基于酶底物法檢測(cè)飲用水中大腸埃希氏菌的研究

作者簡(jiǎn)介：張瑩（1990—），女，北京人，本科，主管檢驗(yàn)師。研究方向：微生物檢驗(yàn)。

摘 要：為探究酶底物法檢測(cè)飲用水中大腸埃希氏菌的準(zhǔn)確性和便捷性，從不同地點(diǎn)采集水樣，采用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和酶底物法同時(shí)檢測(cè)飲用水中的大腸埃希氏菌。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法檢測(cè)出16份陽(yáng)性樣品和

3份陰性樣品，酶底物法檢測(cè)出17份陽(yáng)性樣品和2份陰性樣品，兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；14份樣品最大可能數(shù)一致，5份樣品最大可能數(shù)有差異，酶底物法檢測(cè)的靈敏度高于標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法。本研究為飲用水中微生物的快速、高效檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸埃希氏菌；飲用水；酶底物法

Study on Detection of Escherichia coli in Drinking Water Based on Enzyme Substrate Method

ZHANG Ying， ZHAO Hui， SU Dongxia， CUI Yujuan， ZHAO Lu

（Beijing Yanqing District Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102100， China）

Abstract： In order to understand whether the enzyme substrate method can quickly and accurately detect Escherichia coli in drinking water， water samples were collected from different locations， and standard detection method and enzyme substrate method were used" to detect Escherichia coli in drinking water at the same time. The results showed that 16 positive samples and 3 negative samples were detected by standard detection method， and 17 positive samples and 2 negative samples were detected by enzyme substrate method， there was no significant difference in the positive rate between the two methods （Pgt;0.05）. The maximum probable number of 14 samples were consistent， and the maximum probable number of 5 samples were different. The sensitivity of enzyme substrate method was higher than that of standard method. The research provides data basis for rapid and efficient detection of microorganisms in drinking water.

Keywords： Escherichia coli; drinking water; enzyme substrate method

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是一種廣泛存在于自然界的腸道細(xì)菌，可分為致病性與非致病性兩大類(lèi)，通常多數(shù)大腸埃希氏菌對(duì)人體無(wú)害。然而，當(dāng)水源受到污染時(shí)，大腸埃希氏菌的數(shù)量會(huì)顯著增加，從而對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。由此可以看出，檢測(cè)大腸埃希氏菌可對(duì)飲用水的衛(wèi)生情況做出評(píng)價(jià)[1-3]，準(zhǔn)確檢測(cè)飲用水中大腸埃希氏菌的含量是確保水質(zhì)安全的關(guān)鍵。在大腸埃希氏菌檢測(cè)方面，常見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法以特定培養(yǎng)聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測(cè)為主，但該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要3～5 d才能完成檢測(cè)，而且操作過(guò)程復(fù)雜，不能滿足快速檢測(cè)的要求[4-5]。酶底物法是使用最小酶底物MMO-MUG（Minimal Media ONPG-MUG）作為底物，在一定溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間，大腸埃希氏菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶，將培養(yǎng)基中的無(wú)色鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷分解為黃色的鄰硝基苯酚，同時(shí)大腸埃希氏菌又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。酶底物法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果呈現(xiàn)快速，特異性高[6-7]。

本研究從不同地點(diǎn)采集水樣，利用酶底物法和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)大腸埃希氏菌，確定酶底物法的準(zhǔn)確性和便捷性，為今后食品中微生物的快速、高效檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在北京市某地某餐飲店、某飲品店、某小區(qū)居民水龍頭、二次供水水箱4個(gè)地點(diǎn)共采集40個(gè)樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)采集10件樣品。選擇一次性無(wú)菌采樣瓶進(jìn)行采樣，為消除活性氯和重金屬離子的影響，在采樣時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液消除活性氯影響，加入乙二胺四乙酸二鈉溶液去除金屬離子影響。

1.2 儀器與試劑

DH3600A恒溫培養(yǎng)箱，河南沃林儀器設(shè)備有限公司；HulaMixer渦旋振蕩儀，美國(guó)賽默飛公司；S2833-6K紫外線燈，鹽城市諾信電子設(shè)備有限公司；HR30生物安全柜，深圳科力易翔儀器設(shè)備有限公司。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、

假單胞菌（Pseudomonas）ATCC51821、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048作為質(zhì)控樣品，中國(guó)微生物菌種保存中心；MMO-MUG培養(yǎng)基、大腸桿菌肉湯、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，美國(guó)賽默飛公司；伊紅美藍(lán)瓊脂，南通恒凱生物科技發(fā)展公司；硫代硫酸鈉溶液、乙二胺四乙酸二鈉，天津科密歐試劑有限公司。在試驗(yàn)中所使用的各類(lèi)試劑均按照參考《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB 5750.12—2006）進(jìn)行配制[8]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法

將待測(cè)樣品接種于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，每管接種1 mL，在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，從產(chǎn)氣的管中挑取一環(huán)接種于大腸桿菌肉湯，在44 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再?gòu)漠a(chǎn)氣的管中劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板上的菌落，挑取黑色的典型菌落進(jìn)行純化。之后對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并進(jìn)行生化鑒定，對(duì)照最大可能數(shù)（Maximum Probable Number，MPN）表查詢MPN值[9-10]。

1.3.2 酶底物法

取1 mL待測(cè)樣品接種于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取3 g MMO-MUG培養(yǎng)基溶于100 mL無(wú)菌水中，每個(gè)無(wú)菌試管中分裝5 mL溶解完全的MMO-MUG培養(yǎng)基。用接種環(huán)從產(chǎn)氣樣品中挑取一環(huán)接種于分裝好的MMO-MUG培養(yǎng)液中，在36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將產(chǎn)生黃色反應(yīng)的試管置于紫外線燈下進(jìn)行觀察，如果出現(xiàn)藍(lán)色熒光，則表明該管大腸埃希氏菌呈陽(yáng)性，并對(duì)照MPN表查出MPN值[9，11]。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

空白對(duì)照：每次試驗(yàn)用無(wú)菌水按照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和酶底物法步驟進(jìn)行空白測(cè)定，培養(yǎng)后無(wú)顏色反應(yīng)為正常。

產(chǎn)氣對(duì)照：將產(chǎn)氣腸桿菌制成300～3 000個(gè)/mL懸液，按照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和酶底物法步驟進(jìn)行操作，培養(yǎng)基呈黃色，但在紫外燈照射下沒(méi)有熒光為正常。

陰性和陽(yáng)性對(duì)照：將陰性菌（金黃色葡萄球菌、假單胞菌）和陽(yáng)性菌（大腸埃希氏菌）制成300～

3 000個(gè)/mL懸液，按照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和酶底物法步驟進(jìn)行操作，陽(yáng)性菌株呈現(xiàn)黃色熒光反應(yīng)、陰性菌株呈現(xiàn)無(wú)色狀態(tài)為正常。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控樣品檢測(cè)分析

金黃色葡萄球菌和假單胞菌作為陰性菌培養(yǎng)后無(wú)顏色產(chǎn)生；產(chǎn)氣腸桿菌培養(yǎng)后顯黃色，沒(méi)有藍(lán)色熒光；大腸埃希氏菌作為陽(yáng)性菌培養(yǎng)后顯黃色，有藍(lán)色熒光。質(zhì)控樣品檢測(cè)正確，可用于酶底物法檢測(cè)。

2.2 不同水樣檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)的40份樣品中有21份不產(chǎn)氣，參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》（GB 4789.38—2012）[12]，鑒定為大腸埃希氏菌陰性。其他19份產(chǎn)氣樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，其中有5份檢測(cè)結(jié)果存在差異，酶底物法檢測(cè)結(jié)果均高于標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法，其余14份檢測(cè)結(jié)果一致。

標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法檢測(cè)出16份陽(yáng)性樣品、3份陰性樣品，酶底物法檢測(cè)出17份陽(yáng)性樣品、2份陰性樣品，如表1所示。利用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示兩種方法之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

由表2可知，在5份有差異的組別數(shù)據(jù)中，酶底物法檢測(cè)的MPN值均大于標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法，表明酶底物法檢測(cè)靈敏度和特異性更高。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在飲用水大腸埃希氏菌檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法與酶底物法的陽(yáng)性檢測(cè)率不存在顯著性差異，兩種方法對(duì)飲用水的檢測(cè)結(jié)果在準(zhǔn)確度上達(dá)成一致。

3 結(jié)論

對(duì)比分析標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法和酶底物法對(duì)飲用水中大腸埃希氏菌檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法在結(jié)果一致性、準(zhǔn)確性方面無(wú)顯著性差異，酶底物法能夠作為評(píng)價(jià)飲用水中微生物污染情況的檢測(cè)方法，而且該方法檢測(cè)速度快、底物特異性強(qiáng)、評(píng)價(jià)效果準(zhǔn)確。

總之，酶底物法在檢測(cè)速度和底物特異性方面的優(yōu)勢(shì)使其成為評(píng)價(jià)飲用水中微生物污染情況的理想檢測(cè)方法。同時(shí)，該方法不僅能夠在飲用水檢測(cè)中應(yīng)用，在其他食品檢測(cè)領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。

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