五味子乙素對(duì)胰腺癌Pan02 細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討五味子乙素對(duì)胰腺癌 Pan02 細(xì)胞增殖的抑制作用， 并闡明其作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度 （0、0. 78、1. 56、3. 12、6. 25、12. 50和25. 00 mg·L－1 ） 五味子乙素作用下Pan02 細(xì)胞增殖率， 以選擇五味子乙素作用的最適濃度和最佳作用時(shí)間。小鼠胰腺癌Pan02 細(xì)胞分為對(duì)照組（0 mg·L－1 五味子乙素）、2. 5 mg·L－1 五味子乙素組、5. 0 mg·L－1 五味子乙素組和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組。光學(xué)顯微鏡觀察各組Pan02 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，5-乙基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU） 染色法檢測(cè)各組Pan02 細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期Pan02 細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率，Western blotting 法檢測(cè)各組Pan02 細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8法，五味子乙素作用Pan02細(xì)胞48和72 h后，與0 mg·L－1 五味子乙素比較，其他濃度五味子乙素作用下Pan02 細(xì)胞增殖率明顯降低（Plt;0. 01），72 h 時(shí)細(xì)胞抑制作用最明顯。選擇0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素作用Pan02 細(xì)胞，作用時(shí)間為72 h。對(duì)照組Pan02 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)良好，緊密且貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)正常；2. 5 和5. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞體積減小，細(xì)胞之間黏連消失，細(xì)胞膜雖完整但通透性增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生空泡結(jié)構(gòu)，部分呈碎片狀漂浮于溶液表面；10. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞有明顯凋亡小體生成，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。EdU 染色法， 與對(duì)照組比較， 2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－ 1 五味子乙素組 Pan02 細(xì)胞中 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯降低（Plt;0. 01）。流式細(xì)胞術(shù)，與對(duì)照組比較，2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1五味子乙素組Pan02 細(xì)胞S 期細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 01），G2/M 期細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 01），5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組G0/G1 期細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 01）； 與對(duì)照組比較， 2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法，與對(duì)照組比較，2. 5 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞中p27、B 細(xì)胞淋巴瘤2 （Bcl-2） 相關(guān)X 蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （cleaved Caspase-3） 和裂解的多聚二磷酸腺苷（ADP） 核糖聚合酶（cleaved PARP） 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）； 5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白（Cyclin） A2、Cyclin E2 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， p27、 Bax、 cleaved Caspase-3 和cleaved PARP 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。結(jié)論：五味子乙素具有抑制胰腺癌 Pan02 細(xì)胞增殖的作用，其作用機(jī)制可能與激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3） 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活p27 蛋白并誘導(dǎo)細(xì)胞周期S 期阻滯有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 五味子乙素； 胰腺腫瘤； Pan02 細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞周期

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R735.9 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

胰腺癌是癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因之一，每年全世界有超過(guò)40 萬(wàn)人因該疾病而死亡［1］。目前，放療、化療、免疫抑制治療和靶向制劑的應(yīng)用在大部分腫瘤治療中均取得了較好的效果，但相關(guān)治療方法在胰腺癌的治療中效果較差［2］。由于胰腺癌具有高度纖維化的腫瘤微環(huán)境，采用一般的癌癥治療方法治療效果并不理想。手術(shù)清除不徹底、免疫抑制劑效果差、可應(yīng)用化療藥物不良反應(yīng)大且耐藥嚴(yán)重等問(wèn)題均阻礙了胰腺癌的治療進(jìn)展［3-5］。因此，開(kāi)發(fā)新型可增強(qiáng)化療藥效果、降低化療藥物毒性且減少藥物耐藥性的中藥成分十分重要。五味子乙素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫和保肝等藥理作用［6-10］。同時(shí)，五味子乙素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用， 可以通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factor- kappa B，NF-κB） 信號(hào)通路和p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號(hào)通路，抑制肺癌細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程和細(xì)胞干性，進(jìn)而抑制肺癌異種移植瘤的增殖；通過(guò)調(diào)節(jié)HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA （HOX transcript antisenseintergenic RNA，HOTAIR）- 微小RNA（micro RNA，miRNA）-125a- 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR） 信號(hào)通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［11-12］。本研究探討五味子乙素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其可能的作用機(jī)制，為五味子乙素與化療藥物聯(lián)合用藥減輕化療藥物毒性的作用提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

小鼠胰腺癌Pan02細(xì)胞（上海富衡生物科技有限公司）。五味子乙素（上海源葉生物科技有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基和青- 鏈霉素（美國(guó) Gibco 公司）， 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）（澳大利亞ExCell Bio公司），12% 預(yù)制膠（南京艾思易生物科技有限公司），快速轉(zhuǎn)膜液（20×）（廣州佑佰生物制品有限公司），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）， Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GLPBIO 公司），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）， 5-乙基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine， EdU） 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（廣東銳博生物科技有限公司），RIPA 裂解液（江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司），細(xì)胞周期蛋白（Cyclin） A2、Cyclin E2、p27、B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-celllymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （cysteine aspartic acid protease-3，Caspase-3）、聚磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP） 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、β-actin、山羊抗兔IgG 偶聯(lián)HRP 抗體和馬抗小鼠IgG 偶聯(lián)HRP 抗體（美國(guó)Cell Signaling 公司）。 CO2 恒溫培養(yǎng)箱和Ⅱ級(jí)生物安全柜（新加坡ESCO 公司），超純水儀（廈門(mén)銳思捷公司），倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司），光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），酶標(biāo)儀（瑞士Spector 公司），離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠胰腺癌細(xì)胞系 Pan02細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 和1% 青-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中。待細(xì)胞融合度達(dá)到90% 時(shí)， 采用胰蛋白酶消化制備為單細(xì)胞懸液備用。五味子乙素溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 溶劑中，初始濃度為50 g·L－1。

1. 3 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度五味子乙素作用下Pan02細(xì)胞增殖率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Pan02細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔1×103 個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后， 分別加入含0、0. 78、1. 56、3. 12、6. 25、12. 50 和25. 00 mg·L－1 五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24、48 和72 h 后，棄含藥培養(yǎng)基。加入CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度（A） 值，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算不同濃度五味子乙素作用下Pan02 細(xì)胞增殖率，以選擇五味子乙素作用的最適濃度和最佳作用時(shí)間。細(xì)胞增殖率= （實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值） ／（對(duì)照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 4 細(xì)胞分組

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Pan02細(xì)胞分為對(duì)照組（0 mg·L－1五味子乙素）、2. 5 mg·L－1五味子乙素組、5. 0 mg·L－1五味子乙素組和10. 0 mg·L－1五味子乙素組。

1. 5 光學(xué)顯微鏡觀察各組 Pan02 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02 細(xì)胞，接種于3. 5 cm 培養(yǎng)皿中，每皿1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，分別加入含0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，采用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1. 6 EdU染色法檢測(cè)各組Pan02細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，按1∶1 000稀釋EdU 溶液，制備為50 μmol·L－1 EdU 無(wú)血清培養(yǎng)基，并分別加入含0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。經(jīng)固定和透化后，加入EdU 反應(yīng)復(fù)合物，室溫孵育30 min，Hoechst33342 復(fù)染細(xì)胞核。采用熒光顯微鏡觀察Pan02 細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性表達(dá)率。EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率= （EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)） ×100%。

1. 7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期 Pan02細(xì)胞百分率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Pan02 細(xì)胞，接種于3. 5 cm 培養(yǎng)皿中，每皿1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，加入含0、2. 5、 5. 0 和 10. 0 mg·L－1五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的乙醇溶液中， 4 ℃ 孵育30 min，離心后加入 RNase 溶液重懸， 再次孵育30 min，PBS 緩沖液離心重懸后，加入 PI 染色液，避光孵育 30 min。每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣品，采用流式細(xì)胞儀和Modfit 軟件分析各組不同細(xì)胞周期Pan02 細(xì)胞百分率。

1. 8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組 Pan02細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02 細(xì)胞，接種于3. 5 cm 培養(yǎng)皿中，每皿1×105 個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，加入含0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，胰酶消化，離心并收集細(xì)胞，BindingBuffer 溶液重懸。加入Annexin Ⅴ-APC 和PI 染色液，室溫孵育10 min，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣品，采用流式細(xì)胞儀和FlowJo 軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率= （早期凋亡細(xì)胞數(shù)+ 晚期凋亡細(xì)胞數(shù)） /總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 9 Western blotting法檢測(cè)各組 Pan02細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Pan02細(xì)胞，接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，每皿7×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后， 加入含0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1五味子乙素?zé)o血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，胰酶消化， 離心并收集細(xì)胞， 加入1 mL 蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑）。經(jīng)超聲裂解1 min，收集上清。測(cè)定各組蛋白濃度，4%～12%預(yù)制膠160 V、40 min 上樣，350 mA、35 min 快速恒流轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃ 孵育一抗（1∶ 1 000） 過(guò)夜， TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min， 對(duì)應(yīng)二抗（1∶ 1 500） 室溫孵育2 h。TBST 溶液洗膜3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)記錄各蛋白條帶。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平= 目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Graphpad Prism 9. 5. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖像。不同濃度五味子乙素作用下Pan02 細(xì)胞增殖率，各組Pan02 細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Dunnett’s t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度五味子乙素作用下 Pan02 細(xì)胞增殖率

不同濃度五味子乙素作用Pan02 細(xì)胞48 和72 h 后，與0 mg·L－1五味子乙素比較，其他濃度五味子乙素作用下Pan02 細(xì)胞增殖率均明顯降低（Plt;0. 01）， 作用72 h 時(shí)細(xì)胞抑制作用最明顯。因此，選擇0、2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素作用Pan02 細(xì)胞，作用時(shí)間為72 h。見(jiàn)表1。

2. 2 各組 Pan02細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

對(duì)照組 Pan02細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，狀態(tài)良好，緊密且貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)正常。2. 5和5. 0 mg·L－1五味子乙素組Pan02細(xì)胞體積減小，細(xì)胞之間黏連消失，細(xì)胞膜雖完整但通透性增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生空泡結(jié)構(gòu)，部分呈碎片狀漂浮于溶液表面。10. 0 mg·L－1五味子乙素組Pan02 細(xì)胞有明顯凋亡小體生成，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。見(jiàn)圖1。

2. 3 各組Pan02細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率

與對(duì)照組（89. 64%±0. 03%） 比較， 2. 5 mg·L－1 五味子乙素組（73. 82%±0. 01%）、5. 0 mg·L－1五味子乙素組（47. 91%±0. 28%） 組和10. 0 mg·L－1五味子乙素組（44. 74%±0. 05%） Pan02 細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯降低（Plt;0. 01）。見(jiàn)圖2。

2. 4 各組不同細(xì)胞周期 Pan02細(xì)胞百分率

與對(duì)照組比較，2. 5、5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞S 期細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 01），G2/M 期細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 01）； 5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組G0/G1 期細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 01）。見(jiàn)圖3 和表2。

2. 5 各組Pan02細(xì)胞凋亡率

與對(duì)照組（12. 43%±2. 02%） 比較，2. 5 mg·L－1五味子乙素組（21. 47%±1. 41%）、5. 0 mg·L－1 五味子乙素組（25. 70%±0. 57%） 和10. 0 mg·L－1五味子乙素組（30. 37%±0. 59%） Pan02 細(xì)胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）。見(jiàn)圖4。

2. 6 各組 Pan02 細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，2. 5 mg·L－1 五味子乙素組Pan02細(xì)胞中p27 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），Cyclin A2 和Cyclin E2 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；5. 0 和10. 0 mg·L－1五味子乙素組Pan02 細(xì)胞中Cyclin A2 和Cyclin E2 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），p27 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見(jiàn)圖5。

2. 7 各組Pan02細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，2. 5 mg·L－1五味子乙素組Pan02 細(xì)胞中Bax、裂解的Caspase-3 （cleaved Caspase-3） 和裂解的PARP （cleaved PARP） 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， Bcl-2 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）； 5. 0 和10. 0 mg·L－1 五味子乙素組Pan02 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， Bax、cleaved Caspase-3 和cleaved PARP 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見(jiàn)圖6。

3 討 論

五味子乙素是從中藥五味子中提取的木脂素類(lèi)化合物，具有抗氧化和抗應(yīng)激等作用，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性［13］。本研究結(jié)果顯示：五味子乙素可以明顯降低胰腺癌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期阻滯是常見(jiàn)的腫瘤治療方法，臨床上常用的化療藥物（甲氨蝶呤、氟尿嘧啶和阿糖胞苷等） 均是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期S 期阻滯發(fā)揮抗癌作用［14］。Cyclin 蛋白能夠正向調(diào)控細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK），從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。Cyclin A 與CDK 2 結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞周期由S 期進(jìn)入G2 期， 與CDK 1 結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)入M 期； Cyclin B 主要在細(xì)胞周期G2 期表達(dá)并與CDK 1 結(jié)合發(fā)揮作用；Cyclin D 與CDK 2 結(jié)合可在細(xì)胞周期G1 期發(fā)揮作用， 與CDK 4/6 結(jié)合加速細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期；Cyclin E 與CDK 2 的結(jié)合也可促進(jìn)細(xì)胞周期由S 期進(jìn)入G2 期［15］。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子（cyclin-dependent kinasesinhibitor，CKI） 中CDK 相互作用蛋白/激酶抑制蛋白（Cip/Kip） 家族是CDK 活性調(diào)控的重要機(jī)制之一， 廣泛抑制各種細(xì)胞周期蛋白和激酶活性［16］。p21 和p27 蛋白是主要的負(fù)調(diào)控因子，存在于細(xì)胞核內(nèi)，可與CDK 蛋白結(jié)合并抑制激酶活性，其中p21 抑制作用的最適底物為Cyclin E 和Cyclin A，p27 蛋白抑制的最適底物為Cyclin E 和Cyclin D。共同阻滯細(xì)胞由S 進(jìn)入G2 期［17-18］。本研究結(jié)果顯示：五味子乙素作用72 h，Pan02 細(xì)胞發(fā)生S 期阻滯。進(jìn)一步檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：p27 蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Cyclin A2 和Cyclin E2 蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示五味子乙素能夠通過(guò)上調(diào)p27 蛋白表達(dá)，使胰腺癌細(xì)胞由細(xì)胞周期S 期進(jìn)入G2 期過(guò)程受阻， 從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是特定基因調(diào)控后的主動(dòng)性死亡過(guò)程［19］。Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子，共同參與復(fù)雜的相互作用以調(diào)控細(xì)胞凋亡［20］。B 細(xì)胞淋巴瘤（B-cell lymphoma，Bcl） 蛋白是一種膜整合蛋白，主要存在于線粒體外膜、核膜和部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其家族中細(xì)胞死亡相關(guān)的Bcl-2 激動(dòng)劑（Bcl-2-associcated agonist of celldeath， Bad）、Bax 和BH3 結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白（BH3 interacting domain death agonist， Bid） 具有促凋亡作用，而B(niǎo)cl-2 和特大型Bcl 蛋白（Bcl-extralarge，Bcl-XL） 具有抗凋亡的作用。促凋亡Bax 蛋白和抗凋亡Bcl 蛋白之間的平衡決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性［21］。當(dāng)接受凋亡分子信號(hào)刺激時(shí)，位于線粒體中的促凋亡Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)線粒體外膜通透復(fù)合體（mitochondrial outermembrane permeabilization， MOMP） 形成， 導(dǎo)致細(xì)胞色素C 由線粒體間隙釋放至胞漿中，激活下游Caspase-3 蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［22］?？沟蛲龅鞍譈cl-2 主要存在于線粒體膜上，通過(guò)抑制胞漿鈣離子跨膜流動(dòng)，減少線粒體鈣超載并抑制線粒體膜電位變化，維持線粒體膜穩(wěn)定性，減少線粒體通透性改變，以此抑制細(xì)胞色素C 的釋放和功能，發(fā)揮抗凋亡的作用［23-24］。PARP 是細(xì)胞的骨架蛋白，在凋亡過(guò)程中 Caspase-3 家族蛋白降解PARP，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生變化［25］。本研究結(jié)果顯示：五味子乙素能夠誘導(dǎo)Pan02 細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：五味子乙素作用72 h，Bax、cleaved Caspase-3 和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示五味子乙素能夠通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2 比值，激活Caspase-3 依賴的凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，五味子乙素具有抑制胰腺癌Pan02細(xì)胞增殖的作用，其作用機(jī)制可能與激活Caspase-3通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活p27 蛋白并誘導(dǎo)細(xì)胞周期S 期阻滯有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：傅家財(cái)參與文獻(xiàn)檢索、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫(xiě)，秦玲莎和楊露參與文獻(xiàn)檢索及論文撰寫(xiě)，宋美慧參與數(shù)據(jù)整理和分析，張仙映和劉曉翠參與論文結(jié)果分析及討論，李鳳金和齊玲參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)及論文審校。

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