(tǒng)中去除。在其他貝類凈化單元中，多采用懸浮式貝床系統(tǒng)投放貝類，減少了貝類對沉積物的擾動作用影響。

2.2 細(xì)菌群落的多樣性與空間分布

在18個沉積物樣品中，Illumina MiSeq測序共獲得432 630條有效序列，對相似性>97%的序列進(jìn)行分析，產(chǎn)生的OTU數(shù)量見表2。測序的覆蓋率大于0.940，在測序條數(shù)達(dá)到24 000條以上時，Sobs稀釋曲線基本趨向平坦（圖2），但均未達(dá)到飽和，表明測序數(shù)據(jù)合理，基本能夠覆蓋樣品中的大部分細(xì)菌，可能是由于沉積物中環(huán)境復(fù)雜，其中的物種多樣性較高，存在一些未被測序檢測到的物種。表2列出了樣品的α多樣性指數(shù)，其中Chao 1指數(shù)越大，代表物種種數(shù)越多，豐富度越高；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。從表2可以看出，幼貝高效凈化單元（S1）和高密度貝類凈化單元（S6）中的多樣性和菌群豐度明顯高于其他處理單元，表明貝類的生物擾動作用可能會提高沉積物細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。Papaspyrou等［10］研究發(fā)現(xiàn)，2種活動能力不同的沙蠶可以使得其洞穴中

的細(xì)菌多樣性較周邊底泥分別高出1.8和2.3倍。沈輝［11］

研究也發(fā)現(xiàn)文蛤和沙蠶擾動組沉積物中的細(xì)菌序列數(shù)、微生物多樣性指數(shù) Chao 1和 Shannon指數(shù)均高于空白對照組。營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘的菌群豐度和多樣性均較低，可能是由于每周投加的菌藻占據(jù)了優(yōu)勢地位，限制了其他微生物的生長。

2.3 細(xì)菌群落組成特征

濕地不同單元沉積物中共檢測到59個細(xì)菌門，所有檢測到的細(xì)菌門的相對豐度（相對豐度>0.01）如圖3所示，沉積物中的優(yōu)勢細(xì)菌門分別為變形菌門（Proteobacteria，23.71%）、綠彎菌門（Chloroflexi，14.34%）、酸桿菌門（Acidobacteriota，12.76%）、放線菌門（Actinobacteriota，9.3%）、擬桿菌門（Bacteroidota，6.86%），這與不同河流湖泊的沉積物微生物群落組成類型相似［12-13］。變形菌門是濕地中相對豐度最高的優(yōu)勢細(xì)菌門，其作為細(xì)菌中的主要部分，普遍存在于水環(huán)境沉積物中，在眾多人工濕地廢水處理工藝中發(fā)揮主導(dǎo)作用［13］。由圖3還可發(fā)現(xiàn)，綠彎菌門的相對豐度也較高，為第二大類群，在濕地不同單元沉積物樣品（S1～S6）中所占比例依次為17.82%、14.92%、24.44%、12.33%、4.61%、11.91%，綠彎菌門在包括沉積物、溫泉、產(chǎn)甲烷厭氧污泥消化池等厭氧棲息地中廣泛存在，是沉積物中氮循環(huán)的重要參與者［14］，與擬桿菌門類群中的微生物參與一系列有機(jī)化合物的降解［15］。酸桿菌門最初是在酸性沉積物環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)并命名的，但近年來有研究發(fā)現(xiàn)，不只是在酸性環(huán)境中，有些中性甚至堿性環(huán)境中也能檢測出一些酸桿菌的基因序列［16］，這與該試驗結(jié)果相同，表1顯示濕地不同單元沉積物的pH呈中性至弱堿性，酸桿菌門在不同單元的沉積物中也占據(jù)優(yōu)勢地位。

為了進(jìn)一步對細(xì)菌群落物種組成差異進(jìn)行分析，探討不同處理單元間群落細(xì)菌組成的相似性或差異性，基于 Bray-Curtis 距離算法，采用主坐標(biāo)分析法研究不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。如圖4所示，第一主軸（PC1）和第二主軸（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為41.94%和28.90%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)70.84%，濕地不同單元沉積物中細(xì)菌群落差異顯著（R=0.928 4，P=0.001），每個取樣點的 3 個重復(fù)樣本的聚集性較好，顯示出較好的重復(fù)性。營養(yǎng)轉(zhuǎn)化塘2的樣本單獨(dú)聚為一簇，魚菌藻凈化單元、低密度貝類凈化單元和高密度貝類凈化單元沉積物中細(xì)菌群落組成較相近。

2.4 環(huán)境因素對不同單元沉積物細(xì)菌群落組成的影響

為了消除環(huán)境因子之間的強(qiáng)共線性，利用方差膨脹因子分析去除沉積物總氮環(huán)境因子，保留共線性小的環(huán)境因子用于后續(xù)分析。為了探討環(huán)境因素對細(xì)菌豐度和群落組成的影響，對物種群落數(shù)據(jù)進(jìn)行去趨勢對應(yīng)分析（Detrended correspondence analysis，DCA），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），Lengths of gradient的最大數(shù)值小于3，此時適合選用線性模型中的冗余分析（RDA）來探討細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

對門水平細(xì)菌群落豐度與環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析，如圖5所示，紅色箭頭表示數(shù)量型環(huán)境因子，環(huán)境因子箭頭的長短可以代表環(huán)境因子對物種數(shù)據(jù)的影響程度。在環(huán)境因子中，TP對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響達(dá)到顯著水平（r2=0.332，P=0.046），這與徐少奇等［17］的研究結(jié)果一致，在豬場廢水表面流人工濕地處理系統(tǒng)中，TP也是影響濕地底泥細(xì)菌群落的關(guān)鍵環(huán)境因子。為進(jìn)一步研究細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性，對相對豐度前10的門水平細(xì)菌群落OTU與環(huán)境因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，并對物種和環(huán)境因子層級分別求均值進(jìn)行聚類分析，繪制門水平上物種與環(huán)境因子相關(guān)性分析熱圖（圖6）。結(jié)果表明（圖6），不同菌群受環(huán)境因子影響不同，Actinobacteriota、 Proteobacteria、Bacteroidota、Desulfobacterota和Firmicutes與TP、OM呈負(fù)相關(guān)，說明這些菌株能在氮磷元素的去除中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論

該研究在養(yǎng)殖尾水的“貝-魚-草”生產(chǎn)型濕地處理工藝中，采用高通量測序技術(shù)對濕地各處理單元沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，得出以下結(jié)論：

（1）各處理單元中魚菌藻凈化單元沉積物中的TN、TP含量最高，幼貝高效凈化單元沉積物中的TN、TP、OM含量最低。

（2）在該生產(chǎn)型濕地中，通過對細(xì)菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，幼貝高效凈化單元和高密度貝類凈化單元中的多樣性和

菌群豐度明顯高于其他處理單元，表明貝類的生物擾動作用可能會提高沉積物細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。

（3）魚菌藻凈化單元、低密度貝類凈化單元和高密度貝

類凈化單元沉積物中細(xì)菌群落組成較相近。各單元沉積物中細(xì)菌相對豐度較高的門類均為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。

（4）冗余分析發(fā)現(xiàn)各單元沉積物中的TP含量是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

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