‘玉露香梨’生長素煙酰胺合成酶基因GH3 克隆及其生物信息特征研究

摘要：［目的］‘玉露香梨’果實萼片宿存嚴重降低其商品價值，篩選并鑒定其果實萼片發(fā)育關鍵基因，可為從分子水平培育萼片脫落的梨果實提供參考基因。［方法］以棚架栽培的‘玉露香梨’為試材，結(jié)合前期BSA 基因定位測序數(shù)據(jù)，對候選基因表達特征進行驗證、克隆并分析2 個生長素酰胺合成酶基因GH3 家族生物信息特征。［結(jié)果］基因PbGH3. 3（Pbr007550）和PbGH3. 4（Pbr030571）在萼片的表達量排名第二；PbGH3. 3 和PbGH3. 4 CDS 長度均為1806 bp，編碼601 個氨基酸，其中二者存在7 個氨基酸序列的差異，編碼的蛋白PbGH3. 3 和PbGH3. 4 序列與蘋果MdGH3. 1 的同源性最高；屬于不穩(wěn)定性蛋白，無信號肽的存在，定位于細胞質(zhì)；利用NCBI 網(wǎng)站CCD 工具分析發(fā)現(xiàn)均具有GH3 蛋白家族的GH3 superfamliy 保守結(jié)構域，蛋白質(zhì)三級建模后發(fā)現(xiàn)為GH3. 1 AUXIN 綴合酶，涉及生長素穩(wěn)態(tài)，屬于GH3 蛋白家族。STRING 互作網(wǎng)絡蛋白成員GO 和KEGG 功能富集分析表明PbGH3. 3 參與植物激素尤其是生長素信號通路，推測PbGH3. 3 和PbGH3. 4 可能在‘玉露香梨’果實萼片脫落中通過IAA 信號通路發(fā)揮生物學功能。

關鍵詞：梨； 萼片； 生長素煙酰胺合成酶； 基因克?。?IAA

中圖分類號：S722.3；S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：1671-8151（2024）03-0014-10

‘ 玉露香梨’傳統(tǒng)分類上屬白梨系統(tǒng)，是山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所培育而成的‘庫爾勒香梨’型中熟紅梨品種，分別繼承其母本新疆‘ 庫爾勒香梨’、父本‘ 雪花梨’汁多味甜、皮薄肉細及果個大等優(yōu)點［1-2］，同時部分克服了香梨果形不正等缺點，具有抗逆性強、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、地域適應性強等優(yōu)點［3-5］?！衤断憷妗?014 年被國家農(nóng)業(yè)部確定為梨果樹發(fā)展主導品種，并于2019 年入選中國農(nóng)業(yè)品牌目錄，隰縣玉露香梨又被農(nóng)業(yè)部選為2023 年農(nóng)業(yè)品牌精品培育名單。

根據(jù)梨果實成熟時萼片脫宿狀態(tài)，可將其分為宿萼果和脫萼果［6］?！衤断憷妗m優(yōu)點眾多，但果實萼片存在部分宿存現(xiàn)象。萼片位于花器官的最外層，主要包含上下表皮、維管束和葉肉細胞部分，進化上其為葉的變態(tài)器官。萼片發(fā)育初期可保護內(nèi)部結(jié)構，減少生殖器官受到外界諸如雨水沖刷及機械損傷的影響［7］。然而，‘玉露香梨’萼片宿存可致其果形不整齊、表面平整度下降、易生果銹等問題。

植物器官脫落與遺傳生理特性、栽培調(diào)控技術、環(huán)境因子等有關［8-11］。其中，植物激素生長素在器官脫落中發(fā)揮重要作用，如Meir 等［12］報道，當組織內(nèi)游離生長素（IAA）含量下降到一定閾值后，離區(qū)組織（Abscission zone， AZ）對乙烯（ETH）存在的敏感性增加，進而誘導器官開始脫落。在模式植物番茄脫落的研究中，用IAA 處理外植體后，生長素煙酰胺合成酶基因（Gretchen Hagen 3，GH3）表達上調(diào)，且能誘導外植體開始脫落。以上研究均表明基因GH3 是IAA 誘導花脫落延遲的有效負調(diào)控因子［13］。本課題組前期利用‘ 玉露香梨’的雙親‘庫爾勒香梨’與‘雪花梨’雜交獲得F1萼片脫宿性狀分離群體，將構建的萼片脫落與宿存的極端混池群體進行全基因組集群分離測序（Whole genome bulked segregation analysis，DNA-BSA），定位到與其果實萼片脫落宿存關聯(lián)的基因GH3［14］，在‘庫爾勒香梨’數(shù)字表達圖譜數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)GH3 在脫落萼片內(nèi)表達上調(diào)，進一步表明基因GH3 可能參與梨果實萼片脫落過程［15］。

基于此，本研究以棚架式栽培的‘玉露香梨’為研究材料，基于前期課題組萼片脫落宿存極端混池分析測序技術，成功定位到基因GH3，該基因參與梨果實萼片發(fā)育。為進一步研究此基因家族成員功能，對篩選的2 個GH3 家族成員的表達量進行驗證。同時，對候選的2 個家族成員基因進行克隆，并分析其生物信息學特征，為從分子水平研究‘玉露香梨’萼片脫落提供參考基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

材料來源于山西省晉中市太谷區(qū)的山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所（N37°21'17\"，E112°30'12\"）?！衤断憷妗脑耘嗄Ｊ綖殡p臂平行式。

主要試劑：克隆酶試劑盒Taq DNA、 DNA 分子Marker-DL2000、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit 購于TaKaRa（中國）公司，凝膠回收試劑盒Simgen、熒光定量PCR 實驗用品與卡那霉素分別選自新景生物試劑開發(fā)有限（杭州）公司，山西睿然科技有限公司和北京美億美生物技術有限公司。qRT-PCR 引物合成和DNA 序列測序均由生物工程技術有限公司（上海）完成。

載體與菌株：大腸桿菌菌株（E. coli）DH5α、載體pMD-19T 來自TaKaRa。

1. 2 試驗方法

試驗處理：選取樹勢相近，樹體健壯的‘ 玉露香梨’，于4 月上旬盛花初期，上午9 時，使用濃度為1000 mg·L-1 生長延緩劑PP333 和蒸餾水，一次性噴施至整朵花全濕、有藥液滴落為止，用于誘導‘玉露香梨’果實萼片脫落。實驗處理2 周后選取3個長勢一致的‘玉露香梨’的枝條，作為3 次生物學重復，脫萼與宿存果的果皮、果肉、萼筒離區(qū)組織以及脫落幼果前的花瓣、萼片、葉片、葉芽的單個組織分別收集，作為RNA 提取材料。

RNA 的提?。翰捎脤嶒炇腋牧汲墒斓腃TAB法分別提取梨不同組織部位樣品的總RNA。

cDNA 的合成：根據(jù)試劑盒說明操作手冊，使用TaKaRa 公司的PrimeScript? RT reagent Kit 合成cDNA，去除核基因組DNA 反應。

qRT-PCR 檢測方法：基于Primer Premier 5. 0軟件，參考中國白梨基因組（http：//gigadb. org/search/new？keyword=Pyrus+bretschneideri+），設計GH3 引物， 內(nèi)參基因為ACTIN（KT943411. 1），對‘ 玉露香梨’萼筒的定量用cDNA 校準，引物序列見表1。

基于ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix的三步法擴增，同時采用Light Cycler 96 進行實時熒光定量檢測，3 次重復，反應結(jié)束后分析溶解曲線并評估引物的特異性。反應體系為20. 0 μL：包含2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer（10uM）0. 6 μL，F(xiàn)orward Primer（10uM）0. 6 μL，cDNA 2. 0 μL，Nuclease-free Wa?ter 6. 8 μL。

生長素酰胺合成酶基因PbGH3 的克隆：引物見表2，按照試劑盒說明分別進行目的基因擴增、回收純化片段、載體構建、轉(zhuǎn)化并進行測序驗證。

基因PbGH3. 3 與PbGH3. 4 的生物信息學分析：首先，在線分析GH3 蛋白序列的理化性質(zhì)（http：//www. expasy. ch/tools/protparam. Htm）；其次，預測蛋白GH3 結(jié)構（http：//www. ebi. ac.uk/Tools/InterProScan/）；隨后，分析GH3 蛋白結(jié)構域（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi），結(jié)合DNAMAN 軟件，進行多序列比對（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast）；之后，利用SOPMA（http：//meta-database. org/wiki/SOPMA）和Interactive（http：//swissmodel.expasy. org/interactive）預測GH3 蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構；然后，分別利用TMHMM（http：//www.cbs. dtu. dk/services/TMHMM/） 、SignalP（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）和PSORT Predition （http：//psort1. hgc. jp/form.html）進行跨膜結(jié)構、信號肽及亞細胞定位預測與分析；最后，基于STRING 進行蛋白網(wǎng)絡互作分析（https：//version-12-0. string-db. org/）

2 結(jié)果與分析

2. 1 生長素煙酰胺合成酶基因GH3 在‘ 玉露香梨’中的表達特性分析

‘ 玉露香梨’基因PbGH3. 3 和PbGH3. 4 染色體定位發(fā)現(xiàn)均位于Chr5（圖1A）。基因表達分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉芽組織中的表達量顯著高于其他組織內(nèi)，在萼片中表達量次之，除‘玉露香梨’宿萼果果肉、宿萼果果皮和脫萼萼筒的基因表達量差異不顯著外，其余組織表達差異均顯著（圖1B）?；騊bGH3. 4 在‘ 玉露香梨’各個組織部位表達由高到低的順序依次為：脫萼果果肉gt; 萼片gt; 脫萼萼筒gt;宿萼果果皮gt;葉芽gt;花瓣gt;宿萼果果肉gt;脫萼果果皮gt; 宿萼萼筒gt; 葉片，其中在脫萼果果肉中表達最高。與此同時，與其它各組織比較，均存在顯著差異（圖1C）。此外，發(fā)現(xiàn)‘玉露香梨’基因PbGH3. 3 和PbGH3. 4 二者均在葉片組織中表達最低。對基因PbGH3. 3 在碭山酥梨組織表達分析發(fā)現(xiàn)，其在梨各個組織及果實發(fā)育不同時期中均有表達（圖1D）。

2. 2 ‘ 玉露香梨’PbGH3 家族成員cDNA 全長序列的克隆分析

提取梨果實萼片離區(qū)組織（圖2A）RNA，反轉(zhuǎn)錄后并基于T-A 克隆技術（圖2B），成功克隆出2個家族成員PbGH3. 3 和PbGH3. 4。以‘ 玉露香梨’萼片離區(qū)組織為材料提取并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)PCR 擴增（圖2C）檢測測序，獲得目的基因的全長CDS，長度均為1806 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。編碼蛋白分析發(fā)現(xiàn)存在7 個氨基酸序列差異，如在1081 bp 處存在G/A變異而導致編碼的氨基酸不同（圖2D 和2E）。

2. 3 ‘玉露香梨’蛋白PbGH3. 3 和PbGH3. 4 進化樹構建結(jié)果分析

PbGH3. 3 蛋白與蘋果（XP_008373075. 1）的同源性為97. 84%，與甜櫻桃（XP_021827312. 1）的同源性為92. 15%，與李（XP_008236406. 1）的同源性為91. 82%，與桃（XP_007199763. 1）的同源性為91. 82%，與杏（XP_034228093. 1）的同源性為91. 65%；PbGH3. 4 與蘋果、甜櫻桃、李、桃和月季的相似性分別為97. 17%、92. 49%、92. 49%、92. 49% 和87. 85%。利用MEGA 7. 0，PbGH3. 3和PbGH3. 4 蛋白與其他薔薇科等15 種物種的系統(tǒng)進化結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘玉露香梨’PbGH3 二者蛋白與蘋果MdGH3. 1 的同源性最高（圖3B）。

2. 4 ‘玉露香梨’PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白特性分析

PbGH3. 3 和PbGH3. 4 均編碼601 個氨基酸，蛋白分子式均為C5319H8834N1806O2178S520，相對分子質(zhì)量均是14. 96 kDa，等電點相同為4. 90，同時編碼氨基酸內(nèi)的負電荷殘基（Asp+Glu）和正電荷的殘基（Arg+Lys） 均為0。此外，PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白的半衰期均為10 h，表現(xiàn)為不穩(wěn)定，而蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)（II）、脂肪指數(shù)和親水性的平均值（GRAVY）分別為43. 33 與54. 41、86. 96 與24. 75、?0. 237 與0. 916，其中前者蛋白為親水性，后者則為疏水性。

PbGH3. 3 與PbGH3. 4 主要分別由37. 10%與38. 27% 的α-螺旋、6. 32% 與5. 16% 的β-折疊、42. 26% 與41. 93% 的無規(guī)則卷曲以及14. 31% 與4. 64% 的延伸鏈組成（圖4A 和4B）。蛋白質(zhì)結(jié)構功能域預測其保守結(jié)構域發(fā)現(xiàn)，二者蛋白結(jié)構域中均具有GH3 蛋白家族的GH3 super family保守結(jié)構域（圖4C 和4D）。

蛋白PbGH3. 3 無信號肽（圖4E），而蛋白PbGH3. 4 存在信號肽（Sec/SPI）的可能性為0. 000 6（圖4F）。PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白定位于細胞質(zhì)、細胞核、線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體的可能性分別為47. 8% 與45. 0% 、26. 1% 與0% 、13. 0% 與10. 0% 、8. 7%與30. 0% 、4. 3% 與0% 、0% 與10. 0% 。因此，預測二者定位于細胞質(zhì)的可能性最大。

選取結(jié)構相似性最高的VvGH3. 1 蛋白（吲哚-3- 乙酸煙酰胺基合酶）晶體結(jié)構（GMQE 為84. 56% ，QMEAN 為? 1. 17）建模（ 圖5A），PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白質(zhì)三級建模后發(fā)現(xiàn)，兩者蛋白均為GH3-1 AUXIN 綴合酶（圖5B 和圖5C），二者含有生長素穩(wěn)態(tài)、無多聚體的形成，均具有1xV1N 配體（圖5D）與1x［（（2S ，3R ，4R ，5R）-5-（6- 氨基嘌呤-9- 基）-3，4-（雙氧化蒽基）氧雜戊基-2- 基］2-（1H- 吲哚-3- 基）磷酸氫乙酯相同配體（ 圖5E），其中前者的V1N. 3 包括4? 內(nèi)的19 個殘基和16 種PLIP 交互（ 圖5F），后者則有18 種PLIP 交互（ 圖5G）。

2. 5 ‘ 玉露香梨’PbGH3. 3 蛋白網(wǎng)絡互作分析

PbGH3. 3 全基因組的蛋白互作網(wǎng)絡如圖6A 所示，節(jié)點數(shù)11，邊數(shù)24 ，平均節(jié)點度4. 36，平均局部聚類系數(shù)為0. 762 ，PPI 富集P 值為1. 37×10-4 。對互作基因GO 功能分析發(fā)現(xiàn)，富集生物學過程前三的通路為激素介導的信號通路（GO ：0009755 ， 4. 26e-5），細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導（GO ：0035556 ， 4. 6e-4）和細胞分裂素激活的信號通路（GO ：0009736 ， 4. 6e-4）（圖6B）；分子功能富集于酸性氨基酸連接酶活性（GO ：0016881 ， 4. 6e-4）。基因網(wǎng)絡互作成員KEGG功能分析富集于植物信號轉(zhuǎn)導通路（map04075 ， 5. 33e-14）（圖6C）。

3 討論

生長素煙酰胺合成酶基因GH3 在早期響應植物生長素信號通路發(fā)揮重要功能作用。曾文芳在對不同GH3 基因協(xié)同控制桃果實各個發(fā)育階段生長素動態(tài)平衡的研究中發(fā)現(xiàn)，PpGH3. 3 和PpGH3. 4 在果實成熟階段明顯表達上調(diào)，暗示它們可能參與了桃果實成熟衰老階段的發(fā)育［ 16］。根據(jù)周蘋的研究，GH3. 9 基因過表達植株中，雄蕊個數(shù)比雌蕊少且雄蕊明顯偏短，不利于擬南芥的自花授粉，進而影響花器官衰?。?17］。劉妮等研究指出低IAA 水平有利于‘ 碭山酥梨’果實萼片脫落［ 4］。本實驗‘ 玉露香梨’基因PbGH3. 3 在萼片中存在高表達，由于本實驗萼片取樣處于盛花末期，為梨果實萼片脫落臨界期。因此，該時期基因PbGH3. 3 的高表達，可能誘導其萼片衰老脫落。本實驗克隆的‘ 玉露香梨’基因PbGH3 尤其PbGH3. 3 可能通過負調(diào)控IAA 通路誘導梨果實萼片脫落。

‘ 玉露香梨’PbGH3. 3 和PbGH3. 4 長度均為1806 bp ，二者具有7 個氨基酸序列的差異，編碼601 個氨基酸，進行同源性氨基酸序列對比后發(fā)現(xiàn)，與蘋果、甜櫻桃、李、桃、杏的同源性均在90% 以上，表明PbGH3. 3 和PbGH3. 4在進化上比較保守；對編碼的蛋白結(jié)構域分析后發(fā)現(xiàn)PbGH3. 3 和PbGH3. 4 具有GH3 super?family 結(jié)構域，說明它們屬于生長素煙酰胺合成酶類。不同物種基因GH3 在序列長度、理化特性存在差異［ 18］，但均具有保守的GH3 結(jié)構域，與Ostrowski 等人報道的結(jié)果一致，說明GH3 蛋白家族在進化上存在保守結(jié)構域［ 19］。

‘ 玉露香梨’蛋白PbGH3. 3 和PbGH3. 4 無信號肽，說明2 個蛋白屬于非分泌蛋白；對蛋白的一級結(jié)構進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)本實驗克隆的基因編碼蛋白不具穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)三級建模后發(fā)現(xiàn)PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白為GH3-1 AUXIN 綴合酶，與VvGH3 的吲哚-3-乙酸酰胺基合酶的晶體結(jié)構相似性最高，涉及生長素穩(wěn)態(tài)，與前人研究結(jié)果一致，具有生長素結(jié)合特性［ 20］。

SignalP 預測‘ 玉露香梨’PbGH3. 3 和PbGH3. 4 蛋白信號肽功能時，當預測分值大于閾值0. 5 時，默認為該蛋白含有信號肽；反之，分值小于閾值時，則不具信號肽［ 21-22］?！?玉露香梨’的PbGH3. 4 的生長素煙酰胺蛋白合成酶的蛋白信號肽（Sec/SPI）的預測分值是0. 000 6 ，表明‘ 玉露香梨’的PbGH3. 4 序列含有信號肽的可能性極低，不具備蛋白信號指引的功能。說明本實驗克隆的‘ 玉露香梨’PbGH3. 3 和PbGH3. 4 基因?qū)儆诰幋a生長素煙酰胺合成酶，但無信號肽功能?！?玉露香梨’PbGH3. 3 蛋白網(wǎng)絡互作GO 和KEGG 功能富集分析表明其可能通過植物激素尤其是生長素信號通路參與梨果實組織的發(fā)育。

4 結(jié)論

基因PbGH3. 3 與PbGH3 在‘ 玉露香梨’果實萼片等組織中存在差異表達，成功克隆出2個IAA 信號通路關鍵生長素煙酰胺合成酶基因，明確了生長素酰胺合成酶基因GH3 的2 個關鍵基因生物信息特征，均含GH3 superfamily保守結(jié)構域，屬GH3 蛋白家族。本實驗可為從生長素信號通路研究‘ 玉露香梨’萼片的脫落分子機理提供參考基因。基因GH3 如何通過IAA 通路影響萼片發(fā)育的機制有待進行更深入的功能驗證。

致謝

感謝大連理工大學的Noman Ali 博士對本文英文摘要的修改潤色。

We thank Dr. Noman Ali， from School of Bioengineering， DalianUniversity of Technology， Dalian， 116024， Liaoning， People'sRepublic of China， for his revision in English abstract.

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（編輯：呂俊俐）

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（32102364）