脫細(xì)胞技術(shù)在構(gòu)建人工卵巢中的應(yīng)用進(jìn)展

[摘要]人工卵巢是天然卵巢的臨時替代品，是將分離的卵泡、卵巢基質(zhì)細(xì)胞和生長因子組合并包裹到生物材料中而形成的卵巢類器官。人工卵巢可恢復(fù)患者的生育功能和部分分泌功能，其中構(gòu)建適合卵泡生長的生物支架材料是人工卵巢的核心。脫細(xì)胞基質(zhì)材料是通過物理、化學(xué)、生物酶或其他方法有效去除組織中的細(xì)胞及核物質(zhì)，以獲得細(xì)胞外基質(zhì)。這種細(xì)胞外基質(zhì)因去除了組織中的細(xì)胞和核物質(zhì)，表現(xiàn)為低免疫原性；同時最大程度地保留了卵巢的組織結(jié)構(gòu)和功能性基質(zhì)蛋白，從而有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化。脫細(xì)胞基質(zhì)材料被認(rèn)為是目前最理想的卵巢生物支架材料。本文對脫細(xì)胞技術(shù)在構(gòu)建人工卵巢中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以更好地理解其機制和優(yōu)缺點，為進(jìn)一步優(yōu)化脫細(xì)胞技術(shù)在人工卵巢構(gòu)建中的應(yīng)用提供新思路。

[關(guān)鍵詞]人工卵巢；脫細(xì)胞技術(shù)；細(xì)胞外基質(zhì)

[中圖分類號]R711[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.032

近年來，全球腫瘤發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。放化療是惡性腫瘤治療中不可缺少的部分，而放化療會不可避免地產(chǎn)生不良反應(yīng)，如骨髓抑制和生殖毒性等。生殖毒性可導(dǎo)致絕大多數(shù)女性患者在接受放化療后出現(xiàn)卵巢早衰甚至生育功能喪失[1-2]。因此，這些患者保留生育能力的需求較為迫切。

人工卵巢是天然卵巢的臨時替代品[3]。人工卵巢在恢復(fù)患者生育功能的同時還能恢復(fù)患者的部分分泌功能。人工卵巢已成為近年來生育力保護(hù)研究的熱點，其中尋找適合卵巢細(xì)胞的生物支架材料是構(gòu)建人工卵巢的核心。脫細(xì)胞基質(zhì)材料是通過脫細(xì)胞技術(shù)有效去除組織或器官內(nèi)的細(xì)胞和核物質(zhì)，從而保留原有的組織結(jié)構(gòu)和功能性基質(zhì)蛋白，可有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化，被認(rèn)為是當(dāng)前最理想的卵巢生物支架材料[4]。脫細(xì)胞技術(shù)主要是通過物理、化學(xué)、生物酶或多種方法聯(lián)合達(dá)到去除器官或組織內(nèi)細(xì)胞及核物質(zhì)的目的[5]。脫細(xì)胞基質(zhì)材料的制備見圖1。對于卵巢脫細(xì)胞方案而言，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)的脫細(xì)胞方案，只有一組評價去除細(xì)胞效果的標(biāo)準(zhǔn)：①每毫克細(xì)胞外基質(zhì)干重的雙鏈DNA含量<50ng；②DNA片段長度<200bp；③4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色無明顯核物質(zhì)存在[6]。

1脫細(xì)胞化學(xué)試劑

1.1表面活性劑

表面活性劑是通過破壞磷脂細(xì)胞膜達(dá)到細(xì)胞溶解的目的。表面活性劑包括離子型（呈現(xiàn)正電荷或負(fù)電荷）、非離子型（含有不帶電荷的親水性基團(tuán)）及兩性型（兼具離子型及非離子型表面活性劑特征）。

1.1.1十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉是目前使用最廣泛的離子型表面活性劑，其可快速、徹底地去除器官或組織內(nèi)的細(xì)胞及核物質(zhì)；但具有一定的細(xì)胞毒性，對組織蛋白也有一定的損傷，甚至?xí)淖兘M織的微觀結(jié)構(gòu)[7-8]。受十二烷基硫酸鈉的細(xì)胞毒性影響，所有用到這類試劑的脫細(xì)胞方案都需執(zhí)行嚴(yán)格的洗滌方案，盡可能地去除殘留在材料中的化學(xué)試劑[9]。

1.1.2TritonX-100TritonX-100是一種非離子表面活性劑。TritonX-100對組織結(jié)構(gòu)的影響較小，可較好地保存組織的完整性，但其對細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖影響較大，在脫細(xì)胞過程中會造成糖胺聚糖的丟失，且單獨使用達(dá)不到組織和器官的脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)[10]?；谶@種情況，這類試劑通常是作為輔助脫細(xì)胞試劑，與其他試劑聯(lián)合使用，從而達(dá)到減少其他化學(xué)試劑的濃度和作用時間的目的。

1.1.3CHAPSCHAPS是一種兩性表面活性劑，兼具離子型及非離子型表面活性劑的特征。CHAPS的優(yōu)點是對基質(zhì)中的蛋白無影響，包括膠原蛋白、彈性蛋白及纖維蛋白，更有利于保持基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)；其缺點是會降低細(xì)胞外基質(zhì)的機械性能。CHAPS對于較薄組織的脫細(xì)胞效果理想，但對于較厚組織的單獨使用則無法達(dá)到有效脫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2酸和堿

酸堿具有強腐蝕性和強氧化性。其脫細(xì)胞原理主要通過酸堿使組織蛋白變性，讓細(xì)胞內(nèi)核酸受到破壞，進(jìn)而使細(xì)胞膜和核物質(zhì)增溶，從而達(dá)到破壞細(xì)胞的目的。酸堿對組織蛋白的破壞是對所有蛋白無差別的破壞，包括機體所需要的基質(zhì)蛋白；同時，酸堿也會改變細(xì)胞外基質(zhì)的機械性能。

1.2.1過氧乙酸過氧乙酸是一種易溶于水的弱酸，具有強腐蝕性和強氧化性。在豬膀胱源性細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維排列及雙向力學(xué)行為研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氧乙酸消毒處理的膀胱基質(zhì)的膠原排列分布發(fā)生較大變化，進(jìn)而影響基質(zhì)的機械性能[12]。同時，對基質(zhì)中的蛋白也有一定的影響，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白、糖胺聚糖及一些信號蛋白[13]。

1.2.2氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉等都易溶于水，其均是具有強腐蝕性和強氧化性的強堿性溶液。在早期脫細(xì)胞實驗中，主要用于去除樣本中的毛發(fā)[14]。Eivazkhani等[15]通過比較不同化學(xué)試劑（十二烷基硫酸鈉、氫氧化鈉）對卵巢組織的影響，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉比十二烷基硫酸鈉更適合卵巢組織脫細(xì)胞，在后期支持卵泡重建中表現(xiàn)出更好的效果。

2生物學(xué)方法

2.1生物酶

生物酶通過作用于特定蛋白破壞細(xì)胞及核物質(zhì)，主要用于脫細(xì)胞方案的進(jìn)一步優(yōu)化，脫細(xì)胞效果與組織細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征及蛋白成分有很大的相關(guān)性。其優(yōu)點是可選擇性地去除組織中的細(xì)胞及核物質(zhì)；缺點是生物酶長時間的作用會對基質(zhì)中的膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖等天然基質(zhì)成分造成一定的損害[16]。鑒于生物酶長時間的使用會對基質(zhì)蛋白造成破壞，在脫細(xì)胞處理時生物酶的使用需要嚴(yán)格把控作用時間。

2.2核酸酶

核酸酶一種作用于核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的水解酶，通過水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，將DNA或RNA裂解成多個片段，從而有效去除組織內(nèi)的核物質(zhì)。但核酸酶只針對核物質(zhì)，一般同其他脫細(xì)胞試劑聯(lián)合使用，目的是強化去除核物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，核酸酶同脫氧膽酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可極大提高組織DNA的去除率[17-18]。

3物理方法

物理方法是利用物理原理裂解細(xì)胞并破壞細(xì)胞基質(zhì)黏附蛋白，從而實現(xiàn)組織內(nèi)細(xì)胞有效去除的方法。

3.1高滲、低滲溶液

高滲和低滲溶液脫細(xì)胞的機制主要是通過滲透休克破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并形成細(xì)胞碎片，同時也可干擾DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而，這種方式可對組織內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有效破壞，但細(xì)胞破壞后形成的大量細(xì)胞碎片及核物質(zhì)卻殘留在組織內(nèi)，無法有效從基質(zhì)內(nèi)移除[19]。因此，這種方式單獨使用時的脫細(xì)胞效果欠佳，通常需同其他方法聯(lián)合使用。

3.2凍融循環(huán)

凍融循環(huán)通常是指在-80℃和37℃之間反復(fù)進(jìn)行冷凍-解凍交替循環(huán)，在凍融過程中組織或器官內(nèi)細(xì)胞不斷形成冰晶，破壞細(xì)胞膜，從而實現(xiàn)細(xì)胞的破壞[20]。在具體的脫細(xì)胞方案中，可通過改變溫度差或改變凍融的次數(shù)尋找最合適的凍融溫度和凍融次數(shù)。甚至有文獻(xiàn)報道可將凍融循環(huán)持續(xù)整個脫細(xì)胞過程，得到的細(xì)胞外基質(zhì)并不會因為凍融循環(huán)次數(shù)的增加而增加蛋白的丟失[21]。但單獨的凍融循環(huán)無法有效去除組織內(nèi)殘留的核物質(zhì)，需同其他方法聯(lián)合使用才能達(dá)到較好的脫細(xì)胞效果。

3.3高靜水壓

高靜水壓是指對組織或器官施加600MPa以上的壓力，通過高強度壓力破壞組織或器官細(xì)胞[6]。高靜水壓脫細(xì)胞時，較高的靜水壓破壞細(xì)胞的效果較好，但同時也會引起基質(zhì)蛋白的變形，從而影響基質(zhì)的機械性能。因此，高靜水壓的水壓必須控制在一定壓力之下，以確保不引起基質(zhì)蛋白的機械性能改變。

3.4超臨界二氧化碳

超臨界流體具有似液體的密度及似氣體的擴散系數(shù)，其臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.40MPa，與生物體系相容。超臨界流體的優(yōu)點是可在類似于臨界點受控速度通過組織時，將組織中的細(xì)胞移除，可將組織的機械性能的破壞降到最低[22]。此外，二氧化碳是一種具有擴散性的氣體，不會殘留在組織內(nèi)，因此不需要洗滌過程。然而，超臨界二氧化碳是非極性的，在對細(xì)胞膜等極性物質(zhì)進(jìn)行溶解時，需要添加極性夾帶劑（如乙醇），但添加這種新的夾帶劑會給組織引入新的雜質(zhì)[23]。對于超臨界流體，目前已應(yīng)用于多個臟器及組織的脫細(xì)胞處理中，并取得良好效果。在大鼠心臟組織、豬角膜、豬和牛心包及人類脂肪組織等方面，都已有明確報道成功應(yīng)用超臨界流體方法對組織進(jìn)行有效脫細(xì)胞的案列，同時保留了組織的結(jié)構(gòu)和機械性能[24-27]。

3.5溫度

溫度主要是通過影響其他脫細(xì)胞試劑、酶及蛋白的活性間接影響脫細(xì)胞效果。不同溫度可能會導(dǎo)致蛋白含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Hashimoto等[28]在對角膜進(jìn)行脫細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，角膜在不同溫度條件下脫細(xì)胞得到的脫細(xì)胞基質(zhì)中的膠原和糖胺聚糖含量存在差異，10℃比30℃的保存效果更好。

4程序性細(xì)胞死亡

程序性細(xì)胞死亡是通過傳送合適的信號，有意激活細(xì)胞凋亡路徑。整個程序性死亡只是以組織內(nèi)的細(xì)胞為目標(biāo)，從而使組織內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)得以完整保留[29]。與傳統(tǒng)的脫細(xì)胞方式不同，在程序性細(xì)胞死亡過程中，細(xì)胞沒有被破壞，而核物質(zhì)是被包裹在細(xì)胞膜或凋亡小體內(nèi)的[30]。因此，材料具有免疫原性的細(xì)胞成分或核物質(zhì)成分均不會向基質(zhì)中泄露，從而有效降低材料免疫排斥的發(fā)生[31-32]。通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡得到的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)還有一個潛在的優(yōu)勢，即通過刺激鄰近祖細(xì)胞的增殖參與組織再生[33]。

5小結(jié)與展望

人工器官是近幾年的研究熱點，其可有效解決移植器官來源緊缺的問題，同時可有效減少因器官移植后長期免疫抑制治療對患者生活質(zhì)量的影響，在骨骼、血管、皮膚等領(lǐng)域獲得了很好的效果。

人工卵巢領(lǐng)域的研究起步相對較晚，2015年Laronda等[34]才首次將脫細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建卵巢生物支架材料。通過眾多研究者的不斷探索，卵巢脫細(xì)胞技術(shù)已取得很大進(jìn)展，已先后獲得鼠、豬、牛和人等卵巢組織脫細(xì)胞基質(zhì)。但就目前的卵巢脫細(xì)胞技術(shù)而言，仍存在諸多問題。如脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)核物質(zhì)殘留、脫細(xì)胞過程對基質(zhì)的改變（包括基質(zhì)功能蛋白的損傷、生物力學(xué)性能的改變以及細(xì)胞毒性作用）等。同時，人工卵巢也引發(fā)了一些倫理問題，如卵巢組織來源及捐贈者的知情同意和隱私保護(hù)，關(guān)于個人遺傳信息保護(hù)和隱私保護(hù)，人工卵巢使用對象的公平和公正等倫理問題。希望通過對人工卵巢這項新的醫(yī)療治療手段進(jìn)行各方利益和權(quán)益的權(quán)衡，采取一系列措施確保其使用的安全、合法及符合倫理要求。相信在不久的將來，隨著研究者對各個環(huán)節(jié)關(guān)鍵技術(shù)的突破，將人工卵巢應(yīng)用到臨床中并為卵巢衰竭患者提供新的治療方案。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] LEESJ，SCHOVERLR，PARTRIDGEAH，etal.AmericanSocietyofClinicalOncologyrecommendationsonfertilitypreservationincancerpatients[J].JClinOncol，2006，24（18）：2917–2931.

[2] STROUDJS，MUTCHD，RADERJ，etal.Effectsofcancertreatmentonovarianfunction[J].FertilSteril，2009，92（2）：417–427.

[3] CHOE，KIMYY，NOHK，etal.Anewpossibilityinfertilitypreservation：Theartificialovary[J].JTissueEngRegenMed，2019，13（8）：1294–315.

[4] PEIM，LIJT，SHOUKRYM，etal.Areviewofdecellularizedstemcellmatrix：Anovelcellexpansionsystemforcartilagetissueengineering[J].EurCellMater，2011，22：333–343.

[5] RANAD，ZREIQATH，BENKIRANE-JESSELN，etal.Developmentofdecellularizedscaffoldsforstemcell-driventissueengineering[J].JTissueEngRegenMed，2017，11（4）：942–965.

[6] GILPINA，YANGY.Decellularizationstrategiesforregenerativemedicine：Fromprocessingtechniquestoapplications[J].BiomedResInt，2017，2017：9831534.

[7] O'NEILLJD，ANFANGR，ANANDAPPAA，etal.Decellularizationofhumanandporcinelungtissuesforpulmonarytissueengineering[J].AnnThoracSurg，2013，96（3）：1046–1056.

[8] ZHOUJ，F(xiàn)RITZEO，SCHLEICHERM，etal.Impactofheartvalvedecellularizationon3-Dultrastructure，immunogenicityandthrombogenicity[J].Biomaterials，2010，31（9）：2549–2554.

[9] ALSHAIKHAB，PADMAAM，DEHLINM，etal.Decellularizationandrecellularizationoftheovaryforbioengineeringapplications;studiesinthemouse[J].ReprodBiolEndocrinol，2020，18（1）：75.

[10] GRAUSSRW，HAZEKAMPMG，OPPENHUIZENF，etal.Histologicalevaluationofdecellularisedporcineaorticvalves：Matrixchangesduetodifferentdecellularisationmethods[J].EurJCardiothoracSurg，2005，27（4）：566–571.

[11] PETERSENTH，CALLEEA，COLEHOURMB，etal.Matrixcompositionandmechanicsofdecellularizedlungscaffolds[J].CellsTissuesOrgans，2012，195（3）：222–231.

[12] GILBERTTW，WOGNUMS，JOYCEEM，etal.Collagenfiberalignmentandbiaxialmechanicalbehaviorofporcineurinarybladderderivedextracellularmatrix[J].Biomaterials，2008，29（36）：4775–4782.

[13] GILBERTTW，F(xiàn)REUNDJM，BADYLAKSF.QuantificationofDNAinbiologicscaffoldmaterials[J].JSurgRes，2009，152（1）：135–139.

[14] PRASERTSUNGI，KANOKPANONTS，BUNAPRASERTT，etal.Developmentofacellulardermisfromporcineskinusingperiodicpressurizedtechnique[J].JBiomedMaterResBApplBiomater，2008，85（1）：210–219.

[15] EIVAZKHANIF，ABTAHINS，TAVANAS，etal.Evaluatingtwoovariandecellularizationmethodsinthreespecies[J].MaterSciEngCMaterBiolAppl，2019，102：670–682.

[16] YANGM，CHENCZ，WANGXN，etal.Favorableeffectsofthedetergentandenzymeextractionmethodforpreparingdecellularizedbovinepericardiumscaffoldfortissueengineeredheartvalves[J].JBiomedMaterResBApplBiomater，2009，91（1）：354–361.

[17] PICCOLIM，URBANIL，ALVAREZ-FALLASME，etal.Improvementofdiaphragmaticperformancethroughorthotopicapplicationofdecellularizedextracellularmatrixpatch[J].Biomaterials，2016，74：245–255.

[18] SYEDO，WALTERSNJ，DAYRM，etal.Evaluationofdecellularizationprotocolsforproductionoftubularsmallintestinesubmucosascaffoldsforuseinoesophagealtissueengineering[J].ActaBiomater，2014，10（12）：5043–5054.

[19] GIRALDO-GOMEZDM，LEON-MANCILLAB，DELPRADO-AUDELOML，etal.Trypsinasenhancementincyclicaltrachealdecellularization：Morphologicalandbiophysicalcharacterization[J].MaterSciEngCMaterBiolAppl，2016，59：930–937.

[20] GUPTASK，MISHRANC，DHASMANAA.Decellularizationmethodsforscaffoldfabrication[J].MethodsMolBiol，2018，1577：1–10.

[21] CRAPOPM，GILBERTTW，BADYLAKSF.Anoverviewoftissueandwholeorgandecellularizationprocesses[J].Biomaterials，2011，32（12）：3233–3243.

[22] GARCíA-GARETAE，ABDULDAIEMY，SAWADKARP，etal.Decellularisedscaffolds：justaframework？Currentknowledgeandfuturedirections[J].JTissueEng，2020，11：2041731420942903.

[23] GOHSK，BERTERAS，OLSENP，etal.Perfusion-decellularizedpancreasasanatural3Dscaffoldforpancreatictissueandwholeorganengineering[J].Biomaterials，2013，34（28）：6760–6772.

[24] HALFWERKFR，ROUWKEMAJ，GOSSENJA，etal.Supercriticalcarbondioxidedecellularisedpericardium：Mechanicalandstructuralcharacterisationforapplicationsincardio-thoracicsurgery[J].JMechBehavBiomedMater，2018，77：400–407.

[25] HUANGYH，TSENGFW，CHANGWH，etal.Preparationofacellularscaffoldforcornealtissueengineeringbysupercriticalcarbondioxideextractiontechnology[J].ActaBiomater，2017，58：238–243.

[26] SEOY，JUNGY，KIMSH.DecellularizedheartECMhydrogelusingsupercriticalcarbondioxideforimprovedangiogenesis[J].ActaBiomater，2018，67：270–281.

[27] WANGJK，LUOB，GUNETAV，etal.Supercriticalcarbondioxideextractedextracellularmatrixmaterialfromadiposetissue[J].MaterSciEngCMaterBiolAppl，2017，75：349–358.

[28] HASHIMOTOY，F(xiàn)UNAMOTOS，SASAKIS，etal.Preparationandcharacterizationofdecellularizedcorneausinghigh-hydrostaticpressurizationforcornealtissueengineering[J].Biomaterials，2010，31（14）：3941–3948.

[29] BOURGINEPE，PIPPENGERBE，TODOROVAJR，etal.Tissuedecellularizationbyactivationofprogrammedcelldeath[J].Biomaterials，2013，34（26）：6099–6108.

[30] KUROSAKAK，TAKAHASHIM，WATANABEN，etal.Silentcleanupofveryearlyapoptoticcellsbymacrophages[J].JImmunol，2003，171（9）：4672–4679.

[31] SAVILLJ，F(xiàn)ADOKV.Corpseclearancedefinesthemeaningofcelldeath[J].Nature，2000，407（6805）：784–788.

[32] YOUNGKA，DILLINGDF.Thefutureoflungtransplantation[J].Chest，2019，155（3）：465–473.

[33] PENNAROSSAG，GHIRINGHELLIM，GANDOLFIF，etal.Creationofabioengineeredovary：Isolationoffemalegermlinestemcellsfortherepopulationofadecellularizedovarianbioscaffold[J].MethodsMolBiol，2021，2273：139–149.

[34] LARONDAMM，JAKUSAE，WHELANKA，etal.Initiationofpubertyinmicefollowingdecellularizedovarytransplant[J].Biomaterials，2015，50：20–29.

（收稿日期：2023–08–07）

（修回日期：2024–06–08）