CHAC1在膀胱尿路上皮癌惡性進(jìn)展中的潛在作用

［摘要］目的探究CHAC1在膀胱尿路上皮癌（BLCA）中的生物學(xué)特征及其臨床相關(guān)性。方法從腫瘤基因組圖譜和人類蛋白質(zhì)圖譜等數(shù)據(jù)庫獲取CHAC1的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用R軟件、MEXPRESS平臺和TISIDB平臺，對CHAC1在BLCA中的潛在作用進(jìn)行基因表達(dá)分析、生存分析、基因拷貝數(shù)變異及甲基化分析、基因富集分析、免疫浸潤分析。結(jié)果與正常組織相比，CHAC1在多種腫瘤組織中異常表達(dá)（Plt;0.05），尤其在BLCA中呈現(xiàn)高表達(dá)（Plt;0.001）；CHAC1高表達(dá)預(yù)示著BLCA的不良預(yù)后，且與CHAC1低甲基化水平有關(guān)；CHAC1富集分析發(fā)現(xiàn)其參與了包括氨基酸代謝、GSH代謝等多種代謝相關(guān)的生物學(xué)過程；CHAC1在BLCA中的表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞的過度浸潤有關(guān)，包括樹突狀細(xì)胞，活化的樹突狀細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞，B細(xì)胞和NK CD56dim細(xì)胞。結(jié)論CHAC1可能成為評估BLCA預(yù)后和調(diào)節(jié)免疫浸潤水平的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

［關(guān)鍵詞］CHAC1；膀胱尿路上皮癌；免疫特征；生物標(biāo)志物

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.03.014

Potential Role of CHAC1 in Malignant Progression of Bladder Urothelial Carcinoma

Yu Xudong1，2，Zhang Yaosheng1，2**，Liu Ruijia1，Wang Xuyun3，Jia Liancheng3

1Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100700；2Beijing Minimally Invasive Medical Center of Traditional Chineseand Western Oncology，Beijing100700；3Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing100010

**Corresponding author：Zhang Yaosheng，email：zhangyaosheng@bucm.edu.cn

［Abstract］ObjectiveTo investigate the biological characteristics and clinical relevance of CHAC1 in bladder urothelial carcinoma（BLCA）.MethodsThe original data of CHAC1 was obtained from the Cancer Genome Atlas and the Human Protein Atlas.R software，MEXPRESS platform and TISIDB platform were used for gene expression analysis，survival analysis， copy number variation and methylation analysis，gene enrichment analysis and immune infiltration analysis of CHAC1.ResultsCompared with normal tissues，CHAC1 is abnormally expressed in a variety of tumor tissues（Plt;0.05），especially in BLCA（Plt;0.001）.High expression of CHAC1 predicts poor prognosis of BLCA，which is related to CHAC1 hypomethylation level.CHAC1 enrichment analysis showed that it was involved in a variety of metabolism-related biological processes，including amino acid metabolism and GSH metabolism.The expression level of CHAC1 in BLCA was associated with excessive infiltration of a variety of immune cells，including dendritic cells，activated dendritic cells，neutrophils，macrophages，regulatory T cells，Th1 cells，Th2 cells，B cells，and NK CD56dim cells.ConclusionCHAC1 may become a potential biomarker and therapeutic target for evaluating BLCA prognosis and modulating levels of immune infiltration.

［Key words］CHAC1；Bladder urothelial carcinoma；Immune features；Biomarker

膀胱尿路上皮癌（Bladder urothelial carcinoma，BLCA）是泌尿系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，因組織學(xué)來源于尿路上皮細(xì)胞而得名。BLCA早期無特異性的臨床癥狀，缺乏良好的早期發(fā)現(xiàn)、診斷的生物學(xué)指標(biāo)。部分切除或根治性切除術(shù)是BLCA的主要治療方法，然而，該病術(shù)后的高復(fù)發(fā)率一直是困擾臨床醫(yī)生的重要問題，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期［1］。目前的主要挑戰(zhàn)是找到與BLCA相匹配的特異性生物標(biāo)志物，為BLCA患者提供更早、更積極、更精準(zhǔn)的治療。CHAC1是一種編碼蛋白質(zhì)的基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種谷氨酰胺肽酶，可以將GSH分解成半胱氨酸和γ-谷氨酰胺。GSH是一種重要的抗氧化劑，可以幫助細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激，而CHAC1的活性則可以降低細(xì)胞內(nèi)GSH的水平，從而影響細(xì)胞的抗氧化能力［2-3］。這些與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，跟已有研究報(bào)道的CHAC1在腎透明細(xì)胞癌、肝癌及胃癌中的促癌機(jī)制基本一致［4-6］。

為探究CHAC1在BLCA中的臨床生物學(xué)功能和治療潛力，本研究使用R語言對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，首先明確了CHAC1在BLCA組織和癌旁組織中的基因表達(dá)差異，并分析了CHAC1的基因表達(dá)與BLCA臨床預(yù)后的相關(guān)性。此外，本研究進(jìn)行了免疫浸潤和功能富集分析，以進(jìn)一步了解CHAC1在BLCA發(fā)生發(fā)展中的潛在機(jī)制。

1對象與方法

1.1數(shù)據(jù)集來源

BLCA的原始測序數(shù)據(jù)和臨床病理的原始數(shù)據(jù)集來源于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov/tcga）；膀胱組織的CHAC1免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)來源于人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（http：//www.proteinatlas.org）。將這些數(shù)據(jù)集用于CHAC1的基因表達(dá)分析和臨床病理數(shù)據(jù)分析。

1.2CHAC1的基因表達(dá)分析

本研究使用GEPIA平臺評估了CHAC1在33種腫瘤類型的正常組織（或癌旁非腫瘤組織）與腫瘤組織中的差異表達(dá)，并分別進(jìn)行了配對比較和非配對比較［7］。根據(jù)不同的癌癥危險(xiǎn)因素分組，通過多重比較評估CHAC1 mRNA表達(dá)與BLCA危險(xiǎn)因素的相關(guān)性。

1.3CHAC1基因拷貝數(shù)變異及甲基化分析

本研究通過MEXPRESS平臺（https：//mexpress.be）下載了CHAC1基因拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV）和甲基化水平數(shù)據(jù)［8］；通過UALCAN平臺分析了CHAC1的甲基化水平，并使用MethSurv平臺對CHAC1的甲基化水平和BLCA的相關(guān)性進(jìn)行了分析［9-10］。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和基因富集分析

CHAC1基因編碼的蛋白數(shù)據(jù)來源于STRING平臺，使用Cytoscape軟件（3.7.1）構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；通過clusterProfiler R包（3.14.3）和Hs.eg.db R包（3.10.0）進(jìn)行基因注釋和基因富集分析［11］。

1.5免疫浸潤分析

本研究使用GSVA R軟件包（1.34.0）計(jì)算了BLCA免疫細(xì)胞浸潤與CHAC1表達(dá)水平的Spearman相關(guān)性［12］。使用TISIDB平臺評估了CHAC1表達(dá)與BLCA中免疫抑制劑或免疫刺激劑之間的相關(guān)性［13］。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R語言（3.6.3）和Graphpad Prism軟件（9.1.0）對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，配對樣本間差異的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本項(xiàng)研究使用pROC R包（1.17.0.1）和ggplot2 R包（3.3.3）繪制BLCA患者的受試者操作特征（ROC）曲線，評估CHAC1對BLCA的診斷價(jià)值；通過KM生存曲線分析CHAC1對BLCA患者生存和預(yù)后的預(yù)測價(jià)值［14］。使用rms R包（6.2.0）構(gòu)建預(yù)測預(yù)后的列線圖［15］。

2結(jié)果

2.1CHAC1在惡性腫瘤中的基因表達(dá)情況

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)，比較CHAC1在不同類型腫瘤樣本及其對應(yīng)的正常樣本中的表達(dá)。結(jié)果顯示，CHAC1在多種腫瘤類型中異常表達(dá)（Plt;0.05），見圖1A。隨后，本研究聚焦于CHAC1在BLCA中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，CHAC1 mRNA在BLCA中表達(dá)顯著升高（Plt;0.001），見圖1B。與配對的癌旁非腫瘤組織相比，CHAC1在BLCA組織中的表達(dá)也相對高表達(dá)（Plt;0.001），見圖1C。同時(shí)，基于HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHAC1基因編碼的蛋白在BLCA組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，見圖1D。此外，本研究分析了CHAC1表達(dá)與BLCA患者臨床特征之間的關(guān)系。CHAC1的高表達(dá)與BLCA患者的組織學(xué)分級和總生存期（Overall survival，OS）均顯著相關(guān)（Plt;0.05），見表1。

2.2CHAC1 mRNA的表達(dá)與BLCA患者的預(yù)后分析

ROC結(jié)果顯示，CHAC1對BLCA具有較高的臨床診斷價(jià)值（AUC∶0.889），見圖2A。生存分析顯示，CHAC1高表達(dá)與BLCA患者較差的OS相關(guān)（HR=1.39，P=0.026），見圖2B。本研究還構(gòu)建了整合CHAC1和其他預(yù)后因素的列線圖來預(yù)測BLCA臨床患者的生存風(fēng)險(xiǎn)，見圖2C。OS的C-index為0.651，表明CHAC1表達(dá)對預(yù)后預(yù)測的能力優(yōu)于傳統(tǒng)的個(gè)體預(yù)后因素。同時(shí)，列線圖的校準(zhǔn)曲線顯示了預(yù)測生存率與實(shí)際生存率具有良好的一致性，見圖2D。此外，本研究還探討了CHAC1 mRNA表達(dá)與不同臨床亞型BLCA預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果提示，高突變負(fù)荷亞組中CHAC1表達(dá)越高，BLCA患者的預(yù)后越差（HR=1.67，P=0.023），見圖2E。相反，在低突變負(fù)荷亞組中，CHAC1表達(dá)與預(yù)后之間無顯著關(guān)系（HR=1.35，P=0.152），見圖2F。綜上所述，結(jié)果提示CHAC1在BLCA中表達(dá)上調(diào)，具有較高的臨床診斷價(jià)值，并與不良預(yù)后相關(guān)。

2.3CHAC1 mRNA的表達(dá)與DNA甲基化分析

CHAC1基因擴(kuò)增或缺失的患者比例相似，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CHAC1表達(dá)與CNV的關(guān)系見圖3A；BLCA組織中CHAC1的DNA甲基化水平顯著低于正常組織（P＜0.0001），見圖3B；同時(shí)，根據(jù)不同的臨床甲基化病理參數(shù)，與正常組織相比，CHAC1甲基化水平在中晚期BLCA中顯著降低（P＜0.0001），見圖3C；CHAC1甲基化水平在BLCA的不同N分期中顯著降低，見圖3D；此外，本研究結(jié)果顯示CHAC1 mRNA表達(dá)與其甲基化狀態(tài)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.279，Plt;0.0001），見圖3E；此外，本研究構(gòu)建了BLCA中CHAC1甲基化水平的預(yù)后分析，結(jié)果提示CHAC1低甲基化水平與BLCA患者的不良預(yù)后相關(guān)（HR=0.671，P=0.011），見圖3F。

2.4CHAC1相關(guān)基因功能富集分析

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件探索了50個(gè)CHAC1的靶向結(jié)合蛋白，見圖4A，并進(jìn)行了GO和KEGG功能富集分析，見圖4B。結(jié)果表明與CHAC1可能參與了包括氨基酸代謝、GSH代謝等多種代謝相關(guān)的生物學(xué)過程，與CHAC1最相關(guān)的分子功能為外肽酶活性、抗氧化活性、轉(zhuǎn)移酶活性和碳氮裂合酶活性。本研究根據(jù)CHAC1的表達(dá)水平分析了DEGs：與CHAC1低表達(dá)組相比，本研究得到425個(gè)DEGs，其中224個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，201個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，見圖4C。根據(jù)排序，將前16個(gè)數(shù)據(jù)集可視化，見圖4D。熱圖顯示前25個(gè)基因與CHAC1表達(dá)呈正或負(fù)相關(guān)，見圖4E。

2.5CHAC1的表達(dá)與BLCA的免疫細(xì)胞浸潤分析

本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中CHAC1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在CHAC1高表達(dá)組中，T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）、活化的樹突狀細(xì)胞（Activated dendritic cells，aDC）、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞（T helper cells，Th）1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的

比例顯著高于CHAC1低表達(dá)組（P＜0.05），見圖5A；免疫細(xì)胞浸潤與CHAC1表達(dá)的相關(guān)性，見圖5B；CHAC1的表達(dá)與以下免疫細(xì)胞的浸潤程度呈顯著正相關(guān)：DC（r=0.123，P=0.012），aDC（r=0.218，Plt;0.001），中性粒細(xì)胞（r=0.172，Plt;0.001），巨噬細(xì)胞（r=0.184，Plt;0.001），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（r=0.162，Plt;0.001），Th1細(xì)胞（r=0.195，Plt;0.001），Th2細(xì)胞（r=0.186，Plt;0.001），B細(xì)胞（r=0.130，P=0.008），NK CD56dim細(xì)胞（r=0.139，P=0.005），見圖5C-K；CHAC1與中央記憶性T細(xì)胞的浸潤水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.159，P=0.001），見圖5L。

3討論

本研究對CHAC1在BLCA中的潛在作用進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。本研究發(fā)現(xiàn)與正常膀胱組織相比，CHAC1 mRNA和蛋白在BLCA組織中表達(dá)上調(diào)，CHAC1高表達(dá)的BLCA患者預(yù)后較差。CNV和甲基化水平是影響基因表達(dá)的重要因素，本研究的結(jié)果顯示CHAC1的高表達(dá)與基因低甲基化有關(guān)，但與CNV狀態(tài)無關(guān)。功能富集分析結(jié)果提示CHAC1可能通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝、鐵死亡、干擾素α反應(yīng)和炎癥反應(yīng)影響B(tài)LCA的發(fā)展。一些現(xiàn)有的報(bào)告也間接支持這一推斷，Scheffer等［16］的研究發(fā)現(xiàn)CHAC1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)基因，參與降解谷胱甘肽并促進(jìn)細(xì)胞凋亡或鐵毒性的γ-谷氨酰胺循環(huán)。此外，CHAC1還參與了腫瘤發(fā)生過程中的多種分子生物學(xué)過程，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、caspase-3活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［17］。Chen等［18］通過敲低CHAC1的表達(dá)，削弱了半胱氨酸缺乏引起的谷胱甘肽水平降低和細(xì)胞死亡。這進(jìn)一步表明CHAC1參與了代謝通路相關(guān)的作用，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。此外，本研究進(jìn)一步探究CHAC1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系。CHAC1的表達(dá)與多種免疫細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)。B細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中通過多種方式減弱免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［19］。Miyake等［20］證實(shí)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在人膀胱腫瘤微環(huán)境中通過其誘導(dǎo)的旁分泌作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并與BLCA的不良預(yù)后相關(guān)。綜上所述，認(rèn)為CHAC1可能參與了BLCA的免疫微環(huán)境的形成，進(jìn)而影響了BLCA的惡性進(jìn)程。

較高的敏感性使CHAC1具備成為BLCA診斷性生物學(xué)指標(biāo)的可能性；CHAC1的高表達(dá)預(yù)示BLCA患者的預(yù)后不良，在BLCA的臨床管理中追蹤C(jī)HAC1可以為患者的預(yù)后提供參考；此外，BLCA中上調(diào)的CHAC1能夠促進(jìn)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤。CHAC1是BLCA惡性進(jìn)展中的關(guān)鍵靶基因，有望成為BLCA的生物標(biāo)志物和新的免疫治療靶點(diǎn)。

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（2023-11-02收稿）