基于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的免疫相關(guān)基因及免疫細(xì)胞浸潤的生物信息學(xué)分析

［摘 要］ 目的：篩選支架內(nèi)再狹窄（ISR）中差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因（DEIRGs），分析ISR中免疫細(xì)胞浸潤情況，并闡明ISR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。方法：由基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫 （GEO） 下載GSE46560數(shù)據(jù)集樣本mRNA 基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分為ISR 組與非ISR （non-ISR） 組。采用R 軟件“Limma”包篩選出差異表達(dá)基因（DEGs） 并與免疫相關(guān)基因（IRGs） 交集獲得ISR 中DEIRGs。采用R 軟件進(jìn)行DEIRGs 的基因本體論（GO） 和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析，采用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白互作（PPI） 網(wǎng)絡(luò)， 以Cytoscape 軟件可視化并計(jì)算核心基因（Hub 基因）。繪制Hub 基因的受試者工作特征（ROC） 曲線，計(jì)算ROC 曲線下面積（AUC），并評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。采用CIBERSORT 軟件分析ISR 中免疫細(xì)胞浸潤情況， Pearson 相關(guān)分析法分析免疫細(xì)胞間及其與關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性。結(jié)果：共鑒定出331個(gè)DEGs（Plt;0. 05， | log2FC | gt;1），其中176個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，155 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，獲得38 個(gè)DEIRGs。GO 功能富集分析，在生物過程（BP） 中DEIRGs主要富集在防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)和免疫系統(tǒng)；在細(xì)胞組分（CC） 中DEIRGs 主要定位于胞外區(qū)和細(xì)胞質(zhì)膜等；在分子功能（MF） 中主要參與調(diào)控信號(hào)受體結(jié)合和細(xì)胞因子受體活性等。KEGG 信號(hào)通路富集分析，ISR 中DEIRGs 主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （PI3K-AKT） 和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β） 等信號(hào)通路。 PPI 網(wǎng)絡(luò)， 前10 位Hub 基因中 CD19 具有最高節(jié)點(diǎn)。 與 non-ISR 組比較，ISR 組樣本中 CD19 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。 CD19 mRNA 表達(dá)的 ROC 曲線中 AUC 值為0. 92 （Plt;0. 05）。免疫細(xì)胞浸潤分析， 與non-ISR 組比較， ISR 組患者濾泡輔助性T 淋巴細(xì)胞（Tfh） 浸潤水平升高（Plt;0. 05）， 初始B 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、幼稚CD4+T 淋巴細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞等浸潤水平升高， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 記憶性B 淋巴細(xì)胞、活化性記憶CD4+T 淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞、靜息性自然殺傷（NK） 細(xì)胞、活化性NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息性肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等浸潤水平降低， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。Tfh 與M0 巨噬細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞等呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 88，Plt;0. 05；r=0. 68，Plt;0. 05），與單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 （r=-0. 49，Plt;0. 05；r=-0. 42，Plt;0. 05）。 結(jié)論：CD19可能通過調(diào)控PI3K-AKT 信號(hào)通路激活影響Tfh 和B 淋巴細(xì)胞，促進(jìn)ISR 的發(fā)生發(fā)展。CD19 可作為診斷ISR的生物標(biāo)志物。

［關(guān)鍵詞］ 支架內(nèi)再狹窄； CD19； 差異表達(dá)免疫相關(guān)基因； 免疫浸潤； 生物標(biāo)志物

［中圖分類號(hào)］ R392.12 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

目前全球范圍內(nèi)心血管疾病患病率處于持續(xù)上升階段，死亡率也居全球首位［1］。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI） 是冠心病患者使用最廣泛的血運(yùn)重建方式，但術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR） 的發(fā)生率為2%～10% ［2-4］。目前ISR 發(fā)生的機(jī)制尚不明確。研究［5-6］ 顯示：免疫炎癥在ISR 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可能是導(dǎo)致PCI 術(shù)后ISR 形成的重要因素。RNA 測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)已成為研究基因交叉網(wǎng)絡(luò)及識(shí)別診斷生物標(biāo)志物的重要方法，可用于探索ISR 可能的發(fā)病機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)［7］。本研究篩選ISR 中差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因（differentiallyexpressed immune-related genes， DEIRGs） 并分析ISR 中免疫細(xì)胞的浸潤情況，采用生物信息學(xué)方法和RNA-seq 技術(shù)探討免疫炎癥對(duì)ISR 發(fā)生發(fā)展的影響，為ISR 的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1. 1 數(shù) 據(jù) 來 源

由 基 因 表 達(dá) 綜 合 （GeneExpression Omnibus， GEO） 數(shù)據(jù)庫（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo） 下載ISR 微陣列數(shù)據(jù)集 GSE46560 的表達(dá)矩陣和平臺(tái)信息［8］。GSE46560 數(shù)據(jù)集來源平臺(tái)為GPL15207， 生物類型為人類， 時(shí)間為2018 年， 包含5 例 ISR 患者和6 例非ISR （non-ISR） 患者mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)， 分別為ISR 組和non-ISR 組。GSE46560 數(shù)據(jù)集樣本信息見表1。

1. 2 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選

對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，采用R 軟件“Limma”包對(duì)2 組樣本基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0. 05 和 | log2FC |gt;1。采用ggplot2 和pheatmap 程序包對(duì)篩選出的DEGs 進(jìn)行可視化分析，繪制熱圖和火山圖。

1. 3 免疫相關(guān)基因（immune-related genes，IRGs）和 DEIRGs 獲取

由 ImmPort 數(shù)據(jù)庫 （https：//immport. niaid. nih. gov） 中獲取ISR 中IRGs。將DEGs 與IRG 取交集， 獲得ISR 中的DEIRGs， 并繪制韋恩圖。

1. 4 ISR中 DEIRGs基因本體論（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書 （KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析

按照參考文獻(xiàn) ［9］ 的方法，采用R 軟件ggplot2 （v3. 3. 0） 包、clusterProfifiler（v3. 14. 3） 包、org. Hs. eg. db （v3. 10. 0） 包和enrichplot （v1. 6. 1） 包對(duì)ISR 中的DEIRGs 進(jìn)行GO 功能及KEGG 信號(hào)通路富集分析，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1. 5 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因（Hub基因）篩選

將ISR中的DEIRGs 輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db. org/），構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，以置信度gt;0. 9 作為PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)。按照參考文獻(xiàn)［10］ 的方法， 采用Cytoscape 軟件（v3. 9. 1） 對(duì)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，并利用CytoHubba 插件計(jì)算Hub基因。

1. 6 ISR 中 DEIRGs基因表達(dá)量驗(yàn)證和 Hub基因診斷價(jià)值評(píng)價(jià)

獲取GSE46560數(shù)據(jù)集中11個(gè)樣本中關(guān)鍵基因表達(dá)量，采用GraphPad Prism 繪制柱狀圖并進(jìn)行可視化。采用GraphPad Prism 繪制Hub 基因的受試者工作特征（receiver operatingcharacteristic curve，ROC） 曲線，計(jì)算 ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC），并評(píng)估其診斷價(jià)值。

1. 7 免疫細(xì)胞浸潤分析

CIBERSORT算法是一種多功能的反卷積算法， 可進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析。采用R 軟件 “CIBERSORT”包計(jì)算2 組樣本中22 種免疫細(xì)胞浸潤百分率。按照參考文獻(xiàn)［8］中的方法進(jìn)行可視化。采用Pearson 相關(guān)分析法分析免疫細(xì)胞間及與關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 2組樣本 DEGs鑒定

GSE46560數(shù)據(jù)集中共獲得331 個(gè)DEGs，其中176 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，155 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。見圖1。

2. 2 DEIRGs篩選

由ImmPort數(shù)據(jù)庫獲取1 793個(gè)IRGs，將其與GSE46560 數(shù)據(jù)集中獲取的DEGs 取交集后獲得38 個(gè)DEIRGs。前10 位DEIRGs 分別為白細(xì)胞介素1 受體Ⅰ （interleukin-1 receptor Ⅰ ，IL-1R1）、 CC 基序趨化因子受體3 （C-Cchemokine receptor type 3， CCR3）、CD19、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子（secretory leukocyteprotease inhibitor， SLPI）、干擾素α6 （interferonalpha-6，IFNA6）、腫瘤壞死因子受體超家族成員9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9）、酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）、白細(xì)胞介素 17 受體 A （interleukin-17receptor A， IL-17RA）、 白細(xì)胞介素 10 受體 B（interleukin-10 receptor B， IL-10RB） 和Ⅰ 型干擾素α 受體1 （interferon alpha receptor type 1，IFNAR1）。見圖2 和表2。

2. 3 DEIRGs GO 功能和 KEGG 信號(hào)通路富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果顯示： 生物過程（biological process，BP） 中DEIRGs 主要富集于防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)和免疫系統(tǒng)等； 細(xì)胞組分（cellular component， CC） 中DEIRGs 主要定位于胞外區(qū)和細(xì)胞質(zhì)膜等； 分子功能（molecularfunction，MF） 中DEIRGs 主要參與調(diào)控信號(hào)受體結(jié)合和細(xì)胞因子受體活性等。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示：DEIRGs 主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT） 信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor- β， TGF- β）信號(hào)通路和白細(xì)胞介素17 （interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路等。見圖3。

2. 4 PPI 網(wǎng) 絡(luò) 構(gòu) 建 及 Hub 基 因 篩 選

采 用CytoHubba 插件計(jì)算出前 10 位 Hub 基因， 包括CD19、IL-1R1、SYK、IL-17RA 和IFNAR1 等均具有較高節(jié)點(diǎn)。見圖4 和表3。

2. 5 Hub基因表達(dá)情況及診斷價(jià)值評(píng)價(jià)

與 non-ISR 組比較，ISR 組樣本中CD19 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）， CD19 mRNA 表達(dá)的ROC曲線中AUC 值為0. 92。見圖5。

2. 6 免疫細(xì)胞浸潤和相關(guān)性分析

2組樣本免疫細(xì)胞的組成以條形圖顯示。見圖6A。與non-ISR 組比較， ISR 組患者濾泡輔助性 T 淋巴細(xì)胞（T lymphocyte follicular helper，Tfh） 浸潤水平升高（Plt;0. 05），初始B 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、幼稚CD4+T 淋巴細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞等浸潤水平升高， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 記憶性B 淋巴細(xì)胞、活化性記憶CD4+T 淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞、靜息性自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、活化性NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息性肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等浸潤水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖6B。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示：Tfh 與M0 巨噬細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 88，Plt;0. 05；r=0. 68，Plt;0. 05），與單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0. 49， Plt;0. 05； r=-0. 42， Plt;0. 05）。見圖6C。CD19 與Tfh 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 65，Plt;0. 05）， 與γδT 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=0. 02，P=0. 02）；SYK 與嗜酸性粒細(xì)胞及M2 巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－0. 03， P=0. 03）； TNFRSF9與活化性記憶CD4+T 淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 03，P=0. 03），與M2 巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（ r= － 0. 03， P=0. 03；r=－0. 03，P=0. 03）；CCR3 與M2 巨噬細(xì)胞2 及嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系（r=0. 02，P=0. 02）；IL-17RA 與巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－2. 9e-4， Plt;0. 01）； IFNA6 與記憶性B 淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=－6. 4e-3，Plt;0. 01）。見圖6D。

3 討 論

目前冠狀動(dòng)脈造影是診斷ISR 病變及嚴(yán)重程度的金標(biāo)準(zhǔn)， 但該方法為有創(chuàng)操作， 面臨一定風(fēng)險(xiǎn)［12-13］。隨著藥物洗脫支架技術(shù)的引入和后續(xù)迭代，提高了PCI 治療的有效性和安全性，但I(xiàn)SR 的發(fā)病率和由ISR 產(chǎn)生的重復(fù)血運(yùn)重建需求仍嚴(yán)重影響患者的預(yù)后［9］。因此，需闡明ISR 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并尋找有效的生物標(biāo)志物，以降低PCI 術(shù)后ISR的發(fā)生。研究［14-17］ 顯示：C 反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞介素等免疫炎癥因子、T 淋巴細(xì)胞及B 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)ISR 的發(fā)生發(fā)展起重要作用。此外， 目前RNA-seq 與生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合，已成為研究基因交叉網(wǎng)絡(luò)和識(shí)別候選生物標(biāo)志物的重要技術(shù)，可用于探索ISR 可能的發(fā)病機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)。

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)技術(shù)分析ISR 中的免疫炎癥基因及免疫浸潤特征，結(jié)果顯示：篩選的DEIRGs 與ISR 的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。脂質(zhì)鏈酶10 （lipocalin 10， Lcn10）［18］、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ 類多肽相關(guān)序列A （majorhistocompatibility complex class Ⅰ polypeptiderelatedsequence A，MICA）［19］ 和白細(xì)胞介素17 受體E （interleukin-17 receptor E ，IL-17RE）［20］ 等可通過調(diào)控免疫炎癥參與ISR 的發(fā)生發(fā)展。研究［19］顯示：MICA 與各種炎癥和自身免疫性疾病有關(guān)，可作為評(píng)估急性心肌梗死等心血管疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Lcn10 可能在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［21-22］。

本研究結(jié)果顯示：DEIRGs 主要定位于胞外區(qū)和細(xì)胞質(zhì)膜，可能通過參與PI3K/AKT 和TGF-β 等信號(hào)通路調(diào)控信號(hào)受體結(jié)合及細(xì)胞因子受體活性，參與防御反應(yīng)和免疫反應(yīng)等過程。PI3K/AKT 和TGF-β 等信號(hào)通路通過炎癥等途徑影響血管損傷后的新生內(nèi)膜增生，進(jìn)而影響ISR 的發(fā)生發(fā)展［14-17，23］。研究［24］ 發(fā)現(xiàn)：半夏可通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)和增加內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelialprogenitor cells，EPCs） 百分率，進(jìn)而減少動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸動(dòng)脈損傷后的新生內(nèi)膜增生。PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs） 的周期進(jìn)展，并在損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生和ISR 中起重要作用［25］。TGF-β1 可能參與誘導(dǎo)內(nèi)膜增厚，在動(dòng)脈血管損傷后，TGF-β1 上調(diào)導(dǎo)致各種下游途徑激活，進(jìn)而刺激VSMCs 的增殖和遷移及局部細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致ISR 的發(fā)生。抑制TGF-β1 活性可減少動(dòng)脈血管損傷后的內(nèi)膜增厚， 從而減輕ISR［26-27］。因此， DEIRGs 可能通過PI3K/AKT 和TGF- β 等信號(hào)通路調(diào)控免疫炎癥及PCI 術(shù)后的血管內(nèi)新生內(nèi)膜增生，進(jìn)而影響ISR 的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示：CD19 具有最高節(jié)點(diǎn)，可作為Hub 基因。CD19 作為在B 淋巴細(xì)胞上表達(dá)的免疫球蛋白超家族的成員， 是 B 細(xì)胞抗原受體（B cell antigen receptor，BCR） 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵共受體， 可通過調(diào)控免疫炎癥促進(jìn)ISR 的發(fā)生［28-29］。研究［30］ 顯示：PI3K 是CD19 下游的效應(yīng)分子，二者結(jié)合促進(jìn)了PI3K 信號(hào)通路的激活。CD19 與BCR 結(jié)合后，B 淋巴細(xì)胞中PI3K 信號(hào)通路的數(shù)量是未結(jié)合B 淋巴細(xì)胞中的10 倍［31］。繪制CD19 的ROC 曲線， 結(jié)果顯示： AUC 為0. 92， 提示CD19可作為診斷ISR 的生物標(biāo)志物。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示： CD19 富集于PI3K/AKT 通路中，提示CD19 可能通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)ISR 的發(fā)生發(fā)展。

免疫細(xì)胞在ISR 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，免疫和炎癥反應(yīng)在血管機(jī)械損傷前期即被激活，該過程通常伴隨多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，可誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞（包括Tfh 細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞）、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等向損傷部位趨化、黏附、聚集或極化， 進(jìn)而共同導(dǎo)致新生內(nèi)膜的增生，最終形成ISR［32-33］。本研究結(jié)果顯示：與non-ISR 組比較，ISR 組患者Tfh 的免疫細(xì)胞浸潤水平升高。Tfh 細(xì)胞是為CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群的特殊類型的輔助性T 淋巴細(xì)胞， 可促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞成熟，發(fā)揮免疫作用。研究［34］ 顯示：在ISR 小鼠模型中，Tfh促進(jìn)ISR 的發(fā)生發(fā)展，而Tfh缺乏的小鼠ISR得到改善。PREITE 等［35］ 研究顯示：PI3K 的激活是Tfh 細(xì)胞發(fā)育所必需的條件， 選擇性消除PI3K募集的p85 結(jié)合位點(diǎn)突變可導(dǎo)致Tfh 細(xì)胞形成缺陷。

綜上所述， Hub 基因CD19 可能通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活影響Tfh 和B 淋巴細(xì)胞，促進(jìn)ISR 的發(fā)生發(fā)展。CD19 可作為診斷ISR 的生物標(biāo)志物。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馮玉飛參與研究設(shè)計(jì)、論文構(gòu)思、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫，金珊參與數(shù)據(jù)采集分析，王玉冰和魯印飛參與論文審閱，龐麗娟和劉克堅(jiān)參與研究項(xiàng)目指導(dǎo)。

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