黔產(chǎn)多須公薄層色譜鑒別方法研究與建立

摘 要：為建立一種黔產(chǎn)多須公Eupatorium chinense Linn.的薄層色譜鑒別方法，參照薄層色譜法（通則0502），以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，對展開劑、點(diǎn)樣量、提取方式、提取溶劑、顯色劑、檢視波長、不同廠家硅膠G板、環(huán)境條件（濕度、溫度）等因素進(jìn)行了方法學(xué)考察.結(jié)果顯示，多須公藥材薄層色譜鑒別最佳方法為供試品點(diǎn)樣量為5μL、標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣量為2μL、展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）、顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液、顯色溫度為105℃、檢視波長為365 nm，此外，研究發(fā)現(xiàn)，提取溶劑、提取方式和不同廠家硅膠G板及環(huán)境條件（濕度、溫度）對薄層色譜法的鑒別影響不大.本方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，可用于黔產(chǎn)多須公藥材薄層色譜定性鑒別.

關(guān)鍵詞：多須公；薄層色譜法；槲皮素；定性鑒別

中圖分類號(hào)：R284.1" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" 文章編號(hào)：1673-9329（2024）03-056-07

多須公又稱水澤蘭、花桿升麻、野升麻等，為菊科澤蘭屬植物華澤蘭Eupatorium chinense Linn.的干燥根，具有清熱利咽、涼血散瘀、解毒消腫的功效，主治咽喉腫痛、吐血、赤白下痢、跌打損傷、癰瘡腫毒、外傷腫痛、毒蛇咬傷等[1-5]，其味苦、甘、寒，歸肺、肝經(jīng)，主要含黃酮苷、酚類、氨基酸、有機(jī)酸和香豆素類化合物，為貴州省少數(shù)民族人民常用中草藥，素有喉科圣藥之稱.多須公多生于山坡、路旁、林緣、林下或灌叢中，廣泛分布于貴州梵凈山、德江、沿河、雷公山、錦屏和貴陽等地[6-8].《新華本草綱要》《中華本草》《中國植物志》《廣東省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》《貴州中草藥資源研究》中均有記載.為更好地保證多須公藥材質(zhì)量，全面落實(shí)橋頭堡政策，開發(fā)利用好多須公藥材，本文對多須公薄層色譜鑒別方法進(jìn)行了研究，以期為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考和依據(jù).

1實(shí)驗(yàn)藥材、試劑及儀器

1.1實(shí)驗(yàn)藥材

實(shí)驗(yàn)用11批藥材均采集于貴州省各地，藥材采集信息詳見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為菊科澤蘭屬植物華澤蘭Eupatorium chinense Linn.

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)設(shè)備有：XSR 204型精密電子分析天平（梅特勒托利多公司）、DFY-500型500克搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、蜀?！Ａx器（四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司）、SK 8200 HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、CHG-9420A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、WFH-203B三用紫外分析儀（上海精科公司）、單列六5L（DK-98-ⅡA）型電熱恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）.

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)試劑包括95%乙醇（分析純，批號(hào)20230709，成都金山化學(xué)試劑有限公司），甲醇（分析純，批號(hào)20221112，成都金山化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（AR，批號(hào)20221020太倉滬試劑有限公司），甲苯（AR，批號(hào)20230215，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司），石油醚沸程60～90℃（分析純，批號(hào)20220918，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），環(huán)己烷（分析純，批號(hào)20230617，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲酸（AR，批號(hào)20230508，天津市富宇精細(xì)化工有限公司），鹽酸（AR，批號(hào)20221220，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）和二氯甲烷（分析純，批號(hào)20221115，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）.

1.4實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料有硅膠G板（預(yù)制板，批號(hào)20191212，青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司），硅膠G板（預(yù)制板，批號(hào)20170912，青島海洋化工有限公司）和槲皮素（中檢院，批號(hào)100081-201610）.

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1樣品的制備

取11批多須公藥材各1 000 g，切段，于干燥箱中50℃烘干，打粉過三號(hào)篩，密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?

2.2樣品溶液的配制

稱取多須公粉末約5.00 g，于250 mL具塞錐形瓶中，加入75%乙醇溶液100 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，加50 mL水使殘?jiān)芙猓⒓礊V過，用石油醚（60～90℃）提取濾液兩次，每次25 mL，棄石油醚層，水層加10%鹽酸溶液20 mL，80℃1h加熱水解，用乙酸乙酯萃取兩次，每次25 mL，合并乙酸乙酯層，水浴揮干，殘?jiān)? mL75%乙醇溶液溶解作為供試品溶液[9].

2.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品約10.00 mg加75%乙醇溶解，制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)

按照（《中國藥典》2020版四部通則0502）薄層色譜法試驗(yàn)[10]，取標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL供試品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開劑，展距大于15 cm，以3%三氯化鋁乙醇溶液，105℃下顯色，365 nm紫外光下檢視，供試品溶液色譜與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn).

2.5展開劑系統(tǒng)的考察

取2.2項(xiàng)下樣品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，于同一硅膠G板上，在各展開劑系統(tǒng)中展開，取出，晾干揮去有機(jī)溶劑，照2.4項(xiàng)下顯色、檢視.分別考察了展開劑系統(tǒng)①環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸-石油醚（60～90℃）（4∶5∶0.3∶2）、展開劑系統(tǒng)②二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶2∶1）、展開劑系統(tǒng)③甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）的薄層層析效果.研究發(fā)現(xiàn)，選擇展開劑系統(tǒng)③為展開劑時(shí)，薄層板中的斑點(diǎn)最清晰、分離度最好，如圖1所示.故選擇展開劑系統(tǒng)③為展開劑.

2.6取樣量考察

分別取2.2項(xiàng)下的供試品溶液2 μL、3 μL、5 μL，2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL于同一硅膠G板上，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果見圖2.由圖2可知，供試品溶液點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)，斑點(diǎn)清晰最能滿足實(shí)驗(yàn)要求，故選擇點(diǎn)樣量為5 μL最佳.

2.7不同提取溶劑考察

稱取多須公粉末約5.00 g，2份，置于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入100 mL 75%乙醇、甲醇，照2.2項(xiàng)下制成供試品溶液，取供試品溶液5 μL、2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，于同一硅膠G板上，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，75%乙醇和甲醇提取，結(jié)果差別不大.從安全經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇75%乙醇作為提取劑

2.8不同提取方式考察

稱取多須公粉末約5.00 g，2份，置于250 mL具塞錐形瓶中，各加入100 mL 75%乙醇，分別進(jìn)行超聲30 min和回流30 min，照2.2項(xiàng)下制成樣品溶液.取樣品溶液5 μL，2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，超聲和回流方式對薄層層析結(jié)果影響不大.

2.9 不同顯色劑考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，并考察不同顯色劑顯色時(shí)的薄層層析結(jié)果，結(jié)果見圖5.研究發(fā)現(xiàn)，3%三氯化鋁乙醇溶液顯色，斑點(diǎn)顏色清晰較好.

2.10不同檢視波長考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，并分別考察365 nm和254 nm波長下的檢視結(jié)果，結(jié)果見圖6.由圖6可知，365 nm波長下檢視，斑點(diǎn)顏色清晰較好，故選擇檢視波長365 nm.

2.11不同廠家硅膠G板考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，分別點(diǎn)于不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板上，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果見圖7.研究發(fā)現(xiàn)，在不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上進(jìn)行點(diǎn)樣層析，其斑點(diǎn)顯色均清晰且分離較好.

2.12 展開濕度考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，于25℃、相對濕度分別為85%、50%、30%的條件下，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果圖8所示.研究發(fā)現(xiàn)，不同濕度條件下進(jìn)行薄層層析，其色譜圖整體一致，說明該方法受濕度的影響不明顯.

2.13 展開溫度考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，于相對濕度為50%，溫度分別為5℃、25℃和35℃的條件下，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果見圖9.由圖9可知，在5℃～35℃時(shí)，其色譜圖變化不大，說明該方法受溫度的影響不明顯.

2.14穩(wěn)定性考察

稱取多須公粉末約5.00 g，照2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，再將供試品溶液分別放置0d、1d、2d.取供試品溶液5 μL和2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL，照2.4項(xiàng)下展開、顯色、檢視，結(jié)果如圖10所示.由圖10可知，分別放置0d、1d、2d的供試品溶液展開后的色譜圖基本一致，這表明供試品溶液在2天內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.15多須公藥材樣品測定

在薄層色譜最佳條件下，取11批多須公藥材，對照2.2、2.3、2.4項(xiàng)依次測定，結(jié)果如圖11所示.由圖11可知，11批次多須公樣品溶液經(jīng)薄層層析鑒別，其色譜圖均清晰且分離度良好.這說明本研究建立的薄層色譜法，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可為多須公藥材的質(zhì)量鑒別提供技術(shù)參考.

3結(jié)論

為建立一種可用于鑒別多須公藥材的薄層色譜法，本研究主要考察了展開劑、供試品點(diǎn)樣量、提取溶劑（75%乙醇及甲醇）、提取方式（超聲及回流）、顯色劑、檢測波長、不同廠家硅膠G板、環(huán)境條件（濕度、溫度）因素對薄層色譜法鑒別多須公藥材真?zhèn)蔚挠绊?研究發(fā)現(xiàn)，展開劑、供試品點(diǎn)樣量、顯色劑及檢測波長的選擇不同，均會(huì)影響薄層色譜法對多須公藥材的鑒別效果，而提取溶劑、提取方式、不同廠家硅膠G板及環(huán)境條件（濕度、溫度）對薄層色譜法的鑒別影響不大.研究進(jìn)一步得出，多須公藥材薄層色譜鑒別最佳方法為供試品點(diǎn)樣量為5 μL，標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣量為2 μL，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1），顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液，顯色溫度為105℃，檢視波長為365 nm.此外，在薄層色譜法鑒別最佳方法下，進(jìn)一步考察了其穩(wěn)定性，并對采集于貴州省的11批次多須公藥材進(jìn)行了薄層色譜法鑒別，發(fā)現(xiàn)以硅膠G薄層板為載體，標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液點(diǎn)樣量分別為2 μL、5 μL，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開劑，3%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，105℃顯色，365 nm波長下檢視，供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液顯相同顏色的斑點(diǎn)且清晰，分離度好.由此表明，本研究建立的薄層色譜法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好，可為后期多須公藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ).

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[責(zé)任編輯：劉紅霞]

Study and Establishment of TLC Identification Method of Eupatorium chinense in Guizhou Province

YANG Congwu 1 ，HU Xiuhong 2 ，TAN Lin1*

（1.Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture Food and Drug Testing Center， Kaili， Guizhou， 556011， China; 2. Kaili University， Kaili， Guizhou， 556011， China）

Abstract：

In order to establish a thin-layer chromatography（TLC） identification method for Eupatorium chinense Linn. produced in Guizhou province， a methodological study was conducted using Quercetin as the standard substance， following the TLC method （General Rule 0502）. Factors such as developing agent， sample size， extraction method， extraction solvent， chromogenic agent， inspection wavelength， silica gel G plates from different manufacturers， and environmental conditions （humidity and temperature） were investigated. The results showed that the best method for TLC identification of E. chinense medicinal herb is： the sample size of the test sample is 5 μL. The standard sample size is 2 μL. The developing agent is toluene ethyl acetate formic acid （5∶2∶1）， the color developing agent is aluminum chloride ethanol solution of 3% ， the color developing temperature is 105℃， and the inspection wavelength is 365 nm. In addition， research has found that the extraction solvent， extraction method， silica gel G plates of different manufacturers， and environmental conditions （humidity and temperature） have little effect on the identification of TLC. Overall， this method is simple to operate， has strong specificity， good stability and reproducibility， and can be used for the qualitative identification of Guizhou produced Eupatorium chinense Linn by TLC.

Key words：

Eupatorium chinense Linn; thin layer chromatography; quercetin; qualitative identification