靈芝酸A 對非小細(xì)胞肺癌PC9 細(xì)胞糖酵解及其關(guān)鍵限速酶的影響

［摘 要］ 目的：探討不同劑量靈芝酸 A （GAA） 對非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC） PC9細(xì)胞的生物活性、糖酵解及其限速酶表達(dá)的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng) NSCLC PC9 細(xì)胞，將PC9 細(xì)胞分為空白對照組、低劑量（25 μmol·L－1） GAA 組、中劑量（50 μmol·L－1） GAA 組和高劑量（100 μmol·L－1） GAA 組。采用噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測各組PC9 細(xì)胞存活率，Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測各組PC9 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)， 葡萄糖檢測試劑盒檢測各組PC9 細(xì)胞葡萄糖攝取量， 三磷酸腺苷（ATP） 檢測試劑盒檢測各組PC9 細(xì)胞中ATP 水平，乳酸檢測試劑盒檢測各組PC9 細(xì)胞中乳酸水平，實(shí)時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組PC9 細(xì)胞中己糖激酶2 （HK2） 和M2 型丙酮酸激酶（PKM2） mRNA 表達(dá)水平，Western blotting 法檢測各組 PC9 細(xì)胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：MTT法，培養(yǎng)24、48和72 h時，與空白對照組比較，中和高劑量GAA組PC9細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）；培養(yǎng)72 h 時，與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)， 與空白對照組比較， 中和高劑量GAA 組細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少（Plt;0. 05）；與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少（Plt;0. 05）。與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中葡萄糖攝取量和乳酸水平均明顯降低（Plt;0. 05），高劑量GAA 組PC9細(xì)胞中ATP 水平明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法，與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9細(xì)胞中HK2 和PKM2 mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法，與空白對照組比較，中和高劑量GAA組PC9細(xì)胞中HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平明顯降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：中和高劑量GAA 可抑制PC9 細(xì)胞增殖及遷移的生物活性，降低糖酵解作用，其作用機(jī)制可能與抑制關(guān)鍵限速酶HK2 和PKM2 的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 靈芝酸A； 癌，非小細(xì)胞肺； 己糖激酶2； M2 型丙酮酸激酶； 糖酵解

［中圖分類號］ R734. 2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 約占全部肺癌患者的85% ［1-2］。研究［3］顯示：惡性腫瘤細(xì)胞通過糖酵解途徑較氧化磷酸化途徑產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 的速度更快， 可為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供能量。惡性腫瘤細(xì)胞為了具有較強(qiáng)的侵襲、增殖、遷移和躲避免疫細(xì)胞識別的能力，即使在有氧條件下也會選擇糖酵解獲能， 被稱為有氧糖酵解（Warburg 效應(yīng)）［4］。糖酵解過程中可產(chǎn)生乳酸，乳酸使腫瘤局部維持酸性微環(huán)境，便于腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖［5］。郝萌萌等［6］ 發(fā)現(xiàn)：靈芝酸A （ganodericacid A，GAA） 是由靈芝中分離出來的三萜類活性成分，有解毒、鎮(zhèn)靜、止痛、保肝和抗腫瘤等作用。國內(nèi)外研究［7-9］ 顯示： GAA 具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減弱細(xì)胞侵襲能力及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用， 因此針對GAA 抗腫瘤方面的研究日趨增多。己糖激酶2 （hexokinase 2，HK2） 和M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2） 是有氧糖酵解調(diào)控過程中的關(guān)鍵限速酶。因此，可以通過降低糖酵解限速酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解，進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞的能量代謝，以達(dá)到抗癌的目的。目前關(guān)于GAA 對NSCLC 糖酵解的影響及其作用機(jī)制的報(bào)道較少。本研究探討不同劑量GAA 對NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲及糖酵解方面的影響，并闡明其作用機(jī)制， 為GAA 對NSCLC 的臨床治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器

NSCLC PC9細(xì)胞（北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室凍存）。GAA （純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國BI 公司），Transwell 小室試劑盒（美國Corning 公司）， 噻唑藍(lán)（methylthiazolydiphenyltetrazolium，MTT）（美國Sigma 公司）， 葡萄糖檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）， ATP 檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒（上海碧云天公司）， 逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒（北京艾德實(shí)驗(yàn)室生物技術(shù)有限公司）、 PKM2、 HK2 和甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceralde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）。PCR儀（型號：Veriti96，美國ABI 公司），蛋白質(zhì)電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Syngene 公司）， 酶標(biāo)儀（型號：1681130A，美國Bio-Rad 公司）。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

PC9 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10% FBS 和1% 青-鏈霉素的DMEM 及RIPM 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2 的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將 PC9 細(xì)胞分為空白對照組、 低劑量 GAA（25 μmol·L－1 GAA） 組、中劑量GAA （50 μmol·L－1GAA） 組和高劑量GAA （100 μmol·L－1 GAA） 組，空白對照組細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)，未添加GAA。

1. 3 MTT 法檢測各組 PC9細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的PC9 細(xì)胞， 以5×10４mL－1 的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育24 h。分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，于24、48 和72 h 時取出96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄上清，每孔加入20 μL、0. 5% MTT 溶液的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后再次棄上清，每孔加入 150 μL 二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide， DMSO）， 設(shè)定波長為490 nm，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A） 值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率= （實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組PC9細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)

取對數(shù)生長期 PC9 細(xì)胞，細(xì)胞密度為 5×104 mL－1， 各組細(xì)胞中分別加入 0、 25、 50 和100 μmol·L－1 GAA， 在各組細(xì)胞中取200 μL 接種于Transwell 小室上層， 下室均加入FBS 培養(yǎng)基，培 養(yǎng) 48 h 后， 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphatebuffered saline， PBS） 洗滌， 4% 多聚甲醛固定30 min， 再用0. 1% 結(jié)晶紫染色15 min， 顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)并拍照。各組每孔隨機(jī)選取5 個視野計(jì)數(shù)細(xì)胞并取其平均值，每組重復(fù)3 次。

1. 5 葡萄糖含量檢測試劑盒檢測各組PC9細(xì)胞中葡萄糖攝取量

取對數(shù)生長期PC9細(xì)胞，細(xì)胞密度為 5×10４mL－1， 細(xì)胞接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入0、25、50 和 100 μmol·L－1 GAA， 給藥48 h 后，PBS 緩沖液洗滌2 次，采用不含葡萄糖的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2 h， 加入2-NBDG 溶液50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，參照葡萄糖含量檢測試劑盒說明書步驟操作，采用酶標(biāo)儀于波長570 nm 處檢測各孔A 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。葡萄糖攝取量= （實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 6 ATP檢測試劑盒檢測各組PC9細(xì)胞中ATP水平

取對數(shù)生長期PC9 細(xì)胞， 細(xì)胞密度為5×10４ mL－1， 接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，給藥48 h 后，每孔加入 100 μL 細(xì)胞裂解液冰上裂解 15 min，12 000 r·min－1 離心10 min， 取上清液。每個樣品中加入100 μL 以1∶6 稀釋的ATP 檢測試劑，暗室中靜置5 min，使試劑與ATP 充分反應(yīng)，立即向每孔添加10 μL 標(biāo)準(zhǔn)品，采用酶標(biāo)儀于波長570 nm 處檢測各孔A 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。ATP 水平= （實(shí)驗(yàn)組A 值－ 空白組A 值） / （對照組A 值－ 空白組A 值） ×100%。

1. 7 乳酸檢測試劑盒檢測各組PC9細(xì)胞中乳酸水平

取對數(shù)生長期 PC9 細(xì)胞， 細(xì)胞密度為 5×10４ mL－1，細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，給藥48 h 時，加入細(xì)胞裂解液，在1. 5 mL EP 管中，12 000 r·min－1離心30 min，取上清液，參照乳酸檢測試劑盒說明書操作。于波長570 nm 處檢測各孔A 值， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 乳酸水平= （實(shí)驗(yàn)組A 值－ 空白組A 值） / （對照組A 值－ 空白組A 值） ×100%。

1. 8 實(shí) 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR， RT-qPCR）法檢測各組PC9細(xì)胞中 HK2和 PKM2 mRNA表達(dá)水平

收集各組給藥后48 h 的 PC9 細(xì)胞，采用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Primer 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物， 引物序列： HK2 上游引物， 5'-AGAACATCCTGTGGCTGGAC-3'， 下游引物， 5'-ACCTTTCTGCTTCACCTGGA-3'， 擴(kuò)增產(chǎn)物為466 bp；PKM2上游引物，5'-ACAACGTCTFCTGTCCAC-3'， 下游引物， 5'-TAACTGGATGTGACACAGAG-3'， 擴(kuò)增產(chǎn)物為325 bp； GAPDH 上游引物，5'-CGTGGGGGTCTTAATGACCA-3'， 下游引物， 5'-TCCAGAAGGACTCCTCCTTG-3'， 擴(kuò)增產(chǎn)物為509 bp。PCR 反應(yīng)條件： 60 ℃ 、2 min，94 ℃ 、2 min 預(yù)變性； 變性94 ℃ 、2 min； 退火60 ℃、1 min；循環(huán)40 次，延伸72 ℃、10 min。采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平，每組重復(fù)3 次。

1. 9 Western blotting 法 檢 測 各 組 PC9 細(xì) 胞 中HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)生長期PC9細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×10４mL－1，接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA 處理48 h。 收集各組細(xì)胞，采用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。取25 μg 總蛋白， 經(jīng)10% SDS-PAGE 膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，以5% 脫脂奶粉室溫封閉。加入一抗，HK2 和PKM2 以1∶200 稀釋，GAPDH 以1∶1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST 溶液清洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗。采用ECL 顯色曝光成像，成像分析系統(tǒng)攝取圖像，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、乳酸水平、葡萄糖攝取量、ATP 水平、HK2 和PKM2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組 PC9 細(xì)胞存活率

培養(yǎng) 24、48 和 72 h時，與空白對照組比較，低劑量GAA 組PC9 細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。培養(yǎng)24 和48 h 時，與低劑量GAA 組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；培養(yǎng)72 h 時，與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。見表1。

2. 2 各組 PC9 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)

與空白對照組（108. 69 個±4. 66 個） 比較，低劑量GAA 組PC 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)（97. 29 個±5. 20 個） 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 中劑量GAA 組（84. 34 個±4. 98 個） 和高劑量GAA 組（77. 76 個±4. 35 個）PC9 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 05）。與低劑量GAA 組比較， 高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 3 各組 PC9細(xì)胞中葡萄糖攝取量、ATP水平及乳酸水平

與空白對照組比較，低劑量 GAA 組PC9 細(xì)胞中葡萄糖攝取量、ATP 水平和乳酸水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中葡萄糖攝取量及乳酸水平均明顯降低（Plt;0. 05）； 中劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中ATP 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中ATP 水平明顯降低（Plt;0. 05）。見表2。

2. 4 各組 PC9 細(xì)胞中 HK2 和 PKM2 mRNA 表達(dá)水平

與空白對照組比較，低劑量GAA組PC9細(xì)胞中HK2 和PKM2 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中HK2 及PKM2 mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖2。

2. 5 各組 PC9 細(xì)胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較，低劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05），中和高劑量GAA 組PC9細(xì)胞中HK2 及PKM2 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖3。

3 討 論

晚期NSCLC 的生存率較低，腫瘤有氧糖酵解產(chǎn)生的乳酸與腫瘤的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)具有一定的相關(guān)性［10-11］。研究［12-14］ 顯示： 乳酸產(chǎn)生可以促進(jìn)腫瘤血管生成、誘使腫瘤局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、減少機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移性。因此， 通過測定腫瘤細(xì)胞消耗葡萄糖量、ATP 水平和乳酸水平， 可以判斷腫瘤細(xì)胞糖酵解情況。本研究以NSCLC PC9 細(xì)胞為研究對象，觀察不同劑量GAA 對PC9 細(xì)胞的生物活性、糖酵解產(chǎn)物和糖酵解關(guān)鍵限速酶的影響。本研究結(jié)果顯示： 采用不同劑量GAA 處理PC9 細(xì)胞24、48 和72 h 后，中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞增殖受到抑制。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，隨著GAA 劑量升高， PC9 細(xì)胞遷徙細(xì)胞逐漸減少；與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞對葡萄糖攝取量及乳酸水平明顯降低， 高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞ATP 水平明顯降低。提示GAA濃度升高可以抑制PC9 細(xì)胞的生物學(xué)活性，抑制有氧糖酵解，阻斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，并可以作為重要的抗癌治療手段。

PKM2 是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，對腫瘤的生長和增殖具有重要作用。研究［15-18］ 發(fā)現(xiàn)： 在肝癌、胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在PKM2 蛋白過表達(dá)。降低PKM2 蛋白表達(dá)水平，減弱腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19-20］。HK2 是有氧糖酵解的第一個關(guān)鍵限速酶， 與腫瘤相關(guān)性較高。研究［21-22］ 顯示：抑制HK2 活性可降低有氧糖酵解水平。GAA 抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用已被證實(shí)［23］，但是GAA 抗腫瘤的作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示：中和高劑量GAA 組PC9 細(xì)胞中PKM2 和HK2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示可以通過限制糖酵解及其關(guān)鍵限速酶的活性，抑制糖酵解關(guān)鍵限速酶PKM2 和HK2 蛋白表達(dá)， 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用。

綜上所述，GAA 劑量升高可以抑制PC9 細(xì)胞的存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、葡萄糖攝取量、ATP 水平、乳酸水平、HK2 和PKM2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平， 其主要作用機(jī)制可能與HK2 和PKM2 蛋白表達(dá)有關(guān)。GAA 在抑制PC9 細(xì)胞糖酵解方面發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果為探討抗NSCLC 的輔助用藥提供了理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：任愛華和董彥伯參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文撰寫，苗潤芝參與數(shù)據(jù)收集和分析，呂俞嬌參與論文結(jié)果分析和討論，劉巖峰參與論文寫作指導(dǎo)和審校。

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[基金項(xiàng)目] 吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（JJKH20220069KJ，JJKH20180355KJ）；北華大學(xué)省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202310201135）