野西瓜提取物對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

宋曙輝 ，時(shí) 月 ，2，3，王宇濱 ，李 武 ，4，馬 越 ，3，趙曉燕 ，4， 張 超 ，2，3

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097；2.果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；

3.農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；4.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

野西瓜（Citrullus colocynthis L.），為葫蘆科西瓜屬植物，原產(chǎn)于北非、中亞和西亞，在我國(guó)西北有少量分布[1]。野西瓜是維吾爾醫(yī)傳統(tǒng)藥材，是伊斯蘭各國(guó)臨床藥材。維吾爾醫(yī)理論認(rèn)為野西瓜具有祛風(fēng)、消腫、祛痰質(zhì)、生津液等功效[2]，主要用于治療肝病、血液病和糖尿病[3-4]?，F(xiàn)代科學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)研究證明野西瓜藤提取物對(duì)糖尿病小鼠具有降血糖作用[5]；野西瓜果實(shí)提取物具有降低糖尿病小鼠、大鼠和兔子血糖水平的作用[6-8]，但是采用現(xiàn)代科學(xué)試驗(yàn)研究野西瓜果實(shí)對(duì)肝損傷保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。

試驗(yàn)以乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝損傷小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)灌胃給予野西瓜提取物28 d，考查小鼠肝臟組織中關(guān)鍵代謝指標(biāo)和病理組織形態(tài)，評(píng)價(jià)野西瓜提取物對(duì)小鼠由酒精性肝損傷的保護(hù)作用，并通過(guò)化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)功能性組分進(jìn)行探索，以期為野西瓜資源的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與化學(xué)試劑

野西瓜，采自北京蔬菜研究中心四季青農(nóng)場(chǎng)；SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體重18.3～22.4 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)SCXK（軍） 2012-004；葫蘆素A（純度98%）、葫蘆素B（純度99%） 和葫蘆素E（純度95%），由上海同田生物技術(shù)股份有限公司提供；乙腈為色譜純，由迪馬科技有限公司提供；化學(xué)試劑均為分析純，中國(guó)化學(xué)試劑有限公司提供；還原性谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

1.3 野西瓜提取物的制備

將成熟野西瓜采收，置于10℃的冷庫(kù)中預(yù)冷24 h，使用自來(lái)水清洗果實(shí)表面，使用食品料理機(jī)將果實(shí)機(jī)械破碎2 min，采用雙層紗布過(guò)濾去除瓜籽等雜質(zhì)獲得野西瓜汁，加入野西瓜汁4倍體積的丙酮溶液，機(jī)械攪拌90 min，采用分液漏斗收集丙酮提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的10%，冷凍干燥獲得野西瓜提取物。

1.4 葫蘆素A含量的測(cè)定方法

建立HPLC的方法測(cè)定葫蘆素A含量的方法。準(zhǔn)確稱量葫蘆素A標(biāo)準(zhǔn)品5～10 mg置于10 mL容量瓶中，用色譜級(jí)乙醇定容至10 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)品母液，再將此標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋成5個(gè)不同質(zhì)量濃度，采用Agilent HPLC 1260系列色譜儀進(jìn)行分離，色譜柱選擇Agilent XBridge-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用DAD檢測(cè)器，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)228 nm光譜信息，控制柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL，色譜柱流速1 mL/min，流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為乙腈，采用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B各50%，洗脫25 min。以葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葫蘆素A標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖及其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1顯示葫蘆素A標(biāo)準(zhǔn)品在波長(zhǎng)228 nm處的色譜圖，葫蘆素A的保留時(shí)間為2.316 min，其回歸方程為Y=51 856X+230.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5。

采用外標(biāo)法測(cè)定樣品中葫蘆素A含量，將野西瓜提取液使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，使用與標(biāo)準(zhǔn)品相同的液相條件進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中葫蘆素A的含量。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理

圖1 葫蘆素A標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖及其標(biāo)準(zhǔn)曲線

將小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，共5組，每組12只小鼠。低劑量組、中劑量組和高劑量組每天給藥劑量為0.7，2.0，3.5 mg/kg體重的野西瓜提取物，野西瓜提取物使用純水溶解，灌胃劑量為5 μL/g體重。對(duì)照組和模型組給予同等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)4周。在試驗(yàn)第29天將模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組按12 mL/kg經(jīng)口腔灌胃體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，對(duì)照組以等量蒸餾水灌胃。隔夜禁食16 h后處死，取肝臟，測(cè)定肝臟組織中還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA） 和甘油三酯（TG） 含量，并取肝臟做病理切片，采用HE染色，觀察肝臟的病理?yè)p傷情況[9]。

1.6 GSH、MDA和TG的測(cè)定方法

將肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，檢測(cè)肝組織中GSH、MDA和TG的含量。肝組織中MDA采用硫代巴比妥酸法測(cè)定、GSH采用南京建成生物工程研究所的試劑盒方法測(cè)定；TG含量采用505nm比色法測(cè)定。

1.7 肝臟病理組織學(xué)觀察及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

（1）肝臟病理切片的制備。將小鼠肝臟用冷生理鹽水洗去浮血，拭干。于肝左葉取材4塊，每塊大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm，立即用10%中性甲醛固定；經(jīng)70%，90%，95%，100%乙醇脫水；無(wú)水乙醇與二甲苯混合液（V∶V=1∶1） 中30 min，再移入二甲苯中15～20 min；移入二甲苯與石蠟混合液（V∶V=1∶1），在60℃恒溫箱中放置30 min，再移入融化的石蠟中浸蠟；將浸蠟的組織塊置于包埋框內(nèi)的石蠟中包埋；用切片機(jī)制成厚度在4 μm的切片；HE染色法染色；用顯微鏡觀察并拍照[9-10]。

本組研究對(duì)象為2016年7月~2017年6月期間在血站無(wú)償獻(xiàn)血的2063名獻(xiàn)血者,根據(jù)《獻(xiàn)血者健康檢查要求》,以上獻(xiàn)血者的身體條件與之符合,精神疾病、傳染性疾病以及血液病患者均不在研究之列。將2017年上半年無(wú)償獻(xiàn)血的1063名無(wú)償獻(xiàn)血者作為觀察組。觀察組獻(xiàn)血者男女比例為545/518,最高齡55歲,最低齡20歲,平均年齡(32.4±4.1)歲。將2016年下半年無(wú)償獻(xiàn)血的1000名獻(xiàn)血者作為對(duì)照組。對(duì)照組獻(xiàn)血者男女比例為511/489,年齡22~54歲,平均年齡(31.5±4.7)歲。兩組無(wú)償獻(xiàn)血者的基本資料對(duì)照相仿(P>0.05),本研究具有可行性。

（2）分級(jí)方法。肝組織病變程度參照1981年國(guó)際病理學(xué)組確定的ALD組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：①肝細(xì)胞脂肪變：0分（＜5%），1分（5%～33%），2分（34%～66%），2分（34%～66%），3分（＞66%）；②小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）：0分（無(wú)），1分（＜2個(gè)），2分（2～4個(gè)），3分（＞4個(gè)）；③肝細(xì)胞氣球樣變：0分（無(wú)），1分（少見(jiàn)），2分（多見(jiàn)）；④肝纖維化分期（0～4）：0，無(wú)纖維化；1，肝腺泡3區(qū)輕度竇周纖維化；2，肝腺泡3區(qū)竇周纖維化合并門(mén)脈周?chē)w維化；3，橋接纖維化；4，高度可疑或確診肝硬化，包括NASH合并肝硬化、脂肪性肝硬化和隱源性肝硬化[11-10]。

1.8 結(jié)果判定

在小鼠急性肝損傷模型成立的前提下，GSH、MDA和TG指標(biāo)中任何二項(xiàng)和肝組織病理結(jié)果為陽(yáng)性，可判定受試樣品對(duì)酒精性肝損傷有輔助保護(hù)功能[12-14]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用t檢驗(yàn)比較組間差異的顯著性（p＜0.05或0.01）。

2 結(jié)果與討論

2.1 野西瓜提取物對(duì)小鼠體重的影響

野西瓜提取物對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)表1。

表1 野西瓜提取物對(duì)小鼠體重的影響

各處理組1 d的體重沒(méi)有顯著性差別，在14，28 d的體重與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。因此，在28 d的給藥過(guò)程中，野西瓜提取物對(duì)小鼠體重?zé)o顯著性影響。

2.2 野西瓜提取物對(duì)肝組織中MDA，GSH和TG含量的影響

肝損傷是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，乙醇是試驗(yàn)性肝損傷模型的常用藥物，對(duì)肝臟具有較強(qiáng)的損傷作用，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的變性、壞死、脂肪變性、纖維化和癌變。研究顯示，在乙醇進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)肝激酶P450激活產(chǎn)生過(guò)氧自由基和氧自由基，這些自由基會(huì)使生物膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，與膜上脂質(zhì)及蛋白質(zhì)分子進(jìn)行不可逆結(jié)合，造成脂肪酸異常代謝，進(jìn)而引起肝組織中MDA和GSH降低，引起肝彌漫性壞死和炎癥癥狀[11，14-16]。表2顯示野西瓜提取物對(duì)小鼠肝臟組織中MDA和GSH含量的影響。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量增多表明脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，而GSH是一種抗氧化劑，能有效地還原氫過(guò)氧化物自由基生成相應(yīng)醇，達(dá)到阻斷或減輕過(guò)氧自由基和氧自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化鏈鎖反應(yīng)的目的[11，13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的MDA顯著高于對(duì)照組，GSH顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，因而乙醇引起的小鼠急性肝損傷建模成功。在建模成功的前提下，中劑量組和高劑量組的GSH均顯著高于模型組，MDA顯著低于模型組（p＜0.05）。因此，中劑量和高劑量的野西瓜提取物具有降低MDA含量、升高GSH含量的作用。

TG表征肝臟組織中甘油三酯積聚情況，在脂肪酸代謝被阻斷或減緩時(shí)，會(huì)出現(xiàn)含量升高的情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在小鼠急性肝損傷建模成功的前提下，低劑量、中劑量和高劑量組的TG含量均顯著低于模型組的含量（p＜0.01）。因此，低劑量、中劑量和高劑量組的給藥均促進(jìn)小鼠的脂肪代謝。

野西瓜提取物對(duì)小鼠肝臟組織中MDA，GSH，TG含量的影響見(jiàn)表2。

表2 野西瓜提取物對(duì)小鼠肝臟組織中MDA，GSH，TG含量的影響

2.3 野西瓜提取物對(duì)小鼠肝組織病理的影響

野西瓜提取物對(duì)小鼠肝組織病理的影響見(jiàn)圖2。

圖2 野西瓜提取物對(duì)小鼠肝組織病理的影響

結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，細(xì)胞壁均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈和肝血竇無(wú)充血水腫，未見(jiàn)干細(xì)胞變性和壞死；而模型組細(xì)胞排列松弛，出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變形態(tài)，有多處壞死灶，其中以肝小葉中央?yún)^(qū)域最為嚴(yán)重，出現(xiàn)部分脂肪變性；與模型組相比，隨著給藥劑量增加，肝細(xì)胞脂肪變性和水樣變性明顯減少，壞死病灶明顯減少，其中以高劑量作用最為顯著，高劑量組的肝細(xì)胞組織均勻，細(xì)胞核清晰，較接近于對(duì)照組。

進(jìn)一步對(duì)小鼠肝臟組織切片進(jìn)行分析，按照肝細(xì)胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和肝纖維化4個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行分析總結(jié)，計(jì)算處理組的平均積分。模型組肝臟組織積分顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01），證明小鼠急性肝損傷模型成立。中劑量和高劑量組肝臟組織積分明顯低于模型組。

野西瓜提取物對(duì)小鼠肝組織病理的影響見(jiàn)表3。

2.4 野西瓜提取物功能性組分檢測(cè)

表3 野西瓜提取物對(duì)小鼠肝組織病理的影響

采用HPLC的方法檢測(cè)野西瓜提取物中葫蘆素組分，將樣品的HPLC圖譜分別與葫蘆素A、葫蘆素B和葫蘆素E的標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野西瓜提取物含有葫蘆素A，未檢出葫蘆素B和葫蘆素E，葫蘆素A的含量為25.6 nM/kg果實(shí)，野西瓜提取物中葫蘆素A的純度為10%。

野西瓜提取物液相色譜見(jiàn)圖3。

圖3 野西瓜提取物液相色譜

現(xiàn)代藥理研究表明葫蘆素具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒、保肝、提高機(jī)體免疫力等藥理活性[17]。前期研究顯示甜瓜蒂中葫蘆素B和葫蘆素E對(duì)CCl4或酒精引起的肝損傷均顯示保護(hù)作用，研究使用的劑量介于0.2～6.0 mg/kg，并推測(cè)葫蘆素B是通過(guò)恢復(fù)載脂蛋白功能將甘油三酯以β-脂蛋白形式排出體外，從而對(duì)肝損傷起到保護(hù)作用[11，15，16，18]。從分子結(jié)構(gòu)上方面分析，葫蘆素A，B和E均屬于四環(huán)三萜類(lèi)同系物，其區(qū)別在于葫蘆素A比葫蘆素B在C9位上的甲基上多1個(gè)羥基，比葫蘆素E在C1和C2之間少1個(gè)雙鍵（圖4）。推測(cè)葫蘆素A在功能上與葫蘆素B和葫蘆素E具有相似之處。因此，葫蘆素A可能是野西瓜提取物對(duì)肝損傷的保護(hù)作用功效成分之一。

葫蘆素A，B和E的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 葫蘆素A，B和E的分子結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

以野西瓜提取物對(duì)小鼠灌胃28 d，采用誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)按照2.0，3.5 mg/kg的野西瓜提取物給藥28 d，即中劑量組和高劑量組，對(duì)小鼠的體重沒(méi)有顯著性影響，顯著降低小鼠肝組織MDA和TG含量、升高GSH含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01），同時(shí)，肝組織病理分析顯示中劑量組和高劑量組肝臟組織積分明顯低于模型組。野西瓜提取物（2.0～3.5 mg/kg） 對(duì)由乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示，葫蘆素A可能是野西瓜提取物中的主要功能性成分。