生物信息學鑒定青少年特發(fā)性脊柱側凸關鍵生物標志物

[摘要]目的對青少年特發(fā)性脊柱側凸（adolescentidiopathicscoliosis，AIS）患者間質干細胞的基因芯片數據進行生物信息學分析，探究AIS致病機制和治療靶點。方法從基因表達綜合數據庫（geneexpressionomnibus，GEO）下載基因芯片GSE110359，獲取AIS患者與非AIS患者間質干細胞中的基因表達譜。利用加權基因共表達網絡分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）識別AIS關鍵模塊，并對其進行基因本體（geneontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）富集分析；同時，對其28種不同類型免疫細胞進行免疫細胞浸潤分析和蛋白質–蛋白質相互作用（protein-proteininteraction，PPI）分析，并篩選出核心基因。結果確定8個基因共表達模塊，GO富集在對氧減少的反應水平、低氧反應、對氧水平的反應、核糖核蛋白復雜組裝、膠原蛋白?包含細胞外基質、剪接體snRNP復合物、snRNA結合、細胞外基質結構組成，KEGG信號通路富集在低氧誘導因子-1信號通路、剪接體、細胞鐵死亡、脂肪酸降解等通路。此外，免疫浸潤結果發(fā)現，AIS組單核細胞較非AIS組明顯減少（P<0.05）；而AIS組的活化樹突狀細胞浸潤程度更高（P<0.05），通過PPI分析，篩選出血管生成素樣4（angiopoietin-like4，ANGPTL4）、CXC基序趨化因子配體8（C-X-Cmotifchemokineligand8，CXCL8）、溶質載體家族2成員1（solutecarrierfamily2member1，SLC2A1）、己糖激酶2（hexokinase2，HK2）、轉鐵蛋白受體蛋白（transferrinreceptorprotein，TFRC）在內的5個核心基因。結論ANGPTL4、CXCL8、SLC2A1、HK2、TFRC是AIS患者的潛在生物標志物與治療靶點，而單核細胞和活化樹突狀細胞可能是AIS患者的重要免疫治療靶點。

[關鍵詞]青少年特發(fā)性脊柱側凸；加權基因共表達網絡分析；生物信息學

[中圖分類號]R735.3[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.001

Identificationofkeybiomarkersinadolescentidiopathicscoliosisbybioinformaticsanalysis

XUHaipeng，JIANGYaheng，WENYa，LIUChen，WANGKaiqi，DUHonggen

DepartmentofTuina，theFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity，ZhejiangProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hangzhou310006，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveThisstudyaimstoinvestigatethepathogenesisandidentifypotentialtherapeutictargetsforadolescentidiopathicscoliosis（AIS）throughtheutilizationofbioinformaticsanalysisongenechipdataobtainedfrommesenchymalstemcells.MethodsThegenechipGSE110359wasacquiredfromthegeneexpressionomnibus（GEO）databasetoprocurethegeneexpressionprofilesofmesenchymalstemcellsderivedfromAISandnonAISpatients.Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis（WGCNA）methodwasemployedtoidentifytheprincipalmodulesassociatedwithadolescentidiopathicscoliosis.Furthermore，geneontology（GO）andKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）analyseswereconducted.Additionally，immunecellinfiltrationanalysisandprotein-proteininteraction（PPI）analysiswereperformedon28distinctimmunecelltypes，leadingtotheidentificationofcoregenes.ResultsAtotalofeightgeneco-expressionmodulesweresuccessfullyidentified.GOanalysisrevealedsignificantenrichmentinvariousbiologicalprocesses，includingresponsetodecreasedoxygenlevels，responsetooxygenlevels，ribonucleoproteincomplexsubunitorganization，collagen-containingextracellularmatrix，spliceosomesnRNPcomplex，snRNAbinding，andextracellularmatrixstructuralcomponents.KEGGanalysisdemonstratedenrichmentinseveralpathways，suchashypoxia-induciblefactor-1signalingpathway，spliceosome，ferroptosis，fattyaciddegradation，andotherpathways.Furthermore，thefindingspertainingtoimmuneinfiltrationrevealedanoteworthydecreaseinthequantityofmonocyteswithintheAISgroupcomparedtothenonAISgroup（P<0.05）.TherewasaheightenedlevelofinfiltrationbyactivateddendriticcellsintheAISgroup（P<0.05）.PPIanalysiswasconducted，resultingintheidentificationofangiopoietin-like4（ANGPTL4），C-X-Cmotifchemokineligand8（CXCL8），solutecarrierfamily2member1（SLC2A1），hexokinase2（HK2），andtransferrinreceptorprotein（TFRC）.ConclusionANGPTL4，CXCL8，SLC2A1，HK2andTFRChavebeenidentifiedaspotentialbiomarkersandtherapeutictargetsofAISpatients.MonocytesandactivateddendriticcellshaveemergedassignificanttargetsforimmunotherapyinthecontextofAIS.

[Keywords]Adolescentidiopathicscoliosis;Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis;Bioinformatics

青少年特發(fā)性脊柱側凸（adolescentidiopathicscoliosis，AIS）是最常見的脊柱畸形之一，好發(fā)于10～16歲的青少年，約占AIS的80%[1]。流行病學顯示，中國青少年AIS的發(fā)病率為0.6%～2.0%[2]。AIS可引起胸廓、骨盆及下肢結構異常改變、脊柱雙側肌力失衡、疼痛等癥狀，嚴重者可影響呼吸和運動功能，甚至累及脊髓，造成永久性癱瘓。AIS發(fā)生的確切機制仍不清楚。目前，關于AIS的發(fā)病機制主要集中在遺傳學、間充質干細胞、脊柱生物力學、神經學、激素、生物化學等方面，其發(fā)生可能是以上多種機制共同作用的結果[3]。因此，進一步研究AIS的發(fā)病機制對其預防、診斷和治療等均具有重要意義。

生物信息學是生物學與信息學的交叉科學，在生命科學的研究中發(fā)揮著至關重要的作用[4]。其中，加權基因共表達網絡分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）已廣泛應用于多種疾病的研究中，該技術在評估基因模塊與不同臨床特征的相關性中發(fā)揮重要的作用[5-6]。本研究利用WGCNA分析基因表達綜合數據庫（geneexpressionomnibus，GEO）中AIS患者間質干細胞基因表達芯片，鑒定AIS關鍵基因模塊，進一步探究AIS發(fā)生的分子機制，同時探究免疫細胞浸潤的組成特點及其在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中扮演的角色，以期為AIS發(fā)病機制和臨床診治提供新的理論依據。

1資料與方法

1.1資料來源

登錄GEO選擇符合條件的基因數據矩陣文件GSE110359，該芯片由17個間質干細胞樣本組成，分別取自12例AIS患者和5例非AIS患者。

1.2方法

1.2.1數據的處理使用Perl5.34語言對探針I(yè)D數據進行注釋；使用R4.2.1軟件對從GEO下載的探針表達矩陣文件進行歸一化及l(fā)og2轉換，將平臺注釋文件與每個探針表達矩陣進行篩選和匹配；最后，應用Bioconductor安裝的R4.2.1中的sva包消除不同實驗批次和平臺引起的異質性。

1.2.2WGCNA構建及重要模塊識別使用R4.2.1軟件中“WGCNA”包中的“goodSamplesGenes”函數構建樣本樹，檢查并去除異常樣本后，使用WGCNA中的pickSoftThreshold函數找到合適的軟閾值，選擇最佳β值，使R2值趨于穩(wěn)定，說明此網絡符合無尺度條件。最后，通過Pearson相關系數計算基因顯著性和模塊成員資格以將模塊與臨床特征相關聯，當P<0.05時，認為單個模塊與表型顯著相關。選擇與AIS相關系數最高的模塊作為關鍵模塊（綠色模塊），進行后續(xù)分析。

1.2.3功能與通路富集分析使用R4.2.1軟件中clusterProfiler包對關鍵模塊基因（綠色模塊）進行基因本體（geneontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）分析。

1.2.4蛋白質-蛋白質相互作用分析與核心基因篩選將關鍵模塊（綠色模塊）基因導入STRING11.0數據庫，探索不同基因編碼的蛋白質之間的相互關系。使用Cytoscape3.7.2軟件用于網絡的可視化，進行網絡分析及可視化操作，建構可視化的分子交互作用網絡。利用分子復合體檢測（molecularcomplexdetection，MCODE）插件提取關鍵子網，根據節(jié)點得分從大到小的順序提取出表達較為聚集的子集，將其定義為核心基因[7]。

1.2.5獲取免疫細胞矩陣及免疫細胞浸潤分析采用R4.2.1軟件BioManager中的“l(fā)imma”包對AIS患者和非AIS患者的間質干細胞中的mRNA表達譜矩陣進行校正。隨后，利用CIBERSORT法對人類免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積分析，計算28種免疫細胞的相對比例，且每個樣本獲得一個P值；根據P<0.05篩選樣本，獲得免疫細胞組成矩陣。

1.3統(tǒng)計學方法

差異基因的統(tǒng)計學分析通過R4.2.1軟件進行，采用vioplot包繪制小提琴圖，采用pheatmap包分析和繪制免疫細胞表達熱圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1WGCNA網絡構建及顯著性模塊確認

通過R4.2.1軟件對GSE110359數據集中所有基因進行WGCNA網絡構建。通過計算樣本間相關性，繪制樣本分層聚類圖（圖1A），樣本聚類樹共包括17個樣本，無異常樣本的剔除；同時，根據無尺度網絡擬合指數和平均連接度的要求，計算并確定選取β=6為本數據集的合適軟閾值，構建無標度網絡（圖1B、圖1C）。確定軟閾值后，采用動態(tài)剪切法，獲得包含藍色、粉色、紅色、棕色、綠色、黑色、黃色、灰色在內的8個模塊（圖2A）。通過計算各個基因模塊與臨床表型之間的關系，繪制共表達模塊與臨床表型的相關性熱圖和綠色模塊的基因散點圖。結果表明，綠色模塊（包含120個基因）與ASI的相關性最高（r=0.610，P=0.009），用于后續(xù)的分析（圖2B）。綠色模塊的基因散點圖見圖2C和圖2D。

2.2關鍵基因模塊功能性富集分析

GO富集分析結果表明，綠色模塊在生物學過程中主要富集在對氧減少的反應水平、低氧反應、對氧水平的反應、核糖核蛋白復雜組裝等方面；在細胞組分中主要富集膠原蛋白-包含細胞外基質、剪接體snRNP復合物、內質網腔等方面；在分子功能中主要富集在snRNA結合、細胞外基質結構組成、受體配體活性、信號受體激活劑的活性等方面（圖3A）。KEGG通路富集分析結果表明，綠色模塊基因主要富集在低氧誘導因子-1（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）信號通路、剪接體、細胞鐵死亡、脂肪酸降解信號通路（圖3B）。

2.3免疫細胞浸潤結果

直方圖顯示每個樣本中28種免疫細胞的總體分布，不同的顏色代表不同類型的免疫細胞。每種顏色的高度代表樣本中此類細胞的百分比，各種免疫細胞的百分比之和為1（圖4A）。通過小提琴圖對AIS組與非AIS組間免疫細胞浸潤進行差異分析，與非AIS組比較，AIS組單核細胞浸潤程度顯著降低（P=0.048），而AIS組的活化樹突狀細胞浸潤程度顯著提高（P=0.006）（圖4B）。

2.4蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及核心基因的識別

利用STRING11.0數據庫進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-proteininteraction，PPI）分析，將所得PPI網絡數據導入Cytoscape3.7.2軟件，對其進行可視化構建出綠色模塊基因的PPI（圖5A），利用CytoHubba插件的MCC算法篩選出PPI前5個核心基因（圖5B）：ANGPTL4、CXCL8、SLC2A1、HK2和TFRC。

3討論

AIS是引起青少年脊柱畸形最常見的原因，對其一生的健康具有潛在影響，并給家庭帶來沉重的負擔，引起的并發(fā)癥尚無有效的治療手段[8-10]。AIS是由多基因疾病、遺傳、神經系統(tǒng)、激素/代謝、生化、肌肉骨骼、環(huán)境和可能的生活方式因素共同引起[11]。目前，AIS的主要治療方法包括全程支具和椎弓根螺釘矯正手術，全程支具可能導致患者背痛和心理障礙，而手術不可避免地導致重大手術創(chuàng)傷，甚至永久性、災難性神經或血管損傷[10]。新的治療方法來自于對AIS分子基礎的進一步探索[12]。了解AIS發(fā)病機制對該病的治療和預后具有重要的意義。

既往研究發(fā)現，AIS患者間質干細胞的異常成骨分化與AIS的發(fā)病機制有關[13]。本研究采用WGCNA法對GSE110359基因芯片進行分析，構建8個基因共表達模塊，鑒定出與AIS密切相關的基因模塊（綠色模塊）。通過GO功能富集分析發(fā)現綠色模塊在生物學過程中主要富集對氧減少的反應水平、低氧反應、對氧水平的反應、核糖核蛋白復雜組裝等方面；在細胞組分中，該模塊基因主要富集膠原蛋白-包含細胞外基質、剪接體snRNP復合物、內質網腔等方面；在分子功能中與snRNA結合、細胞外基質結構組成、受體配體活性、信號受體激活劑的活性等方面密切相關。KEGG通路富集分析發(fā)現，綠色模塊基因與HIF-1信號通路、剪接體、細胞鐵死亡、脂肪酸降解信號通路相關。此外，AIS患者存在免疫-肌肉串擾的驅動機制，免疫系統(tǒng)可調節(jié)參與AIS的肌肉組織重塑過程的炎癥反應，從而維持AIS患者的肌肉力量，減輕疼痛并延緩脊柱側凸的發(fā)展[9]。而單核細胞和活化樹突狀細胞是參與免疫反應的重要細胞[14]。本研究在上述結果的基礎上，進一步發(fā)現單核細胞和活化樹突狀細胞可能是治療AIS的重要免疫靶點。

ANGPTL4是一種功能障礙的蛋白質，參與細胞分化、脂質代謝、腫瘤發(fā)生、能量穩(wěn)態(tài)、氧化還原調節(jié)、傷口愈合和炎癥在內的多種情況的發(fā)生與發(fā)展[15]。研究發(fā)現ANGPTL4在協調破骨細胞和成骨細胞中發(fā)揮重要的作用，是溶骨性肌肉骨骼疾病的新治療靶點[16]。值得注意的是AIS患者的間質干細胞在成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的發(fā)育過程中發(fā)生異常分化可能是AIS脊柱畸形的主要原因。然而，目前的研究尚未明確ANGPTL4在AIS中的作用。本研究進一步證實了ANGPTL4可能是調控AIS的重要生物標志物。

CXCL8作為重要的趨化因子之一，在感染和組織損傷的反應中發(fā)揮至關重要的作用[17]。本研究的免疫細胞浸潤的結果發(fā)現，AIS患者單核細胞減少而活化樹突狀細胞增加，CXCL8在介導的單核細胞和活化樹突狀細胞遷移過程中發(fā)揮協同作用[18]。此外，背痛患者椎間盤組織中CXCL8蛋白表達是脊柱側凸患者的1.81倍[19]；盡管目前仍缺乏相關研究明確CXCL8在AIS中的作用機制，但本研究構建的PPI網絡中CXCL8是AIS的核心基因；結合本研究免疫浸潤結果，提示CXCL8可能通過調節(jié)單核細胞和活化樹突狀細胞遷移參與AIS的發(fā)生與發(fā)展。

SLC2A1是一類促進性葡萄糖轉運蛋白，負責葡萄糖攝取[20]。Chen等[21]研究表明成骨細胞中，SLC2A1的缺失可阻斷體內Wnt7b的骨合成代謝功能，并損害體外成骨細胞的分化。研究發(fā)現，SLC2A1是已知的髓核標志物，在人類椎間盤退變的情況下，SLC2A1的表達升高[22]。目前尚無研究報道SLC2A1在AIS中的作用，考慮AIS與椎間盤的退化密切相關；本研究結果提示，SLC2A1可能是參與AIS發(fā)病機制的關鍵基因。

本研究PPI結果表明，HK2和TFRC均是AIS的核心基因，HK2作為外糖磷酸化酶家族中最活躍的成員，促進葡萄糖在細胞內的利用[23]。HK2的過表達導致骨關節(jié)炎的滑膜組織中促炎細胞因子水平增加，是骨關節(jié)炎的重要治療靶點[24]。此外，HK2不僅通過參與退變椎間盤中髓核細胞的再生，延緩椎間盤退變，并且在調節(jié)急性期神經性疼痛相關免疫細胞反應中發(fā)揮重要作用[25-26]。TFRC是一種跨膜蛋白，參與并維持細胞內鐵穩(wěn)態(tài)[27]。本研究發(fā)現，AIS的發(fā)病機制的過程中，細胞鐵死亡通路占據重要地位；此外，在既往的研究基礎上，筆者發(fā)現HK2和TFRC可能是AIS潛在的干預靶點，值得進一步的關注。

綜上，本研究首次通過WGCNA和免疫細胞浸潤分析AIS的生物學過程，發(fā)現ANGPTL4、CXCL8、SLC2A1、HK2、TFRC在內的5個基因均可能是AIS潛在的診斷生物標志物和重要的治療靶點。此外，單核細胞和活化樹突狀細胞可能參與AIS的免疫調節(jié)的過程，值得進一步探索。然而，目前的研究仍有局限性，研究結果雖然為AIS的發(fā)病機制提供了理論依據，但仍需進一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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