基于Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)探討新加二甲地黃湯對PCOS模型大鼠卵泡發(fā)育的影響

[摘要]目的探討經(jīng)新加二甲地黃湯干預后的多囊卵巢綜合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）模型大鼠的卵泡發(fā)育情況及其可能存在的效應(yīng)機制。方法篩選28只擁有規(guī)律動情周期的雌性SD大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、中藥組及西藥組，每組7只。除正常對照組外，其余三組均連續(xù)予來曲唑-羧甲基纖維素混懸液0.1mg/（kg·d）灌胃，以構(gòu)建PCOS大鼠模型。自第22天起，中藥組以新加二甲地黃湯5.268g/（kg·d）灌胃，西藥組以炔雌醇環(huán)丙孕酮片0.286mg/（kg·d）灌胃，正常對照組及模型組均以10ml/（kg·d）蒸餾水灌胃。3周后比較各組大鼠卵巢系數(shù)，蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)學改變，對各組大鼠血清激素均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測，蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢親吻素（kisspeptin，Kp）、G蛋白偶聯(lián)受體54（G-protein-coupledreceptor54，GPR54）蛋白表達水平。結(jié)果與正常對照組比較，模型組大鼠卵巢內(nèi)呈現(xiàn)為囊狀擴張和閉鎖的卵泡增多，其顆粒細胞層數(shù)變少，卵巢系數(shù)增大；血清睪酮（testosterone，T）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、Kp水平升高；血清卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（estradiol，E2）水平及大鼠卵巢組織中Kp、GPR54蛋白表達均顯著降低（P<0.05）。予中藥干預后，與模型組比較，中藥組大鼠卵巢囊樣擴張卵泡數(shù)量變少，顆粒細胞的層數(shù)增多，存在近成熟的卵泡，并見少量黃體存在；大鼠血清LH、T、Kp水平下降，血清FSH、E2水平及卵巢Kp、GPR54蛋白表達顯著升高（P<0.05）。結(jié)論PCOS模型大鼠的卵泡發(fā)育情況經(jīng)新加二甲地黃湯干預后得以改善，該治療機制可能為通過調(diào)控Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)影響FSH和LH的釋放，以此影響激素含量，調(diào)整卵巢功能，使卵泡發(fā)育和排卵能力得以改善。

[關(guān)鍵詞]新加二甲地黃湯；多囊卵巢綜合征；G蛋白偶聯(lián)受體54；Kisspeptin；性激素

[中圖分類號]R711[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.020

ExploringtheeffectofXinjiaErjiaDihuangTangonfolliculardevelopmentinPCOSmodelratsbasedontheKisspeptin/GPR54system

SHIMingqing1，WANGJin1，XUXiaoyu2，LANGuancui1

1.DepartmentofObstetricsandGynecology，LishuiHospitalofTraditionalChineseMedicine，Lishui323000，Zhejiang，China;2.TheThirdClinicalSchoolofMedicineSchool，ZhejiangChineseMedicineUniversity，Hangzhou310053，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethedevelopmentoffolliclesinpolycysticovarysyndrome（PCOS）modelratstreatedwithXinjiaErjiaDihuangTanganditspossiblemechanism.MethodsTwenty-eightfemaleSDratswithregularestrouscyclewereselectedandrandomlydividedintonormalcontrolgroup，modelgroup，ChinesemedicinegroupandWesternmedicinegroup，with7ratsineachgroup.Inadditiontothenormalcontrolgroup，theotherthreegroupswerecontinuouslygiven0.1mg/（kg·d）ofletrozole-carboxymethylcellulosesuspensiontoconstructthePCOSratmodel.Sincethe22ndday，thetraditionalChinesemedicinegroupwasgiven5.268g/（kg·d）ofXinjiaErjiaDihuangTang，thewesternmedicinegroup&nbsp;wasgiven0.286mg/（kg·d）ofethinylestradiolcyproteronetablet，andthenormalcontrolgroupandmodelgroupweregiven10ml/（kg·d）ofdistilledwater.After3weeks，theovariancoefficientsoftheratsinallgroupswerecompared，andthemorphologicalchangesoftheovariantissuesoftheratsinallgroupswereobservedbyhematoxylin-eosinstaining.Theserumhormonesoftheratsinallgroupsweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay，andtheovariankisspeptin（Kp）andG-protein-coupledreceptors（GPR54）proteinexpressionlevelsweredetectedbyWesternblot.ResultsComparedwiththenormalcontrolgroup，thefolliclesintheovaryofthemodelgroupshowedmorecysticdilatationandatresia，andthenumberofgranularcelllayersdecreased，theovariancoefficientofthemodelgroupwasincreased;Serumlevelsoftestosterone（T），luteinizinghormone（LH）andKpwereincreasedinmodelgroup;Serumlevelsoffolliclestimulatinghormone（FSH）andestradiol（E2）andproteinexpressionsofKpandGPR54inovariantissueofratsinthemodelgroupweresignificantlydecreased（P<0.05）.AftertreatmentwithChinesemedicine，comparedwiththemodelgroup，thenumberoffolliclesintheChinesemedicinegroupdecreased，thelayernumberofgranulosacellsincreased，therewerenearlymaturefollicles，andasmallamountofcorpusluteumexisted，serumLH，TandKplevelsweredecreased，serumFSHandE2levelsandovarianKpandGPR54proteinexpressionsweresignificantlyincreased（P<0.05）.ConclusionThedevelopmentoffolliclesinPCOSmodelratswasimprovedbytheinterventionofXinjiaErjiaDihuangTang.ThetherapeuticmechanismmaybetoaffectthereleaseofFSHandLHbyregulatingKisspeptin/GPR54system，soastoaffecthormonecontent，adjustovarianfunction，andimprovefollicledevelopmentandovulationability.

[Keywords]XinjiaErjiaDihuangTang;Polycysticovarysyndrome;G-protein-coupledreceptor54;Kisspeptin;Sexhormones

多囊卵巢綜合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是生殖內(nèi)分泌缺陷類疾病，常伴有代謝功能失調(diào)，發(fā)病率5%～20%[1]。PCOS是干擾卵泡發(fā)育及排卵而致無排卵性不孕的關(guān)鍵原因之一[2]。PCOS病因復雜，病機尚未完全明確，主要與下丘腦-垂體-性腺軸功能失衡相關(guān)[3]。而親吻素（kisspeptin，Kp）作為該軸上可刺激促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasinghormone，GnRH）神經(jīng)元的因子，通過調(diào)控GnRH的分泌，進而引發(fā)生殖軸后續(xù)的激素變化及反饋[4-5]。針對PCOS的發(fā)生、發(fā)展，國內(nèi)外大量的臨床研究和相關(guān)動物實驗證實Kp的異常分泌與其存在密切聯(lián)系[6-8]。

筆者在長期工作中使用二甲地黃湯治療PCOS，并通過加減逐漸演變成新加二甲地黃湯，臨床發(fā)現(xiàn)新加二甲地黃湯可調(diào)節(jié)PCOS患者的內(nèi)分泌功能，促卵泡發(fā)育和排卵，但并未清楚其中具體的作用機制。本研究選取PCOS大鼠作為研究對象，基于卵巢Kisspeptin/G蛋白偶聯(lián)受體54（G-protein-coupledreceptor54，GPR54）系統(tǒng)，探討新加二甲地黃湯改善卵泡發(fā)育的可能作用機制。

1實驗材料

1.1材料

28只6周齡雌性SD大鼠均購自上海西普必凱實驗動物有限公司，本研究動物許可證號為SCXK（滬）2022-0004。本研究經(jīng)上海市軒祎實驗中心倫理委員會審批通過（倫理審批號：RSXY-2022-00327）。

1.2實驗藥物

新加二甲地黃湯：炙龜板、炙鱉甲、熟地黃、淮山藥、山茱萸、菟絲子、茯苓、丹皮、蓮子心，以上藥材一次性購于麗水市中醫(yī)院。將以上中草藥材放于罐中浸泡，浸泡時間為1h，煎藥方法為先用武火將其煮沸，再以文火煎煮20min；過濾，再以相同方法復煮2次，最后混合中藥濾液，在55～60℃水浴中濃縮，使1ml的中草藥液相當于該生藥2.14g。待煎劑冷卻后，置于4℃環(huán)境中保存。

其他藥物：炔雌醇環(huán)丙孕酮片（批準文號：國藥準字J20100003，生產(chǎn)單位：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，規(guī)格：0.5g/片）、來曲唑片（批準文號：國藥準字H19991001，生產(chǎn)單位：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：2.5mg/片）、羧甲基纖維素購自上海源葉生物科技有限公司（批號：M16GS148501）。

1.3實驗試劑

大鼠卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH）、大鼠黃體生成素（luteinizing&nbsp;hormone，LH）、大鼠睪酮（testosterone，T）、大鼠雌二醇（estradiol，E2）及大鼠Kp酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）測定試劑盒購自上海美軒生物有限公司，生產(chǎn)批號：MEXN-R0367、MEXN-R0025、MEXN-R0061、MEXN-R0327、MEXN-R1036；兔抗磷酸甘油醛脫氫酶單克隆抗體（稀釋比例1∶5000）、兔抗GPR54單克隆抗體（稀釋比例1∶1000）及兔抗Kp單克隆抗體（稀釋比例1∶1000）購自美國CST公司，貨號：5174、18375-1-ap、15505-1-ap；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白和二喹啉甲酸（bicinchoninicacidassay，BCA）蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20221105；預染蛋白分子量標準購自加拿大Fermentas公司，貨號：SM0671；丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺購自美國Amresco公司，生產(chǎn)批號：20220815、20220926。

1.4實驗儀器

酶標儀購自北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM9602；RM2145型冰凍切片機購自德國LEICA公司；JB-P5型包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；LW300LFT-LED型生物顯微鏡購自上海測維光電技術(shù)有限公司；MultSkanMK3型酶標儀購自美國Thermo公司；Mini-PROTEANTetreCell小型電泳槽、PowerPaceBasicPowerSupply基礎(chǔ)電泳儀、MiniTrans-BlotElectrophoreticTransferCell小型轉(zhuǎn)應(yīng)槽購自美國BIO-RAD公司，儀器型號：165-8001、164-5050、170-3930。

2實驗方法

2.1構(gòu)建PCOS大鼠模型

將6周齡雌性SD大鼠予來曲唑0.1mg/（kg·d）灌胃，共21d。按文獻[9]的方法，通過陰道涂片檢測大鼠動情周期，觀察卵巢形態(tài)及體質(zhì)量變化，檢測血清激素水平等，最終選取符合PCOS標準的大鼠模型。

2.2分組與給藥

28只雌性大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、西藥組、中藥組，每組7只。西藥組：炔雌醇環(huán)丙孕酮0.005mg/（kg·d），相當于成人臨床劑量的10倍，將炔雌醇環(huán)丙孕酮配制成0.0286mg/ml的溶液，以1ml/100g劑量灌胃[10]；中藥組：新加二甲地黃湯5.268g/（kg·d），相當于成人劑量的10倍，新加二甲地黃湯濃縮液配成0.526g/ml液體，以1ml/100g灌胃；灌胃頻次1次/d，接連灌胃21d；正常對照組與模型組大鼠以等體積量蒸餾水灌胃。

2.3取材

選取經(jīng)陰道涂片提示處于動情期的大鼠，測量體質(zhì)量。大鼠腹腔內(nèi)注射水合三氯乙醛溶液進行麻醉，從心臟取血進行離心，取上清液用于檢測血清激素含量。取出大鼠兩側(cè)卵巢用0.9%生理鹽水洗凈，一個用蘇木精-伊紅染色（ematoxylinandeosinstaining，HE染色），于4%多聚甲醛中固定；另一個保存于有液氮的冷存管內(nèi)備用。

2.4HE染色

將大鼠卵巢制成石蠟切片，在常規(guī)梯度乙醇下脫蠟至水，進行HE染色；再予梯度乙醇脫水，待二甲苯完全透明后，使用中性樹膠封堵。最后用顯微鏡觀察四組大鼠卵巢組織的形態(tài)變化。

2.5ELISA檢測大鼠血清中T、FSH、LH、E2及Kp水平

大鼠血樣本靜置30min，以3500轉(zhuǎn)/min離心，取上層血清根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測T、FSH、LH、E2及Kp。將10μm樣品及40μm樣品稀釋液分別加入樣本孔，溫育洗滌后，加入酶標試劑及顯色劑，再加入終止液，靜置15min。用波長450nm進行吸光度測量，最終對血清中各激素水平進行計算和分析。

2.6蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠卵巢組織中Kp及GPR54蛋白表達水平

提取大鼠卵巢組織中的蛋白，應(yīng)用BCA蛋白檢測試劑盒，按說明書對各組大鼠的蛋白濃度進行檢測。將蛋白樣品與緩沖液充分混勻后，取出80mg混合液，采用半濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到0.22pm聚偏二氟乙烯膜上，一抗?jié)舛菿p稀釋比例1∶1000，GPR54稀釋比例1∶1000，羊抗兔二抗?jié)舛?∶5000。應(yīng)用增強型化學發(fā)光試劑盒進行曝光，ImageJ軟件對免疫印跡結(jié)果進行分析。

2.7統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1各組大鼠卵巢組織的形態(tài)學變化

大鼠卵巢組織經(jīng)HE染色后，正常對照組可見皮質(zhì)部內(nèi)存有發(fā)育程度不一的卵泡，顆粒細胞布列有序、緊密，結(jié)構(gòu)完備，層數(shù)多為6～8；模型組大鼠皮質(zhì)內(nèi)未觀察到已成熟卵泡，而內(nèi)見數(shù)量較多的閉鎖卵泡呈現(xiàn)為囊樣擴張，且空囊腔較大、數(shù)量較多，該顆粒細胞層稀薄，分布松散、紊亂；中藥組大鼠卵巢內(nèi)呈囊狀改變的卵泡數(shù)量變少，顆粒細胞層增厚，除出現(xiàn)卵冠丘復合體的近成熟卵泡外，還可看到其內(nèi)有黃體。見圖1。

3.2新加二甲地黃湯對PCOS大鼠卵巢指數(shù)的影響

造模21d后，模型組大鼠卵巢指數(shù)[（1.22±0.10）mg/g]較正常對照組[（0.82±0.13）mg/g]明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，中藥組[（0.78±0.08）mg/g]及西藥組[（0.80±0.10）mg/g]大鼠卵巢指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3.3新加二甲地黃湯對PCOS大鼠激素水平的影響

造模21d后，與正常對照組比較，模型組大鼠血清LH、T、Kp水平明顯升高（P<0.05），E2、FSH水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組及西藥組大鼠LH、T、Kp水平下降（P<0.05）；與模型組比較，中藥組及西藥組大鼠FSH、E2水平升高（P<0.05）。見表1。

3.4新加二甲地黃湯對PCOS大鼠卵巢中Kp、GPR54蛋白表達的影響

造模21d后，模型組大鼠卵巢中Kp及GPR54蛋白表達灰度值[（0.606±0.131），（0.415±0.106）]較正常對照組[（1.575±0.178），（1.918±0.065）]明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，中藥組（1.404±0.094）及西藥組（1.086±0.052）大鼠卵巢中Kp蛋白表達灰度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，中藥組（1.372±0.177）及西藥組（1.060±0.091）大鼠卵巢中GPR54蛋白表達灰度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

4討論

中醫(yī)理論認為PCOS的發(fā)病主要在于腎虛，因受先天稟賦不足的影響，使腎陰之濡養(yǎng)、腎陽之溫化及腎氣之推動功能受損[11-12]；加之因乙癸同源，肝腎之精與血皆源于水谷精微，故可互生。腎水為肝木之母，水潤則木得涵養(yǎng)以升發(fā)，若水乏則木燥使得條達受制；肝體陰而用陽，郁久易化火，火易煉水，使腎水愈虧；精血化生愈難以充滿沖任血海，胞絡(luò)失精血所養(yǎng)，胞宮經(jīng)血滿溢無能，故婦女可出現(xiàn)月水稀發(fā)，甚則經(jīng)閉；腎氣鼓動血行失職，肝疏泄氣機失司，氣血通行受限，氣滯血阻，沖任不暢，胞絡(luò)阻滯，導致排卵障礙。因此中醫(yī)認為PCOS疾病的發(fā)生主要在腎、肝、脾的功能失衡，故治療上，主要為補益肝腎的陰血。根據(jù)調(diào)周法理念，主要以月經(jīng)后期養(yǎng)陰為基礎(chǔ)，輔以健脾利濕、化痰散瘀，佐以疏肝理氣[13]。新加二甲地黃湯源自《中醫(yī)臨床婦科學》[14]，并通過加減化裁而成，方中以炙龜板、炙鱉甲及熟地黃為君藥，其中炙龜板、炙鱉甲用以滋陰潛陽兼散結(jié)，熟地黃以益精填髓、補腎養(yǎng)肝、滋陰養(yǎng)血為主，淮山藥與山茱萸均可益腎。前者兼健脾，后者兼養(yǎng)肝，兩者共為臣藥，使腎、肝、脾三臟皆得助。予菟絲子佐以調(diào)補腎中之陰陽，使滋腎陰又助腎陽。旨在遵循“陽中求陰”之意。茯苓健脾益氣兼滲濕，入脾經(jīng)，丹皮清泄肝火又化瘀，歸肝經(jīng)，加蓮子心以安心寧神且清心，歸心經(jīng)，三藥共為本方使藥。全方共施補腎養(yǎng)陰、疏肝健脾寧心之妙用。且經(jīng)研究表明補腎之品具有調(diào)節(jié)和改善女性卵巢功能的作用[15-16]。本課題組臨床研究予新加二甲地黃湯治療PCOS患者，證實該方不僅可調(diào)整患者的月經(jīng)情況，還可調(diào)節(jié)患者的生殖激素水平及促卵泡發(fā)育和排卵[17]；但具體作用機制尚未明確。

本研究應(yīng)用來曲唑灌胃人工誘導建立PCOS大鼠模型，陰道涂片結(jié)果提示大鼠喪失動情周期規(guī)律；血清LH、T水平升高，經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)卵巢組織內(nèi)呈囊狀改變的卵泡數(shù)量增多、卵泡顆粒細胞明顯稀疏、黃體個數(shù)變少。與文獻結(jié)果一致，且與PCOS的體征及診斷標準相符，說明應(yīng)用以上建模方法較為成功地復刻了PCOS的相關(guān)特征[18-19]。

PCOS的病因復雜且多變，其致病機制目前尚未完全明晰，但經(jīng)研究證實可能與下丘腦-垂體-卵巢（hypothalamic-pituitaryovary，HPO）軸的功能紊亂及腦內(nèi)GnRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能障礙有關(guān)[20]。PCOS患者LH、FSH值升高是由于GnRH脈沖式傳導頻次增多和LH對GnRH的高應(yīng)答，引起HPO軸功能紊亂，從而影響PCOS患者卵泡發(fā)育[21]。另外，LH脈沖釋放頻率可受過度活躍的GnRH神經(jīng)元的影響而增加，雄激素的分泌則受上游LH的驅(qū)動而增多，進而引起PCOS的發(fā)生，故此也是導致PCOS發(fā)生的重要機制之一[22]。本研究以新加二甲地黃湯干預PCOS大鼠后，結(jié)果顯示PCOS大鼠血清LH、T水平降低，說明新加二甲地黃湯可改善PCOS大鼠性激素紊亂。

Kp是通過Kiss1基因編碼所表達的一類多肽，多與其受體GPR54相結(jié)合而發(fā)揮生物學作用[23]。Kp作為HPO軸的上游，可作用于GnRH神經(jīng)元以刺激GnRH的分泌，GnRH進一步調(diào)控垂體分泌的LH和FSH以影響卵巢的功能[24]。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者血清Kp水平較正常女性偏高，而異常升高的Kp水平可導致LH水平升高，導致高雄激素血癥[8，25]。本研究結(jié)果顯示PCOS大鼠血清LH、T、Kp水平均高于正常對照組，說明Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)與PCOS大鼠的LH、T存在關(guān)聯(lián)；而予新加二甲地黃湯干預PCOS大鼠后，PCOS大鼠血清Kp水平有所下降，說明新加二甲地黃可改善PCOS大鼠Kp水平。

研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞因PCOS患者體內(nèi)異常升高的雄激素而加速凋亡，并引起過早的黃素化，影響體內(nèi)卵泡發(fā)育及排卵功能[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在PCOS大鼠卵巢組織中呈現(xiàn)低表達，而低表達的Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)影響顆粒細胞數(shù)量或功能，從而干擾卵泡正常的生長發(fā)育[17，27-28]。本研究中模型組大鼠卵巢Kp、GPR54蛋白表達降低，與文獻[27]結(jié)果一致。其蛋白表達量下降可能與PCOS顆粒細胞減少有關(guān)。而經(jīng)過新加二甲地黃湯干預后，PCOS大鼠卵巢系數(shù)降低，其組織形態(tài)學觀察可見表現(xiàn)為囊樣擴張和閉鎖的卵泡數(shù)量較模型組變少，顆粒細胞的層數(shù)增多，且存在近乎成熟的卵泡；并且卵巢內(nèi)可見少量黃體，表明新加二甲地黃湯可改善卵泡發(fā)育及促排卵。PCOS大鼠卵巢內(nèi)的Kp和GPR54的蛋白水平呈不同幅度的增長，表明新加二甲地黃湯可能是經(jīng)過調(diào)節(jié)和控制Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)以促卵泡發(fā)育及排卵。

綜上所述，新加二甲地黃湯具有改善PCOS大鼠卵巢指數(shù)大小、調(diào)節(jié)性激素水平、促進卵泡發(fā)育及排卵的功能，可能為通過調(diào)控Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)來影響FSH和LH的釋放，調(diào)控PCOS的性腺功能，以此提升卵泡的發(fā)育及排卵能力，其具體作用機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–11–07）

（修回日期：2024–06–11）