三氧化二砷對鼻咽癌細胞系表達DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用

[摘要]目的探討三氧化二砷（As2O3）對鼻咽癌細胞系DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）（DNMT1、DNMT3A及DNMT3B）表達水平的影響。方法應(yīng)用8μmol/LAs2O3與鼻咽癌細胞系C666-1、CNE1、CNE2和鼻咽上皮永生細胞系NP69細胞分別共同孵育48h，基于細胞計數(shù)試劑盒8測定鼻咽癌細胞的增殖情況。應(yīng)用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡檢測藥物處理前后鼻咽癌細胞及NP69細胞中DNMTmRNA及蛋白表達水平的變化。結(jié)果NP69細胞相對鼻咽癌細胞表達DNMT1和DNMT3A水平最低。經(jīng)As2O3作用后，鼻咽癌細胞活力下降，形態(tài)改變明顯；各種細胞表達DNMT的水平變化不完全一致，其中C666-1細胞對3種DNMT的表達水平均顯著降低；而CNE1和CNE2細胞中DNMT1及DNMT3B表達下調(diào)，CNE1細胞中DNMT3A的表達顯著上調(diào)。結(jié)論As2O3可抑制鼻咽癌細胞中DNMT的表達，表明其在一定程度上對鼻咽癌細胞具有去甲基化作用，存在治療鼻咽癌的潛在價值。

[關(guān)鍵詞]鼻咽癌；三氧化二砷；甲基化；甲基轉(zhuǎn)移酶

[中圖分類號]R739.6[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.010

EffectsofarsenictrioxideonDNAmethyltransferasesexpressionofnasopharyngealcarcinomacelllines

GAOQianwen1，LIUTaowen2

1.IntensiveCareUnit，ChangzhouThirdPeople’sHospital，Changzhou213000，Jiangsu，China; 2.OncologyDepartment，NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，theSecondPeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Guilin541002，Guangxi，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofarsenictrioxide（As2O3）ontheexpressionlevelsofDNAmethyltransferases（DNMT）（DNMT1，DNMT3AandDNMT3B）innasopharyngealcarcinomacelllines.MethodsIncubationof8μmol/LAs2O3withnasopharyngealcarcinomacelllineC666-1，CNE1，CNE2andnasopharyngealepithelialimmortalcelllineNP69cellsfor48h，cellcountingkit-8wasmeasuredtheproliferationofnasopharyngealcarcinomacells.Moreover，quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreactionandWesternblotwereusedtodeterminethelevelsofDNMTmRNAandproteinexpressioninnasopharyngealcarcinomacellsandNP69cellsbeforeandafterAs2O3treatment.ResultsComparedwithnasopharyngealcarcinomacells，theexpressionofDNMT1andDNMT3AinNP69cellswerethelowest.AfterbeingincabationwiththeAs2O3，NPCcellviabilitydecreasedwithobviousmorphologicalchanges.ItisobservedthatlevelsofDNMTexpressedinvariouscellswerenotcompletelyconsistent，withC666-1cellsshowingsignificantlylowerexpressionlevelsforallthreeDNMT.However，DNMT1andDNMT3BweredownregulatedinCNE1andCNE2cells，DNMT3AexpressionwassignificantlyupregulatedinCNE1cells.ConclusionItissuggestedthatAs2O3haspotentialtherapeuticvaluefornasopharyngealcarcinomathroughwhichcouldinhibitetheexpressionofDNMT.

[Keywords]Arsenictrioxide;Nasopharyngealcarcinoma;Methylation;Methyltransferase

鼻咽癌高發(fā)于東南亞及我國南方地區(qū)，單獨放療或放療聯(lián)合化療可使該病達到較高的局部控制率，但鼻咽癌比其他頭頸部惡性腫瘤更容易復發(fā)及轉(zhuǎn)移[1]。已證實，DNA甲基化在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferases，DNMT）可使沉默的抑癌基因恢復表達并在一定程度上遏制惡性腫瘤生長[2-3]。目前，DNMT抑制劑治療惡性腫瘤受到高度關(guān)注，鑒于鼻咽癌存在高概率的DNA高度甲基化，故通過逆轉(zhuǎn)DNA甲基化有望治療鼻咽癌[4]。

三氧化二砷（As2O3）通過誘導細胞分化及凋亡而成為治療急性早幼粒細胞白血病的重要藥物。雖然As2O3可抑制某些癌細胞表達DNMT，但該藥對鼻咽癌細胞DNMT的影響罕見報道[5]。本研究顯示As2O3對不同分化程度、EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染相關(guān)的鼻咽癌細胞系中DNMT表達具有抑制作用，此可為通過去甲基化治療鼻咽癌提供新的實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗G4wMzdrw+1p2g8rthIgm2g4oS0bcQY54DgEs9fvOSmY=材料

1.1.1細胞系人未分化鼻咽癌細胞系C666-1（EBV陽性）和人類正常鼻咽上皮細胞系NP69購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司；高分化鼻咽癌細胞系CNE1（EBV陰性）及低分化鼻咽癌細胞系CNE2（EBV陰性）由廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科實驗室提供。

1.1.2主要試劑兔抗人DNMT1、DNMT3A、DNMT3B單克隆抗體和山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）消化液、磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）、青鏈霉素混合液（100倍）、二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）及放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radioimmunoprecipitationassaylysisbuffer，RIPA裂解液）購自索萊寶公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國天根生化公司；As2O3凍干粉注射劑（批準文號：國藥準字H20080665，生產(chǎn)單位：北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10mg）；SYBRGreenmix購自美國ABI公司。委托上海生物工程有限公司設(shè)計及合成DNMT基因的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreaction，qRT-PCR）引物序列如下：DNMT3A上游引物5’-AGCCTCAAGAGCAGTGGAAAA-3’；DNMT3A下游引物5’-CACGACCCAGACCATCCTTC-3’；DNMT3B上游引物5’-AGGTGGAGGCAGACAGTGGA-3’；DNMT3B下游引物5’-CTTTTCGATAGGAGACGAGCTTAT-3’；DNMT1上游引物5’-GATGATTCCTCAAAACCGCTGTA-3’；DNMT1下游引物5’-GTAGGTCTTCCCGTCGTCCC-3’[6]。

1.2細胞培養(yǎng)

分別應(yīng)用完全培養(yǎng)基RPMI1640和DMEM培養(yǎng)細胞系（C666-1、NP69、CNE1及CNE2細胞），正常傳代及凍存。根據(jù)本實驗室之前檢測C666-1及CNE2細胞的半抑制濃度（50%inhibitingconcentration，IC50）確定本實驗所應(yīng)用As2O3的工作濃度為8μmol/L[7]。在8μmol/LAs2O3濃度下孵育上述細胞48h后，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，并進行后續(xù)實驗。

1.3細胞計數(shù)試劑盒8檢測處理前后細胞的增殖情況

將細胞消化后接種于96孔板，濃度為4000/孔，設(shè)置多個藥物濃度梯度，留置復孔。培養(yǎng)48h后棄去上清液，每孔加入培養(yǎng)基及細胞計數(shù)試劑盒8（cellcountingkit-8，CCK8）溶液，避光孵育后于酶標儀450nm處測定吸光度（A值），取1.0附近的A值作為測定值。細胞增殖抑制率（%）=1–（實驗組A值–空白組A值）/（對照組A值–空白組A值）%。

1.4qRT-PCR檢測細胞表達DNMTmRNA水平的變化

參照試劑盒說明書進行操作：應(yīng)用RNA提取試劑盒提取經(jīng)As2O3處理前后的細胞總RNA，測定其濃度及A值（A260/280=1.8～2.0）。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，將cDNA用ddH2O稀釋5倍，配制qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBRGreenMix（2×）10μl，引物探針2μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。以磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參照，運行PCR程序：50℃2min，95℃20s，95℃3s，60℃30s，40個循環(huán)。收集溶解曲線數(shù)據(jù)并進行分析[6]。

1.5蛋白質(zhì)印跡檢測細胞表達DNMT蛋白水平的變化

收集待測細胞，應(yīng)用細胞裂解液提取經(jīng)As2O3處理前后上述細胞的總蛋白。應(yīng)用二喹啉甲酸法定量蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜及封閉后，加入兔抗人單克隆抗體DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，濃度分別為1∶1000、1∶2000、1∶3000，4℃過夜后二抗（1∶25000）孵育；洗膜后化學發(fā)光、顯影定影、掃描膠片、分析數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；使用GaphpadPrism6.0作圖及分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1As2O3處理前后細胞形態(tài)學及增值變化

應(yīng)用8μmol/LAs2O3作用于鼻咽癌細胞系48h后，各細胞數(shù)目明顯減少；其中CNE1和CNE2細胞的形態(tài)改變較大，輪廓模糊不清，培養(yǎng)液中死亡細胞數(shù)量較多，見圖1。通過CCK8檢測，As2O3作用后3種細胞的活力受影響，隨著藥物濃度的增加，增值率下降（P<0.0001），見表1。

2.2As2O3處理前后各細胞系中DNMTmRNA的表達

As2O3處理前，DNMT1mRNA在4種細胞系中的表達從低到高為NP69、CNE1、CNE2、C666-1。經(jīng)As2O3處理48h后，各種細胞表達DNMTmRNA的水平均有所變化，但其變化趨勢不完全一致，其中C666-1細胞對3種基因的表達均顯著降低（P<0.01）。DNMT1mRNA和DNMT3BmRNA在CNE1及CNE2細胞中表達均降低（P<0.01），但這兩種細胞系中DNMT3AmRNA的表達呈上升趨勢，尤其是CNE1細胞中DNMT3AmRNA的表達水平顯著上調(diào)（P<0.01）。在NP69細胞中，DNMT1mRNA和DNMT3AmRNA表達升高，而DNMT3BmRNA表達下降（P<0.01），見表2、圖2。

2.3As2O3對各細胞系中DNMT蛋白表達的影響

As2O3處理前，DNMT1蛋白在各細胞中表達與其mRNA相同，從低到高依次為NP69、CNE1、CNE2、C666-1，且這些細胞在藥物作用后表達DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的變化趨勢基本與mRNA的表達一致，見圖2、圖3。As2O3處理后，DNMT3B在NP69中的表達降低，而DNMT1和DNMT3A蛋白表達升高（P<0.01）；C666-1及CNE2細胞表達DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的水平顯著下降（P<0.01）；CNE1細胞表達DNMT1和DNMT3B蛋白的水平降低，而表達DNMT3A蛋白的水平升高，見圖3。

3討論

DNA甲基化是人類基因組最常見的可逆性表觀遺傳修飾方式，它是通過細胞內(nèi)DNMT的催化將S-腺苷甲硫氨酸的甲基共價地結(jié)合在基因組特定核苷酸的過程。通常在基因組CpG島的胞嘧啶5位碳原子上添加1個甲基而形成5-甲基胞嘧啶，使特異DNA發(fā)生甲基化。這些甲基化胞嘧啶位于DNA啟動子和（或）增強子區(qū)域，造成其不能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而導致基因（尤其抑癌基因）的轉(zhuǎn)錄受遏制[8]。DNA甲基化調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達，參與發(fā)育、分化及基因表達等各種細胞過程。DNA的正常甲基化水平發(fā)生改變可導致各種病理情況，尤其是惡性腫瘤[9]。哺乳動物含有3種具有功能的DMNT異構(gòu)體（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B），其結(jié)構(gòu)相似、催化機制相同。DNMT1的作用在于識別半甲基化DNA而維持DNA甲基化狀態(tài)，而DNMT3A及DNMT3B負責DNA初始甲基化，其中DNMT3B對基因組的甲基化作用大于DNMT3A，這些DNMT的作用具有一定的重疊性[10]。

惡性腫瘤中DNMT表達水平通常發(fā)生改變，但在不同類型腫瘤中起主導作用的DNMT成員不同[11]。如DNMT3A突變對惡性血液腫瘤具有重要作用，乳腺癌中DNMT3B的表達水平顯著高于DNMT1及DNMT3A，而DNMT1、DNMT3A及DNMT3B在胰腺癌、乳腺癌組織中的表達均顯著上調(diào)，所以認為不同腫瘤中較高水平的DNMT異構(gòu)體是最佳的去甲基化治療靶點[12-15]。鑒于甲基化和去甲基化處于動態(tài)過程中，DNA甲基化是3種DNMT成員共同作用的結(jié)果，因此，共同抑制DNMT1、DNMT3A及DNMT3B可能效果更佳[16]。相比于其他惡性腫瘤（肝、肺、腎、乳腺等），鼻咽癌抑癌基因表達降低，存在DNA高度甲基化[4]。

本研究中As2O3處理前后，各細胞系DNMT的表達趨勢不同，考慮與各細胞系的內(nèi)在差異有關(guān)，如NP69為正常鼻咽上皮細胞，而C666-1為EBV陽性未分化鱗癌細胞，CNE1和CNE2雖均為EBV陰性，但分化程度不同。其中，C666-1表達DNMT水平高于CNE1、CNE2及NP69，而經(jīng)As2O處理后細胞DNMT的表達均下降，考慮與EBV基因組產(chǎn)物成分潛伏膜蛋白1（latentmembraneprotein1，LMP1）對鼻咽癌表觀遺傳學的作用有關(guān)[17]。此外，LMP1通過結(jié)合DNMT基因的啟動子1而誘導DNMT1、DNMT3A及DNMT3B表達和激活其活性，可能是本研究中C666-1細胞表達較高水平DNMT的主要原因[18]。經(jīng)As2O3處理后，CNE1及CNE2細胞對DNMT1、DNMT3A及DNMT3B表達水平降低程度不同，考慮可能與細胞分化程度差異有關(guān)。NP69作為人類正常鼻咽上皮細胞，表達DNMT（DNMT1、DNMT3A）水平最低。盡管上述細胞表達DNMT譜存在差異，C666-1、CNE1及CNE2細胞均以DNMT1高表達為主，而DNMT1對于維持DNA甲基化狀態(tài)起重要作用。另外，本研究中鼻咽癌細胞高表達DNMT1及DNMT3A除受LMP1蛋白介導外，很重要的是受GLI1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。據(jù)報道，胰腺癌組織及細胞中DNMT1是Hedghog信號通路下游核轉(zhuǎn)錄因子GLI1的靶基因，而且GLI1可通過間接機制誘導DNMT3A表達上調(diào)[19]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Hedghog信號通路在鼻咽癌組織及腫瘤細胞中存在高表達[20]。

本研究中筆者觀察到鼻咽癌細胞經(jīng)As2O3處理后，EBV感染與否及不同分化程度的鼻咽癌細胞中DNMTmRNA受抑制程度不一，其具體體現(xiàn)為各種細胞表達DNMTmRNA的水平變化趨勢不完全一致，其中C666-1細胞中3種DNMTmRNA的表達均顯著降低；而CNE1和CNE2細胞中DNMT1mRNA及DNMT3BmRNA的表達下調(diào)，但DNMT3AmRNA的表達呈上升趨勢?？梢?，As2O3是DNMT的廣譜抑制劑。As2O3對鼻咽癌細胞表達DNMT的抑制差異可能受多種因素影響，具體機制有待研究。研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可抑制Hedgehog信號通路中GLI1轉(zhuǎn)錄活性及GLI2聚集，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。而且，As2O3抗急性早幼粒細胞白血病的作用與GLI蛋白有關(guān)[22]。此外，As2O3可通過其他直接及間接作用抑制DNMT，如DNMT的C端催化域都含有豐富的半胱氨酸琉基，As2O3作為疏基酶抑制劑可直接抑制DNMT活性。同時，As2O3代謝產(chǎn)生的S-腺苷同型半胱氨酸是DNMT的抑制物，進一步抑制DNA甲基化過程。因此，筆者認為As2O3通過多靶點及多種機制抑制DNMT的水平及活性。目前僅2種DNMT抑制劑（5-氮胞苷及和地西他濱）獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，這些核苷類似物的作用機制是通過作用于DNMT1而抑制DNA甲基化；由于存在細胞毒性、缺乏特異性及生物利用度較差而導致其應(yīng)用受到限制，目前主要用于治療骨髓增生異常綜合征，治療實體瘤的效果不明顯[23]。因此，非核苷類DNMT抑制劑的研發(fā)備受關(guān)注。

綜上，本研究觀察到As2O3可抑制鼻咽癌細胞表達DNMT，表明As2O3在一定程度上對鼻咽癌具有去甲基化作用。但經(jīng)As2O3處理后，一些鼻咽癌細胞系表達DNMT異構(gòu)體呈上調(diào)，其機制未明，考慮這些細胞可能存在DNMT基因甲基化（而As2O3使其去甲基化而恢復表達）。進一步明確DNMT不同異構(gòu)體的表達及其作用機制，有望為聯(lián)合去甲基化與其他靶向藥物或傳統(tǒng)放化療而治療包括鼻咽癌在內(nèi)的惡性實體瘤提供有益參考。As2O3對鼻咽癌的去甲基化效果及其可行性尚有待在體內(nèi)外腫瘤模型中深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] CHENYP，CHANATC，LEQT，etal.Nasopharyngealcarcinoma[J].Lancet，2019，394（10192）：64–80.

[2] ZHOUZ，LIHQ，LIUF.DNAMethyltransferaseinhibitorsandtheirtherapeuticpotential[J].CurrTopMedChem，2018，18（28）：2448–2457.

[3] YUJ，XIET，WANGZ，etal.DNAmethyltransferases：Emergingtargetsforthediscoveryofinhibitorsaspotentanticancerdrugs[J].DrugDiscovToday，2019，24（12）：2323–2331.

[4] DAIW，ZHENGH，CHEUNGAK，etal.Geneticandepigeneticlandscapeofnasopharyngealcarcinoma[J].ChinClinOncol，2016，5（2）：16–28.

[5] 邊祥海，孫貴富.地西他濱聯(lián)合三氧化二砷對肝癌SMMC-7721細胞株P(guān)15～（INK4B）及甲基化轉(zhuǎn)移酶表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，28（11）：924–927.

[6] 高倩雯.鼻咽癌中GLI3基因轉(zhuǎn)錄失活機制及其作用的研究[D].桂林：桂林醫(yī)學院，2019.

[7] 高倩雯，劉陶文.三氧化二砷對耐受順鉑的EB病毒陽性及陰性鼻咽癌細胞系的抑制作用[J].華夏醫(yī)學，2019，32（1）：1–6.

[8] BEGOLLIR，SIDERISN，GIAKOUNTISA.LncRNAsaschromatinregulatorsincancer：Frommolecularfunctiontoclinicalpotential[J].Cancers（Basel），2019，11（10）：1524.

[9] BORCHIELLINIM，UMMARINOS，DIRUSCIOA.ThebrightanddarksideofDNAmethylation：Amatterofbalance[J].Cells，2019，8（10）：1243–1257.

[10] ZHANGZM，LUR，WANGP，etal.StructuralbasisforDNMT3A-mediateddenovoDNAmethylation[J].Nature，2018，554（7692）：387–391.

[11] ZHANGW，XUJ.DNAmethyltransferasesandtheirrolesintumorigenesis[J].BiomarkRes，2017，20（5）：1–8.

[12] YANGL，RAUR，GOODELLMA.DNMT3Ainhaematologicalmalignancies[J].NatRevCancer，2015，15（3）：152–165.

[13] MANX，LIQ，WANGB，etal.DNMT3AandDNMT3Binbreasttumorigenesisandpotentialtherapy[J].FrontCellDevBiol，2022，10：916725.

[14] 萬山，鄧麗聰，楚杰.DNA甲基化修飾在胰腺癌中的研究進展[J].中國普通外科雜志，2023，32（3）：441–447.

[15] 張丹峰，楊宏偉，王曼.DNMTs基因在乳腺癌組織中表達的檢測[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2019，41（4）：384–387.

[16] JURKOWSKARZ，JELSCHA.EnzymologyofmammalianDNAmethyltransferases[J].AdvExpMedBiol，2022，1389：69–110.

[17] HEX，YANB，LIUS，etal.ChromatinremodelingfactorLSHdrivescancerprogressionbysuppressingtheactivityoffumaratehydratase[J].CancerRes，2016，76（19）：5743–5755.

[18] TSAICN，TSAICL，TSEKP，etal.TheEpstein-Barrvirusoncogeneproduct，latentmembraneprotein1，inducesthedownregulationofE-cadheringeneexpressionviaactivationofDNAmethyltransferases[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99（15）：10084–10089.

[19] HES，WANGF，YANGL，etal.ExpressionofDNMT1andDNMT3AareregulatedbyGLI1inhumanpancreaticcancer[J].PLoSOne，2011，6（11）：e27684.

[20] XIAHX，SHENB，LIUTW，etal.Gli1proteinexpressioninnasopharyngealcarcinomaanditsclinicalsignificance[J].IntJClinExpMed，2016，9（6）：9545–9549.

[21] ZHANGJ，F(xiàn)ANJ，ZENGX，etal.Hedgehogsignalingingastrointestinalcarcinogenesisandthegastrointestinaltumormicroenvironment[J].ActaPharmSinB，2021，11（3）：609–620.

[22] CHENL，ZHUHM，LIY，etal.Arsenictrioxidereplacingorreducingchemotherapyinconsolidationtherapyforacutepromyelocyticleukemia（APL2012trial）[J].ProcNatlAcadSciUSA，2021，118（6）：e2020382118.

[23] MIRANDAFURTADOCL，DOSSANTOSLUCIANOMC，SILVASANTOSRD，etal.Epidrugs：Targetingepigeneticmarksincancertreatment[J].Epigenetics，2019，14（12）：1164–1176.

（收稿日期：2023–10–17）

（修回日期：2024–06–18）