高磷誘導(dǎo)下肢血管平滑肌細(xì)胞成骨分化關(guān)鍵差異表達(dá)基因篩選及驗(yàn)證

［摘 要］ 目的：采用mRNA高通量測(cè)序技術(shù)篩選高磷誘導(dǎo)下肢血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）鈣化差異表達(dá)基因 （DEGs），分析VSMCs鈣化的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路。方法：將人VSMCs分為對(duì)照組和模型組，模型組細(xì)胞中加入高磷培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于相同條件下培養(yǎng)。調(diào)整2 組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VSMCs 的狀態(tài)，培養(yǎng)12 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)并拍照。采用Hisat2 軟件篩選DEGs，采用Stringtie 軟件從生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF） 和細(xì)胞成分（CC）3 個(gè)方面進(jìn)行基因本體論（GO） 功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG） 信號(hào)通路富集分析。Von Kossa 染色法觀察各組細(xì)胞鈣化情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)2 組細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （BMP2）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、腫瘤蛋白53 （Tp53）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4 （GPX4）、鐵蛋白輕鏈1 （Ftl1） 和糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D1 （GPLD1）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組共2 524個(gè)DEGs，其中1 368個(gè)DEGs表達(dá)上調(diào)，1 156個(gè)DEGs 表達(dá)下調(diào)； 2 組細(xì)胞DEGs 聚類(lèi)分離明顯。GO 功能和KEGG 信號(hào)通路富集分析表達(dá)上調(diào)的DEGs 主要參與微管細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)、細(xì)胞極性、蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞周期調(diào)控等BP，構(gòu)建細(xì)胞膜部分、微管組織、染色體和著絲粒區(qū)等CC， 發(fā)揮與磷脂酰肌醇磷酸鹽、Rho 鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶（GTPase） 蛋白結(jié)合、參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)蛋白激酶活性等MF；表達(dá)下調(diào)的DEGs 主要參與細(xì)胞質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)膜定位、mRNA 代謝和蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位等BP，構(gòu)建核糖體亞單位、細(xì)胞膜和自噬體等CC，發(fā)揮與單鏈DNA、核糖核蛋白復(fù)合物、生長(zhǎng)因子結(jié)合、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性和催化作用等MF。差異表達(dá)上調(diào)的基因富集7 條信號(hào)通路，其中最為顯著的是糖基磷脂酰肌醇（GPI） 錨定的生物合成；差異表達(dá)下調(diào)的基因富集18 條信號(hào)通路，其中最為顯著的是鐵死亡。RT-qPCR 法，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），GPLD1 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）； 與對(duì)照組比較， 模型組細(xì)胞中α-SMA mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），ALP和BMP2 mRNA表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 01）。結(jié)論：鈣化的VSMCs與正常細(xì)胞存在DEGs，鐵死亡和GPI 錨定的生物合成信號(hào)途徑是高磷誘導(dǎo)下肢VSMCs 鈣化的關(guān)鍵信號(hào)通路，主要由GPX4、Ftl1、Tp53 和GPLD1 共同介導(dǎo)完成。

［關(guān)鍵詞］ 血管平滑肌細(xì)胞； 成骨分化； 細(xì)胞鈣化； mRNA 測(cè)序； 鐵死亡

［中圖分類(lèi)號(hào)］ Q254 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

血管鈣化（vascular calcification， VC） 是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM） 的重要危險(xiǎn)因素， 其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs） 的成骨樣分化。與正常人群比較，T2DM 患者的VC 患病率明顯升高［1-3］。與T2DM 有關(guān)的VC 在線(xiàn)粒體功能障礙［4］、慢性炎癥［5］ 和自噬［6］ 等方面的研究有新的進(jìn)展，但其研究方向多集中于心血管動(dòng)脈粥樣硬化［7］ 和慢性腎病［8］ 等方面， 糖尿病下肢VC 的研究較少。臨床針對(duì)糖尿病下肢VC 的治療較為困難，尚無(wú)特效藥物，主要以預(yù)防為主。因此，探討糖尿病下肢VC 的發(fā)病機(jī)制有助于臨床精準(zhǔn)治療，對(duì)提高患者生存質(zhì)量及預(yù)后具有重要意義。目前，糖尿病下肢VC 具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展， 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq） 技術(shù)和生物信息學(xué)分析在醫(yī)學(xué)及藥學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，可輔助相關(guān)醫(yī)藥學(xué)研究。本研究基于RNA-Seq 技術(shù)篩選并驗(yàn)證高磷誘導(dǎo)下肢VSMCs 鈣化中差異表達(dá)基因（differentiallyexpressed genes， DEGs）， 分析關(guān)鍵差異基因及信號(hào)通路，為糖尿病VC 發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人 VSMCs（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。總RNA 文庫(kù)制備相關(guān)試劑盒（美國(guó)因美納公司），核酸片段篩選試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司），SuperScript Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)賽默飛公司），鐵蛋白輕鏈1 （ferritin light polypeptide-1，F(xiàn)tl1）、腫瘤蛋白53 （tumor protein 53，Tp53）、糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D1 （glycosylphosphatidy linositol specific phospholipase D1，GPLD1） 和谷胱甘肽過(guò)氧化酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4） 試劑盒（英國(guó)Abcam 公司），4% 多聚甲醛（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司），Von Kossa 銀溶液（上?？道噬锟萍加邢薰荆?。超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司）， 酶標(biāo)儀（美國(guó) BioTek 公司），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），紫外分光光度計(jì)（型號(hào)：NanoDrop 2000）、熒光定量?jī)x（型號(hào)：Invitrogen Qubit 3. 0）、 PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)：ABI 2720 Thermal Cycler） 和 Ambion 磁性底座（美國(guó)賽默飛公司），離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf 5810R，德國(guó)艾本德公司），核酸電泳分析儀（型號(hào)：Agilent2100 bioanalyzer， 美國(guó)安捷倫公司）， 基因測(cè)序儀（型號(hào)：Illumina novaseq 6000，美國(guó)因美納公司），實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR） 儀（瑞士羅氏公司）。

1. 2 細(xì)胞分組和造模

將人 VSMCs分為對(duì)照組和模型組。根據(jù)參考文獻(xiàn)［9-10］ 中方法建立模型。模型組細(xì)胞中加入高磷培養(yǎng)基（含10 mmol·L－1β-甘油磷酸鹽、50 g·L－1維生素C 和 1×10－7 mol·L－1胰島素的高糖DMEM 培養(yǎng)基） 誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，于37 ℃、5% CO2 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。為模擬T2DM 患者體內(nèi)環(huán)境， 在鈣化誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞中加入50 mg·L－1 氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein， ox-LDL） 和10 μmol·L－1 羧甲基賴(lài)氨酸（Nε-carboxymethyl-lysine，CML）。對(duì)照組細(xì)胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于模型組相同條件下培養(yǎng)。調(diào)整2 組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VSMCs的狀態(tài)，培養(yǎng)12 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)并拍照。由合肥麟美生物科技有限公司提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1. 3 DEGs 篩選和基因本體論（Gene Ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書(shū)（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析

采用Hisat2軟件篩選DEGs，采用Stringtie 軟件從生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function， MF） 和細(xì)胞成分（cellular componen，CC） 3 個(gè)方面進(jìn)行GO 功能及KEGG 信號(hào)通路富集分析。采用微生信在線(xiàn)作圖（http：//www. bioinformatics. com. cn/） 進(jìn)行可視化處理，繪制圖像。

1. 4 Von Kossa 染色法觀察各組細(xì)胞鈣化情況

采用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，加入Von Kossa 銀溶液， 強(qiáng)光照射15～60 min， 蒸餾水洗滌1 min，加入硫代硫酸鈉溶液處理2 min。Van Gieson 染色液復(fù)染細(xì)胞，于電鏡下觀察并拍照。

1. 5 RT-qPCR 法 檢 測(cè) 2 組 細(xì) 胞 中 堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （alpha-smooth muscle actin， α-SMA）、Tp53、GPX4、Ftl1和 GPLD1 mRNA 表達(dá)水平

采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。采用2—△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 23. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組細(xì)胞中ALP、BMP2、α-SMA、Tp53、GPX4、Ftl1 和GPLD1 mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 2組細(xì)胞 DEGs和聚類(lèi)分析

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞共有2 524 個(gè)DEGs， 其中1 368 個(gè)DEGs 表達(dá)上調(diào)， 1 156 個(gè)DEGs 表達(dá)下調(diào)。將DEGs 進(jìn)行聚類(lèi)分析， 結(jié)果顯示： 2 組細(xì)胞DEGs聚類(lèi)分離明顯。見(jiàn)圖1。

2. 2 GO 功能和 KEGG 信號(hào)通路富集分析

表達(dá)上調(diào)的DEGs 主要參與微管細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)、細(xì)胞極性、蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞周期調(diào)控等BP，構(gòu)建細(xì)胞膜部分、微管組織、染色體和著絲粒區(qū)等CC， 發(fā)揮與磷脂酰肌醇磷酸鹽、Rho 鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶（guanosine triphosphatase， GTPase） 蛋白結(jié)合、參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)蛋白激酶活性等MF；表達(dá)下調(diào)的DEGs 主要參與細(xì)胞質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)膜定位、mRNA 代謝和蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位等BP，構(gòu)建核糖體亞單位、細(xì)胞膜和自噬體等CC，發(fā)揮與單鏈DNA、核糖核蛋白復(fù)合物、生長(zhǎng)因子結(jié)合、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性和催化作用等 MF。 見(jiàn)圖2。 差異表達(dá)上調(diào)的基因富集 7 條信號(hào)通路，其中最為顯著的是糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI） 錨定的生物合成； 表達(dá)下調(diào)的 DEGs 富集18 條信號(hào)通路，其中最為顯著的是鐵死亡。GPI 錨定的生物合成信號(hào)通路中共3 個(gè)上調(diào)的DEGs，分別為磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成V（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesisclass V，Pigv）、GPLD1 和磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成C （phosphatidylinositol glycan anchorbiosynthesis class C，Pigc）。鐵死亡信號(hào)通路共8 個(gè)下調(diào)的 DEGs， 分別為 LOC100360087、AABR07004746. 1、Ftl1、Rho 家族相互作用細(xì)胞極化調(diào)節(jié)因子2 （Rho family interacting cellpolarization regulator 2，Ripor2）、精脒/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1，Sat1）、GPX4、Tp53 和電壓依賴(lài)性陰離子通道2 （voltage-dependent anionchannel 2，Vdac2）。見(jiàn)圖3。

2. 3 2組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

Von Kossa染色法觀察可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常，細(xì)胞密度高，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯的鈣化細(xì)胞；模型組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞密度較低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，可見(jiàn)明顯的鈣化細(xì)胞黑褐色位點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

2. 4 2組細(xì)胞中 α-SMA、ALP 和 BMP2 mRNA 表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中 α -SMAmRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， ALP 和BMP2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。見(jiàn)表2。

2. 5 2組細(xì)胞中GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1 mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中 GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， GPLD1 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。見(jiàn)表3。

3 討 論

目前全球糖尿病患病率逐年升高， 預(yù)計(jì)至2030 年約有5. 784 億人患有糖尿?。?1］。VC 是糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是糖尿病患者疾病惡化、心血管疾病發(fā)病率升高和患者死亡的危險(xiǎn)因素。VSMCs 是負(fù)責(zé)血管功能的主要細(xì)胞，在受到氧化應(yīng)激和高葡萄糖水平等條件刺激時(shí)， 分泌大量的ALP、α-SMA 和BMP2 等骨相關(guān)蛋白，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，由原始的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞樣表型［12］。重組BMP2 增強(qiáng)了高鈣和磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化，同時(shí)失去收縮表型標(biāo)記α-SMA［12-13］。細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生局部的前鈣化促進(jìn)內(nèi)側(cè)鈣化環(huán)境，為鈣和磷酸鹽提供成核位點(diǎn)沉淀及磷酸鈣晶體生長(zhǎng)。

為更好地從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平了解糖尿病下肢VC的發(fā)病機(jī)制，本研究采用高磷誘導(dǎo)人下肢VSMCs鈣化，RNA-seq 技術(shù)分析DEGs，結(jié)果顯示：鈣化細(xì)胞中共有2 524個(gè)DEGs，其中1 368個(gè)上調(diào)，1 156個(gè)下調(diào)；對(duì)照組和模型組細(xì)胞DEGs 聚類(lèi)顯著分離。DEGs 通過(guò)參與微管細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞周期調(diào)控、mRNA 代謝和蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位等細(xì)胞BP 影響細(xì)胞鈣化的發(fā)生。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示：高磷誘導(dǎo)的下肢VSMCs中上調(diào)的DEGs 主要富集于7 條信號(hào)通路上，最顯著的是GPI 錨定的生物合成途徑。GPLD1 與多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)， 可以裂解細(xì)胞膜上被GPI 錨定的蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如糖脂代謝調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病調(diào)控等［14-16］。研究［17］ 顯示：糖尿病模型大鼠血液中GPLD1 水平顯著高于正常組大鼠。GPLD1 通過(guò)裂解GPI 錨定細(xì)胞膜蛋白，上調(diào)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)，影響糖尿病進(jìn)程［18］。研究［19］ 顯示： 胰島素可以抑制GPLD1 的合成， 降低血循環(huán)中 GPLD1 水平， 改善大鼠血糖。本研究結(jié)果顯示：下調(diào)的DEGs 主要富集于18條信號(hào)通路上，最為顯著的是鐵死亡途徑。細(xì)胞中鐵蛋白重鏈1 （ferritin heavy polypeptide 1，F(xiàn)th1） 和Ftl1 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致鐵過(guò)載［20］。鐵過(guò)載通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和鐵死亡而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞鈣化。鐵螯合劑和鐵死亡抑制劑可減輕鐵過(guò)載引起的鐵死亡及鈣化［21］。在促成骨條件下，鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)谷胱甘肽（glutathione，GSH） 消耗，促進(jìn)VSMCs 鈣化，而N-乙酰半胱氨酸補(bǔ)充GSH，抑制VSMCs 鈣化。高鈣和磷酸鹽下調(diào)GPX4 的表達(dá)，并降低谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，促進(jìn)VSMCs 鈣化［8］。

本研究結(jié)果顯示：模型組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，有明顯的鈣化點(diǎn)， 表明高磷誘導(dǎo)的VSMCs 發(fā)生鈣化。為進(jìn)一步驗(yàn)證參與細(xì)胞鈣化的關(guān)鍵分子，本研究在生物信息學(xué)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞鐵死亡通路的GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達(dá)水平明顯降低， GPI 錨定的生物合成通路的GPLD1 mRNA 表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)表型蛋白α-SMA mRNA 表達(dá)水平明顯降低，ALP 和BMP2mRNA 表達(dá)水平明顯升高。提示高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化可能是由鐵死亡和GPI 錨定的生物合成途徑共同介導(dǎo)完成的。

綜上所述， 鈣化的VSMCs 與正常細(xì)胞存在DEGs 的基因，鐵死亡和 GPI 錨定的生物合成信號(hào)途徑是高磷誘導(dǎo)下肢 VSMCs 鈣化的關(guān)鍵信號(hào)通路，主要由GPX4、Ftl1、Tp53 和GPLD1 共同介導(dǎo)完成。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：倪英群參與論文選題、研究設(shè)計(jì)、論文撰寫(xiě)和審校，楊矛、楊迪和郭呈林參與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 朱文君、俞雅琴、盧芹、駱金芝和吳春琴參與數(shù)據(jù)采集及文獻(xiàn)檢索，方朝暉參與論文選題、研究設(shè)計(jì)和論文審校。

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