血清miRNA液體活檢在早期卵巢癌診斷中的臨床價值

張偉鋒 舒艷 萬擇秋

[摘要]?目的?探討血清微RNA（microRNA，miRNA）液體活檢在早期卵巢癌診斷中的臨床價值。方法?選取2021—2023年湖州市婦幼保健院的22個新鮮冷凍Ⅰ期卵巢癌組織和9個相鄰正常卵巢組織用于本研究。使用R軟件中的limma軟件包分析腫瘤和鄰近正常組織之間miRNA的差異表達(dá)。利用公開的回顧性血清miRNA測序數(shù)據(jù)集GSE106817使用Ⅰ期卵巢癌中高表達(dá)的miRNA訓(xùn)練Logistic回歸模型，使用GSE113486和GSE31568驗證模型的準(zhǔn)確性。結(jié)果?Ⅰ期卵巢癌組織中共篩選出8種高表達(dá)miRNA，即miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C。在訓(xùn)練隊列GSE106817中用于診斷卵巢癌的曲線下面積（area?under?the?curve，AUC）為0.89。在驗證隊列GSE31568和GSE113486中診斷卵巢癌的AUC分別為0.85和0.86。結(jié)論?血清miRNA液體活檢對早期卵巢癌的診斷有較高的臨床價值。

[關(guān)鍵詞]?微RNA；液體活檢；早期卵巢癌

[中圖分類號]?R711.75；R446.11??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.16.011

Clinical?value?of?serum?miRNA?liquid?biopsy?in?the?diagnosis?of?early?ovarian?cancer

ZHANG?Weifeng，?SHU?Yan，?WAN?Zeqiu

Department?of?Gynecology?and?Obstetrics，?Huzhou?Maternal?and?Child?Health?Care?Hospital，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?clinical?value?of?serum?microRNA?（miRNA）?liquid?biopsy?in?the?diagnosis?of?early?ovarian?cancer.?Methods?Twenty-two?fresh?and?frozen?stage?I?ovarian?cancer?tissues?and?nine?adjacent?normal?ovarian?tissues?from?Huzhou?Maternal?and?Child?Health?Care?Hospital?from?2021?to?2023?were?selected?for?this?study.?Differential?expression?of?miRNA?between?tumors?and?adjacent?normal?tissues?was?analyzed?using?limma?software?package?in?R?software.?The?published?retrospective?serum?miRNA?sequencing?dataset?GSE106817?was?used?to?train?the?Logistic?regression?model?with?highly?expressed?miRNA?in?stage?Ⅰ?ovarian?cancer，?and?GSE113486?and?GSE31568?were?used?to?verify?the?accuracy?of?the?model.?Results?A?total?of?8?highly?expressed?miRNA?were?selected?from?stage?Ⅰ?ovarian?cancer，?namely?miR-182，?miR-183，?miR-202，?miR-205，?miR-508，?miR-509-3，?miR-513B?and?miR-513C.?The?area?under?the?curve?（AUC）?for?diagnosing?ovarian?cancer?in?the?training?cohort?GSE106817?was?0.89.?The?AUC?for?diagnosis?of?ovarian?cancer?in?validation?cohorts?GSE31568?and?GSE113486?was?0.85?and?0.86，?respectively.?Conclusion?Serum?miRNA?liquid?biopsy?has?high?clinical?value?in?the?diagnosis?of?early?ovarian?cancer.

[Key?words]?MicroRNA;?Liquid?biopsy;?Early?ovarian?cancer

卵巢癌是女性常見的生殖系統(tǒng)腫瘤之一，也是女性第五大死亡原因。據(jù)報道，全球每年約32萬新發(fā)卵巢癌病例，近20萬人死亡[1]。由于卵巢癌早期沒有明顯癥狀，70%以上的女性診斷時已為晚期（Ⅲ或Ⅳ期），5年總生存率低于40%，而Ⅰ期卵巢癌患者的5年生存率可達(dá)90%[2]。因此，早期診斷對提高卵巢癌患者的總生存率具有重要意義。盡管盆腔檢查和經(jīng)陰道超聲檢查是診斷卵巢腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法，但它們并不是很敏感。目前，血清糖類抗原125水平檢測是研究最多的卵巢癌篩查方法，但其對早期卵巢癌患者的特異性和敏感度并不高。此外，由于卵巢是腹膜內(nèi)器官，只有活檢才能確認(rèn)卵巢癌的診斷。然而，早期卵巢腫瘤應(yīng)避免穿刺活檢，以防因穿刺造成腫瘤細(xì)胞向腹腔擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要一種非侵入性、穩(wěn)健和可靠的卵巢癌早期篩查、診斷方法。

近年來，在腫瘤篩查中，液體活檢正逐漸取代侵入性組織活檢。與傳統(tǒng)的腫瘤組織活檢相比，液體活檢具有無創(chuàng)、多次采樣和同時檢測多種腫瘤等優(yōu)點[3]。液體活檢主要檢測細(xì)胞外RNA[4-6]。微RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼RNA，長度18～24個核苷酸，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。細(xì)胞分泌的miRNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞外小泡中，或與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)合，因此不易在組織、血液、糞便和其他體液中降解，是腫瘤篩查的理想生物標(biāo)志物。盡管多項研究已證明miRNA在血清中作為卵巢癌生物標(biāo)志物的適用性，但大多數(shù)篩查的卵巢癌均處于晚期，而非早期卵巢癌[7-9]。此外，大多數(shù)研究中的miRNA篩選并不是基于無偏見的全基因組miRNA測序數(shù)據(jù)。因此，本研究旨在建立并驗證1種基于血清miRNA液體活檢預(yù)測早期卵巢癌的模型，從而探討血清miRNA液體活檢在早期卵巢癌無創(chuàng)篩查和診斷中的臨床價值。

1??資料與方法

1.1??一般資料

選取2021—2023年湖州市婦幼保健院的22個新鮮冷凍Ⅰ期卵巢癌組織和9個相鄰的正常卵巢組織用于探討血清miRNA液體活檢對早期卵巢癌患者的診斷價值，排除標(biāo)準(zhǔn)：①非早期卵巢癌；②轉(zhuǎn)移性卵巢癌；③卵巢交界性腫瘤；④接受過抗腫瘤治療的患者。本研究經(jīng)湖州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（倫理審批號：2021-R-002），所有患者和家屬均知情同意。

1.2??不同miRNA的篩選

對組織樣本進(jìn)行全基因組miRNA水平測序。使用R軟件中的limma軟件包分析腫瘤和鄰近正常組織之間miRNA的差異表達(dá)。篩選差異表達(dá)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)是log2倍變化大于2，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false?discovery?rate，F(xiàn)DR）校正的P<0.05。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出8種在Ⅰ期卵巢癌組織中特異性高表達(dá)的miRNA。

1.3??基于血清miRNA的診斷模型的構(gòu)建

由于miRNA在組織和血清中的動態(tài)表達(dá)水平不同，從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene?Expression?Omnibus，GEO數(shù)據(jù)庫）下載一組公開可用的回顧性血清miRNA測序數(shù)據(jù)集GSE106817，其中包括卵巢癌（n=320）和正常對照（n=320）。使用篩選出的8種Ⅰ期卵巢癌高表達(dá)miRNA訓(xùn)練血清學(xué)診斷的Logistic回歸模型，以預(yù)測卵巢癌風(fēng)險的概率。卵巢癌風(fēng)險概率=–1.3774+（0.0887×miR-202）+（0.1622×miR-508）+（0.3776×miR-509-3）+（–0.0381×miR-205）+（0.1101×miR-182）–（0.1038×miR-513C）+（0.0690×miR-183）+（0.2317×miR-513B）。

1.4??驗證模型的準(zhǔn)確性

從GEO數(shù)據(jù)庫下載2個公開可用的回顧性血清隊列miRNA數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗證（GSE113486和GSE31568）。通過受試者操作特征曲線（receiver?operating?characteristic?curve，ROC曲線）評估模型預(yù)測風(fēng)險概率的準(zhǔn)確性，使用“pROC”軟件包中的約登指數(shù)確定ROC曲線的最佳閾值。

1.5??統(tǒng)計學(xué)方法

使用R軟件（4.1.2版）進(jìn)行統(tǒng)計分析。limma軟件包用于訓(xùn)練集的差異表達(dá)分析，F(xiàn)DR校正通過Benjamini?Hochberg方法進(jìn)行。采用多元Logistic回歸方法構(gòu)建卵巢癌診斷模型。ROC曲線和曲線下面積（area?under?the?curve，AUC）用于評估模型的預(yù)測效果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??不同miRNA的篩選

通過差異分析Ⅰ期卵巢癌組織和正常組織的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)143種不同的miRNA。在143種miRNA中，篩選出8種在Ⅰ期卵巢癌組織中高表達(dá)的miRNA，即miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C，見圖1。

2.2??診斷模型的構(gòu)建和驗證

在訓(xùn)練隊列GSE106817中診斷卵巢癌的AUC為0.89，見圖2A。數(shù)據(jù)集GSE31568和GSE113486用于驗證模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示其診斷卵巢癌的AUC分別為0.85和0.86，見圖2B、圖2C。

3??討論

卵巢惡性腫瘤具有典型的組織學(xué)和分子學(xué)異質(zhì)性，通常在晚期被診斷。盡管腫瘤根治性手術(shù)治療效果較前明顯改善，但仍有50%的卵巢癌患者存在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致整體預(yù)后不良[11]?；蛱囟ㄎ稽c有望成為潛在的生物學(xué)檢測靶點[12]。卵巢癌的早期診斷和治療對提高患者生存率十分重要。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在卵巢癌診斷中極具潛力[13-14]。本研究建立1個基于miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C的多變量Logistic回歸模型。該模型診斷卵巢癌的AUC達(dá)0.89。在2個公開的隊列中驗證該模型診斷卵巢癌的效果，表明該模型對早期卵巢癌具有良好的診斷價值。與文獻(xiàn)報道大體一致。

miRNA在調(diào)節(jié)各種生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括但不限于分化、細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。血清中存在的miRNA來源于腫瘤組織，這使得血清miRNA具有作為腫瘤生物標(biāo)志物的潛力。miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，故有必要對miRNA與卵巢癌的相關(guān)性進(jìn)行更廣泛的研究。

在卵巢癌中，Wang等[15]發(fā)現(xiàn)miR-182通過直接和負(fù)調(diào)控程序性細(xì)胞死亡而參與細(xì)胞生長、侵襲和化療耐藥。一項基于GEO數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析研究表明，miR-182可調(diào)節(jié)卵巢癌的分子網(wǎng)絡(luò)，對其生物學(xué)進(jìn)程至關(guān)重要[16]。而miR-183在卵巢癌中上調(diào)，并通過轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad4信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。miR-183在卵巢癌的診斷中具有較高的敏感度和特異性[17]。據(jù)報道，miR-202-5p通過靶向HOXB2抑制卵巢癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。外泌體miR-205可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子A調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的生物進(jìn)程或抑制PTEN/Smad4表達(dá)[19]。研究證實miR-508-3p和miR-509-3對卵巢癌的預(yù)后和治療有一定價值[20-21]。下調(diào)miRNA-513在卵巢癌中可發(fā)揮腫瘤抑制作用。

綜上，基于血清miRNA（miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C）液體活檢的診斷模型對早期卵巢癌患者的診斷具有較高的臨床價值。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–11–09）

（修回日期：2024–04–21）