DNA病毒和RNA病毒對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

肖國城，袁富 ，武子琪，劉勇，韓佩君

1 中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100853；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科；3 空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員六大隊；4 空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系；5 空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天衛(wèi)生學(xué)教研室

病毒是一類極具感染性的微生物，嚴(yán)格寄生于宿主細(xì)胞中，以復(fù)制的方式進(jìn)行繁殖。病毒在與宿主細(xì)胞長期的相互作用中，逐漸建立和形成了一系列有利于其增殖、傳播和抵抗宿主防御等機(jī)制。病毒可通過病毒蛋白和核酸調(diào)控宿主細(xì)胞的新陳代謝和生理狀態(tài)，構(gòu)建有助于其增殖的細(xì)胞環(huán)境。研究［1］發(fā)現(xiàn)，病毒可通過調(diào)控糖酵解途徑，增加代謝中間產(chǎn)物的產(chǎn)量，進(jìn)而為其復(fù)制或者子代病毒產(chǎn)生提供所需物質(zhì)。正常生長狀態(tài)下哺乳動物細(xì)胞主要通過有氧氧化分解葡萄糖產(chǎn)能，葡萄糖經(jīng)多個步驟被轉(zhuǎn)變成丙酮酸，在有氧情況下將丙酮酸轉(zhuǎn)入線粒體，進(jìn)入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)，最終驅(qū)使電子鏈傳遞。而缺氧條件下，葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中被分解成為丙酮酸的過程被稱為糖酵解，丙酮酸可在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸并被泵出細(xì)胞［1］。一些病毒可誘導(dǎo)有氧糖酵解，即Warburg效應(yīng)。病毒感染細(xì)胞時，細(xì)胞葡萄糖吸收、代謝水平增加，病毒可進(jìn)一步激活糖酵解途徑，產(chǎn)生更多的三磷酸腺苷（ATP）、還原型輔酶1（NADH）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH），為高耗能的基因復(fù)制和病毒組裝提供能量。激活的糖酵解途徑也可為病毒復(fù)制和組裝所需核苷酸、脂類、氨基酸和碳水化合物等分子的合成提供碳源［2］。目前病毒對宿主細(xì)胞糖酵解的具體調(diào)控機(jī)制仍不明確，已有DNA病毒和RNA病毒通過病毒特異microRNA或病毒蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解增加的相關(guān)研究。現(xiàn)將病毒對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 DNA病毒對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制

一些DNA病毒可通過促進(jìn)宿主細(xì)胞糖酵解為其復(fù)制提供所需物質(zhì)，其中包括人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）、EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）和腺病毒（Adenovi-rus，AdV）等。其可通過促進(jìn)CaMKK表達(dá)、抑制GLUT 1表達(dá)、激活糖酵解途徑限速酶等途徑，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解，為其復(fù)制提供所需物質(zhì)，參與早期病毒復(fù)制。

1.1 HCMV對宿主細(xì)胞糖酵解途徑的調(diào)控機(jī)制 MUNGER等［3］進(jìn)行了首個病毒感染真核細(xì)胞的代謝組學(xué)研究，其通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定HCMV感染人成纖維細(xì)胞后胞內(nèi)60多種代謝物的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HCMV感染早期，人成纖維細(xì)胞糖酵解途徑的代謝產(chǎn)物水平變化差異較小，但在病毒感染后期，果糖-1，6-二磷酸酶（Fructose 1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BP）、磷酸二羥丙酮（Dihydroxyacetone phosphate， DHAP）、3- 磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）表達(dá)量增加。碳代謝流分析進(jìn)一步表明HCMV感染細(xì)胞后，細(xì)胞中通過糖酵解及三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)的碳流量增加。HCMV感染后宿主細(xì)胞糖酵解途徑表達(dá)量增加。進(jìn)一步探究其機(jī)制后發(fā)現(xiàn)，激活宿主細(xì)胞糖酵解途徑參與早期HCMV病毒復(fù)制中的蛋白表達(dá)［4］；抑制鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶（Calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK） 能夠阻斷HCMV對糖酵解的誘導(dǎo)，并且可抑制病毒復(fù)制、晚期病毒基因的合成以及子代病毒的生成［4］。不同的CaMKK和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）亞型以不同的方式參與調(diào)控病毒復(fù)制。CaMKK1在HCMV低感染復(fù)數(shù)（MOI）感染時發(fā)揮重要作用，但在病毒感染早期并不依賴AMPK激活。而在HCMV病毒高滴度感染狀態(tài)下，HCMV可特異性誘導(dǎo)宿主細(xì)胞AMPKa2亞單位表達(dá)，激活宿主細(xì)胞糖酵解途徑［5］。抑制宿主細(xì)胞CAMKK表達(dá)對單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）復(fù)制并沒有影響，但葡萄糖代謝抑制劑 2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG），對HCMV、HSV-1的復(fù)制均可產(chǎn)生抑制作用［4］。因此，病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解的機(jī)制具有病毒種屬特異性。

HCMV感染人成纖維細(xì)胞后還可抑制宿主細(xì)胞細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)。研究［6］發(fā)現(xiàn)，HCMV可下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glucose transporter 1，GLUT 1）的表達(dá)，同時促進(jìn)轉(zhuǎn)運效率更高的GLUT4表達(dá)。因此，HCMV可通過誘導(dǎo)GLUT的表達(dá)，來增加感染病毒的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的累積。IRENE等［7］研究發(fā)現(xiàn)，HCMV的UL38蛋白參與HCMV介導(dǎo)的糖酵解激活和氨基酸分解代謝。UL38可通過抑制宿主細(xì)胞腫瘤抑制蛋白TSC2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖和部分氨基酸的消耗量增加，為新病毒顆粒的生成提供能量和原料。

1.2 HSV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 HSV-1若要在Hela細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液中必須含有葡萄糖。在沒有葡萄糖的培養(yǎng)液中HSV-1雖能進(jìn)入Hela細(xì)胞，但后續(xù)沒有病毒復(fù)制，不產(chǎn)生感染性病毒顆粒。在加入2-脫氧葡萄糖（2-DG）的培養(yǎng)條件下，HSV-1病毒顆粒的復(fù)制并沒有明顯減少，但感染性病毒顆粒受到嚴(yán)重?fù)p害，可能是由于病毒糖蛋白表達(dá)異常導(dǎo)致的［8］。對另一種甲型皰疹病毒——偽狂犬病病毒的研究［9］結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加入2-DG的培養(yǎng)條件下偽狂犬病病毒可以進(jìn)行核酸復(fù)制和蛋白合成，但傳染性病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少。所以，在成熟病毒顆粒產(chǎn)生的過程中（包括病毒組裝和釋放階段）糖酵解發(fā)揮重要作用。

HSV利用葡萄糖提供的碳源用于嘧啶的生物合成，并不是像HCMV那樣誘導(dǎo)糖酵解用于TCA循環(huán)。HSV-1感染期間對糖酵解途徑的需求可能在于通過該途徑來增加病毒核苷酸的合成［10］。ABRANTES等［11］研究表明，HSV-1可激活糖酵解途徑的限速酶—磷酸果糖激酶-1，并且隨著病毒感染MOI的增加酶的活性隨之增加。GRADY等［12］在通過siRNA篩選參與病毒復(fù)制的代謝通路中研究發(fā)現(xiàn)，精氨基琥珀合成酶1可通過增加天冬氨酸的含量而在HSV-1的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。

1.3 KSHV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 KSHV一旦感染內(nèi)皮細(xì)胞，就會建立潛伏感染。雖然在潛伏感染期間，很少或根本不產(chǎn)生病毒顆粒，并不需要快速的代謝變化，但潛伏的病毒感染仍會誘導(dǎo)糖酵解的發(fā)生。DELGADO等［13］對內(nèi)皮細(xì)胞潛伏感染KSHV的代謝組學(xué)研究后發(fā)現(xiàn)，糖酵解以及乳酸等代謝物在潛伏感染期間被誘導(dǎo)產(chǎn)生，且該誘導(dǎo)部分與GULT3表達(dá)上調(diào)相關(guān)。同時，抑制糖酵解會引起潛伏感染細(xì)胞的死亡，說明糖酵解的誘導(dǎo)對于潛伏感染細(xì)胞的生存至關(guān)重要［13］。由此可見，病毒誘導(dǎo)糖酵解不僅是核酸復(fù)制或者病毒顆粒裝配和釋放所必需的，而且有可能為其在細(xì)胞中的存活提供一定幫助［14］。

YOGEV等［15］研究發(fā)現(xiàn)，KSHV的 microRNA可通過抑制宿主細(xì)胞線粒體的生物合成，誘導(dǎo)有氧糖酵解，促進(jìn)宿主細(xì)胞攝取葡萄糖。后續(xù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KSHV感染細(xì)胞后可通過外泌體將病毒編碼的microRNA特異性地轉(zhuǎn)移到周圍細(xì)胞，使周圍細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)向有氧糖酵解，從而提高KSHV對微環(huán)境的適應(yīng)性［16］，提示有可能KSHV此miRNA基因在誘導(dǎo)糖酵解中發(fā)揮主要作用。

1.4 EBV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 與KSHV相同，EBV在感染宿主細(xì)胞時可直接誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的糖酵解，維持宿主細(xì)胞的存活。EBV通過編碼潛伏膜蛋白1（Latent membrane protein 1，LMP1）參與誘導(dǎo)糖酵解［17］。進(jìn)一步研究［18］表明，LMP1不僅可增加細(xì)胞對葡萄糖和谷氨酰胺的攝取，還可增加乳酸脫氫酶（Actate dehydrogenase，LDHA）活性和乳酸的產(chǎn)生，降低丙酮酸激酶活性和丙酮酸濃度，成纖維細(xì)胞生長因子受體1（Fibroblast growth factor receptor1，F(xiàn)GFR1）信號途徑是 LMP1介導(dǎo)的糖酵解關(guān)鍵途徑。LMP1可降低線粒體的氧化磷酸化耗氧率和膜電位，促進(jìn)細(xì)胞外乳酸含量升高，改變鼻咽癌細(xì)胞線粒體功能來促進(jìn)Warburg效應(yīng)［19］。LMP1 還可激活下游分子 mTORC1進(jìn)而激活NF-κB信號通路，而NF-κB的活化參與LMP1誘導(dǎo)的GLUT1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，由此表明mTORC1/NF-κB/GLUT-1信號軸在EBV誘導(dǎo)的有氧糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。除LMP1之外，MYC蛋白及EBV miRNA可能在EBV誘導(dǎo)糖酵解過程中也發(fā)揮重要作用［20］。

1.5 AdV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 AdV是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，同樣可誘導(dǎo)糖酵解。THAI等［21］研究發(fā)現(xiàn)，5型AdV感染非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞將導(dǎo)致葡萄糖消耗和乳酸生成量增加，同時氧氣消耗減少，病毒E4ORF1基因產(chǎn)物可上調(diào)宿主細(xì)胞葡萄糖代謝，并且通過激活MYC來誘導(dǎo)增強(qiáng)上皮細(xì)胞的糖酵解。其作用機(jī)制為E4ORF1定位于細(xì)胞核，可與MYC結(jié)合并增強(qiáng)MYC與糖酵解靶基因的結(jié)合，從而導(dǎo)致特定糖酵解酶的表達(dá)增加。

除此之外，AdV毒感染可誘導(dǎo)進(jìn)入核苷酸合成的碳流量增加。將放射性標(biāo)記的葡萄糖添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中時，AdVDNA也將被標(biāo)記，表明部分碳源用于病毒基因組的合成。而當(dāng)E4ORF1不能激活MYC的AdV突變體時，進(jìn)入核苷酸合成的碳流和AdV DNA的復(fù)制就會受限。由此可見，AdV可通激活宿主細(xì)胞MYC表達(dá)，來促進(jìn)糖酵解和核苷酸合成，進(jìn)而促進(jìn) AdVDNA 復(fù)制。THAI等［21］還發(fā)現(xiàn)，敲除MYC后僅能導(dǎo)致低糖酵解率的上皮細(xì)胞中病毒滴度的下降，但在高糖酵解率的細(xì)胞中，對病毒滴度影響并不大，提示只有在糖酵解受限的特定細(xì)胞環(huán)境下，MYC和糖酵解的激活才可對AdV復(fù)制產(chǎn)生影響。

2 RNA病毒對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制

除DNA病毒外，丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）和甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）等RNA病毒也可能參與調(diào)控宿主細(xì)胞糖酵解。

2.1 HCV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 HCV是有包膜的正鏈RNA病毒。研究［22］發(fā)現(xiàn)，Huh7細(xì)胞感染HCV后細(xì)胞氧化磷酸化減少，同時對細(xì)胞外葡萄糖的依賴增加。除了增加對葡萄糖的需要，在HCV感染的細(xì)胞中乳酸產(chǎn)量也會增加。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果顯示，在HCV感染的Huh7細(xì)胞中，糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)增加。OLIVIER 等研究［23］發(fā)現(xiàn)，HCV對糖酵解的誘導(dǎo)可能與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A蛋白與HK2相互作用相關(guān)，二者直接相互作用導(dǎo)致HK2活性提高，提高宿主細(xì)胞糖酵解速率。最新研究［24］發(fā)現(xiàn)，HCV NS5A 蛋白的 D2結(jié)構(gòu)域（NS5A-D2）參與碳代謝的重新編程，NS5A-D2通過增加葡萄糖的消耗，減少糖原的儲存，來使細(xì)胞適應(yīng)HCV的復(fù)制。其中HCV NS5A-D2可激活己糖激酶同工酶—葡萄糖激酶（Glucokinase，GCK），而GCK是正常肝細(xì)胞糖酵解的第一個限速酶。HCV還可通過增加丙酮酸脫氫酶激酶（Pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）活性來增加糖酵解，從而為病毒的復(fù)制提供超額的核苷酸前體。當(dāng)培養(yǎng)液中加入半乳糖后，HCV的釋放嚴(yán)重受到阻礙，而且感染性病毒顆粒在胞內(nèi)多泡體（Multivesicular body，MVB） 中聚集。HCV 釋放過程中糖代謝的調(diào)節(jié)是由MAPK-p38磷酸化所介導(dǎo)［25］。所以，HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A是HCV誘導(dǎo)細(xì)胞糖酵解的關(guān)鍵分子，其可通過提高HK2、GCK等重要酶的活性來誘導(dǎo)細(xì)胞碳代謝的重編程，并為自身復(fù)制提供有利條件。

2.2 DENV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 FONTAINE等［26］研究發(fā)現(xiàn)，DENV2感染期間細(xì)胞葡萄糖消耗量增加，而減少外源葡萄糖供應(yīng)將明顯影響病毒的復(fù)制。此外，在DENV2感染后，GLUT1和HK2表達(dá)上調(diào)，通過藥物抑制糖酵解途徑后可顯著減少病毒 RNA的合成和感染性病毒顆粒的產(chǎn)生。所以，DENV感染過程中需要糖酵解的參與。LEE等［27］研究發(fā)現(xiàn)，DENV2感染可增加細(xì)胞自噬活性、葡萄糖攝取量以及GLUT1和 HK2蛋白表達(dá)的上調(diào)。但是DENV2感染可降低ATP水平，并且對HK2和磷酸果糖激酶的mRNA表達(dá)，以及乳酸的產(chǎn)生并不產(chǎn)生影響。此提示DENV2誘導(dǎo)糖酵解有可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄之后，并且與乳酸途徑無關(guān)。當(dāng)使用自噬抑制劑spautin-1或沉默Atg5基因表達(dá)時，可逆轉(zhuǎn)自噬活性、葡萄糖攝取、HK2表達(dá)水平以及病毒滴度的增加。由此可見，在DENV2感染中，糖酵解和自噬之間有可能存在某種調(diào)節(jié)機(jī)制，值得進(jìn)一步探索。

2.3 HIV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 近年來對逆轉(zhuǎn)錄病毒科下慢病毒屬的HIV的研究表明，逆轉(zhuǎn)錄病毒也能調(diào)控宿主細(xì)胞的代謝。有學(xué)者［28］從HIV感染的CD4+T細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)糖酵解發(fā)生變化。感染HIV-1的CD4+T細(xì)胞中，GULT和參加糖酵解的酶類HK1表達(dá)均有上調(diào)［29］。GABRIEL等［30］在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞孵育HIV gp120后，烯醇化酶2、己糖激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)上調(diào)，并且在gp120處理的細(xì)胞中，丙酮酸激酶活性與糖酵解指數(shù)增高。說明HIV gp120在通過誘導(dǎo)糖酵解來促進(jìn)病毒增殖中發(fā)揮了重要作用。KISHIMOTO等［31］研究發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解是維持逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性和將包膜蛋白充分包裝到HIV-1顆粒上所必需的，此表明在HIV-1感染細(xì)胞過程中有氧糖酵解環(huán)境可能有助于病毒生成的質(zhì)量控制。SHYTAJ等［32］通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HIV-1感染在潛伏期可降低糖酵解，而且病毒激活后可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。

CASTELLANO等［33］研究發(fā)現(xiàn)在HIV感染的巨噬細(xì)胞中并未檢測到糖酵解的變化，而是發(fā)現(xiàn)琥珀酸和其他一些TCA代謝產(chǎn)物的增加在介導(dǎo)氧化磷酸化（OXPHOS）中起到重要作用。關(guān)于HIV感染巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞后代謝的差異在之前已經(jīng)有學(xué)者［34］提出，而造成這種差異的原因可能與在HIV感染機(jī)體過程中，巨噬細(xì)胞通常維持長期感染，而CD4+T細(xì)胞通常發(fā)生急性的溶血性感染有關(guān)［1］。

2.4 IAV對宿主細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制 研究［35］發(fā)現(xiàn)，IAV感染單層雞胚細(xì)胞后，葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸在3 h內(nèi)均有明顯增加。一項靶向代謝組學(xué)研究［36］表明，兩株甲型H1N1流感病毒在感染哺乳動物細(xì)胞后8～12 h內(nèi)葡萄糖攝取、糖酵解酶和乳酸產(chǎn)生增加。隨著病毒復(fù)制的發(fā)生，糖酵解的增加與細(xì)胞凋亡是同步一致的，并且之間可能具有相關(guān)性。但有些病毒可誘導(dǎo)糖酵解而不促使細(xì)胞凋亡。FONTAINE等［26］發(fā)現(xiàn)，登革病毒在感染早期就誘導(dǎo)了糖酵解，但在感染后48 h仍繼續(xù)復(fù)制并產(chǎn)生病毒，表明細(xì)胞凋亡并未在感染早期發(fā)生。

綜上所述，病毒感染宿主細(xì)胞后，通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解，為其提供病毒復(fù)制及組裝所需原料和能量。DNA病毒可通過促進(jìn)CaMKK表達(dá)、抑制GLUT 1表達(dá)、激活糖酵解途徑限速酶等途徑，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解，參與早期病毒復(fù)制。RNA病毒可通過提高糖酵解相關(guān)酶表達(dá)，促進(jìn)GLUT1、HK2及HK1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞糖酵解，為病毒復(fù)制提供能量和原料。