Ghrelin基因敲除對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元突觸后電位的影響

劉靜 李煥煥 焦倩 陳曦 姜宏 杜希恂

［摘要］ 目的

探討胃饑餓素（ghrelin）基因敲除對(duì)小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元突觸后電位的影響。

方法 分別選取10周齡雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-組）及其同窩雄性野生型（WT）小鼠（WT組）的黑質(zhì)組織，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)篩選差異表達(dá)基因（DEGs），通過(guò)KEGG通路富集分析DEGs可能參與的神經(jīng)元突觸活動(dòng)相關(guān)信號(hào)通路，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行驗(yàn)證，并應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western blotting）方法檢測(cè)神經(jīng)元突觸活動(dòng)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)情況。

結(jié)果 與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠多巴胺能神經(jīng)元突觸傳遞信號(hào)通路上的23個(gè)基因水平發(fā)生了顯著性變化，其中谷氨酸促離子型受體α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸型亞基3（GluA3）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）分別調(diào)控神經(jīng)元突觸后膜上的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體和N-甲基-D-天冬氨酸受體；在ghrelin-/-組小鼠黑質(zhì)組織中，GluA3和GSK-3β基因表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)。RT-qPCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠黑質(zhì)組織當(dāng)中GluA3和GSK-3β mRNA水平明顯下調(diào)（t=2.408、2.740，P<0.05）。Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與WT組相比，ghrelin-/-組小鼠黑質(zhì)組織中GluA3蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)（t=2.530，P<0.05），GSK-3β蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（t=3.469，P<0.05）。

結(jié)論 Ghrelin基因敲除可能通過(guò)使小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元突觸后電位長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，從而增強(qiáng)興奮性突觸傳遞活動(dòng)，參與運(yùn)動(dòng)調(diào)控。

［關(guān)鍵詞］ 胃促生長(zhǎng)素；基因敲除技術(shù)；黑質(zhì)；多巴胺能神經(jīng)元；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；受體，離子型谷氨酸

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R338.1;R394??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

胃饑餓素（ghrelin）是一種胃底X/A樣細(xì)胞分泌的含28個(gè)氨基酸的腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體1a（GHS-R1a）的內(nèi)源性配體，可刺激人和動(dòng)物生長(zhǎng)激素的分泌[1-4]。Ghrelin在機(jī)體中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能，如刺激腸道蠕動(dòng)、調(diào)節(jié)壓力和焦慮、防止肌肉萎縮以及改善心血管功能等[5-7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性ghrelin可通過(guò)激活GHS-R1a介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，拮抗神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8-11]。Ghrelin通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)回路，如下丘腦、腹側(cè)被蓋和海馬回路的突觸可塑性，使機(jī)體對(duì)攝食、藥物成癮、學(xué)習(xí)記憶等方面做出反應(yīng)[12]。本研究擬選用雄性野生型（WT）小鼠和雄性ghrelin基因敲除小鼠，對(duì)其黑質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序（RNA-seq），篩選差異表達(dá)基因（DEGs），通過(guò)KEGG通路富集分析DEGs可能參與的神經(jīng)元突觸活動(dòng)相關(guān)信號(hào)通路，并驗(yàn)證富集在神經(jīng)元突觸活動(dòng)通路上的相關(guān)基因以及蛋白在黑質(zhì)中的表達(dá)情況，探討ghrelin對(duì)小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元突觸活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TRIzol、RT SuperMix for qPCR、SYBR qPCR預(yù)混液購(gòu)買(mǎi)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京康為世紀(jì)有限公司，GSK-3β抗體購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司，GluA3抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物公司，ECL發(fā)光液購(gòu)自德國(guó)Millipore公司，UVP BioDoc-It成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Upland公司，SDS-PAFE垂直凝膠電泳槽、S1000 PCR儀、CFX96TM Real-Time System購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

10周齡的雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-組）11只及同窩雄性WT小鼠（WT組）11只均由江蘇集萃藥康生物公司提供。所有小鼠在室溫（24±1）℃，濕度為（55±5）%條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.3 方法

1.3.1 黑質(zhì)組織的提取及RNA-seq分析 所有g(shù)hrelin-/-組和WT組小鼠麻醉后，迅速斷頭處死，取出腦組織，置于干冰中速凍3 min，剝離雙側(cè)黑質(zhì)組織并置于標(biāo)記好的EP管中，－80 ℃保存。每組隨機(jī)選取6只小鼠的雙側(cè)黑質(zhì)組織用于測(cè)序。測(cè)序樣本低溫運(yùn)輸至北京諾禾致源生物有限公司進(jìn)行RNA-seq分析。

1.3.2 DEGs篩選 采用標(biāo)準(zhǔn)方法提取WT組和ghrelin-/-組小鼠腦組織中RNA，采用Subread軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，篩選兩組小鼠黑質(zhì)組織的DEGs，篩選條件為P<0.05。

1.3.3 KEGG通路富集分析 采用Cluster Profiler軟件對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05為顯著富集，P值越小表示富集越顯著，選取P值較小且參與突觸電活動(dòng)通路的基因，用于后續(xù)小鼠的驗(yàn)證。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)區(qū)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸型亞基3（GluA3）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）mRNA的水平 將兩組小鼠剩余的雙側(cè)黑質(zhì)組織（每組各5只），取其一側(cè)的全部黑質(zhì)組織置于500 μL TRI-

zol中，應(yīng)用TRIzol法提取組織總RNA。以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補(bǔ)的cDNA。配置PCR反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)完成擴(kuò)增。引物由北京擎科生物股份有限公司合成，引物名稱(chēng)及其序列見(jiàn)表1。采用SYBR法定量檢測(cè)目的基因GluA3、GSK-3β以及內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平，根據(jù)2－△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 Western blotting法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)區(qū)GluA3、

GSK-3β蛋白的表達(dá)水平 取兩組小鼠剩余的另外一側(cè)黑質(zhì)組織，加入100 μL蛋白裂解液（蛋白磷酸酶抑制劑∶蛋白酶抑制劑∶RIPA強(qiáng)裂解液=1∶2∶100）充分研磨以后，冰上靜置30 min，4 ℃下12 000 r/

min離心20 min。上清液移至新EP管中， BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（濃縮膠電泳參數(shù)為恒壓80 V，分離膠電泳參數(shù)為恒壓120 V）后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜從濕轉(zhuǎn)盒中取出，加入TBST配置的10%脫脂奶粉中，室溫孵育2 h。再分別加入GluA3（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃下于搖床上過(guò)夜。將HRP偶聯(lián)的二抗用TBST按照1∶10 000比例進(jìn)行稀釋?zhuān)覝叵路跤? h。用UVP BioDoc-It成像系統(tǒng)以及ECL高靈敏化學(xué)發(fā)光液試劑盒顯影，并采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，GluA3、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)量以GluA3、GSK-3β

2 結(jié)? 果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

12只小鼠的測(cè)序錯(cuò)誤率均低于12.5%，GC含量分布穩(wěn)定，WT組與ghrelin-/-組間基因表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.93，說(shuō)明數(shù)據(jù)的可靠性高，基因相似性高，可進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 兩組小鼠黑質(zhì)組織中DEGs分析

WT組與ghrelin-/-組間共有2 355個(gè)DEGs，其中1 655個(gè)基因在WT組呈現(xiàn)高表達(dá)，700個(gè)基因在ghrelin-/-組呈現(xiàn)高表達(dá)。

2.3 兩組小鼠黑質(zhì)組織中DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，有23個(gè)DEGs富集到多巴胺能突觸信號(hào)通路上，與WT組相比，ghrelin-/-組中表達(dá)上調(diào)的基因有5個(gè)，分別為原癌基因（Fos）、G 蛋白亞基γ3（Gng3）、蛋白磷酸酶1催化亞基α（Ppp1ca）以及蛋白磷酸酶2催化亞基（Ppp2r3a、Ppp2r5e）；表達(dá)下調(diào)的基因有18個(gè)，有多巴胺受體的D3亞型（Drd3）、鈉電壓門(mén)控通道α亞基1（Scn1α）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（Creb1）、谷氨酸離子型受體AMPA型亞基（GluA3、GluA4）、NMDA受體NR2亞基（Grin2b、Grin2a）、鈣電壓門(mén)控通道亞基（Cacna1a、Cacna1d）、絲氨酸/蘇氨酸激酶3（Akt3）等。其中GluA3和GSK-3β分別調(diào)節(jié)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異[FK（W][XCzz5.tif][FK）]唑丙酸受體（AMPAR）和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）的活性，在突觸傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。

2.4 Ghrelin基因敲除對(duì)小鼠黑質(zhì)組織中GluA3、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，WT組小鼠黑質(zhì)組織中GluA3 mRNA水平為1.129±0.230，ghrelin-/-組為0.552±0.068，兩組比較差異具有顯著意義（t=2.408，P<0.05）；WT組小鼠黑質(zhì)組織中GSK-3β mRNA的水平為1.257±0.121，ghrelin-/-組則為0.921±0.089，兩組比較差異具有顯著性（t=2.740，P<0.05）。

2.5 Ghrelin基因敲除對(duì)小鼠黑質(zhì)組織中GluA3、GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

WT組小鼠黑質(zhì)組織中GluA3蛋白表達(dá)水平為0.141±0.012，ghrelin-/-組為0.290±0.058，兩組比較差異具有顯著性（t=2.530，P<0.05）；WT組小鼠的黑質(zhì)組織中GSK-3β蛋白的表達(dá)水平為0.670±0.056，ghrelin-/-組為0.422±0.040，兩組比較差異具有顯著性（t=3.469，P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討? 論

突觸后電位持續(xù)增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象稱(chēng)為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）或長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD），LTP和LTD的改變都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如帕金森病、阿爾茨海默病、神經(jīng)性疼痛、抑郁癥等[13]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，興奮性神經(jīng)傳遞主要是由谷氨酸及其離子型受體介導(dǎo)的，包括介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮性突觸傳遞的AMPAR和維持長(zhǎng)期突觸可塑性的NMDAR。在哺乳動(dòng)物中，AMPAR主要負(fù)責(zé)大腦中的興奮性突觸傳遞，由成孔亞基GluA1～GluA4的各種組合形式組成[14-16]。在小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元中，表達(dá)有GluA3亞基的AMPAR存在于突觸和細(xì)胞表面，基礎(chǔ)條件下，GluA3處于低電導(dǎo)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高時(shí)，GluA3介導(dǎo)的電流會(huì)顯著增加[14]。AMPAR激活后，GluA3亞基能引起大量的Na＋和Ca2＋由胞外流到胞內(nèi)，從而介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸傳遞。研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷后小鼠海馬區(qū)GluA3的表達(dá)水平上調(diào)，該蛋白的上調(diào)能夠引起神經(jīng)元損傷以及學(xué)習(xí)和記憶功能的下降甚至喪失[17]。本研究結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，ghrelin-/-組小鼠黑質(zhì)組織中GluA3的mRNA水平降低，但是GluA3蛋白表達(dá)水平顯著升高，這種現(xiàn)象通常稱(chēng)為mRNA和蛋白質(zhì)水平之間的解偶聯(lián)。翻譯和翻譯后修飾以及mRNA結(jié)合蛋白和非編碼RNA都可導(dǎo)致mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，另外蛋白降解的途徑被抑制也會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象[18-19]。而上調(diào)的GluA3蛋白通過(guò)引起突觸后膜Na＋和Ca2＋的內(nèi)流，從而引發(fā)興奮性突觸傳遞[17，20]。

GSK-3是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)糖原合酶的活性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)。該酶具有兩種形式，即GSK-3α和GSK-3β，體內(nèi)研究表明GSK-3α基因缺失對(duì)小鼠胚胎存活沒(méi)有顯著影響，但GSK-3β的完全敲除能夠引發(fā)小鼠胚胎死亡[21]。GSK-3β功能異常與各種疾病有關(guān)，包括阿爾茨海默病、抑郁癥、雙相情感障礙和藥物成癮等。因此，GSK-3β被認(rèn)為是多種腦部疾病的主要治療靶點(diǎn)。該激酶被證實(shí)可參與NMDAR依賴(lài)性LTP和LTD的調(diào)節(jié)。研究表明，GSK-3抑制劑能夠阻止大鼠海馬CA1神經(jīng)元LTD的誘導(dǎo)，且可挽救因GSK-3β過(guò)表達(dá)而引起的LTP損傷。因此GSK-3β是誘導(dǎo)大鼠海馬CA1神經(jīng)元LTD所必需的，在LTD期間被激活[22]；大鼠海馬中的LTP被誘導(dǎo)以后，GSK-3β受到抑制[23-24]。在本研究中，與WT組小鼠相比，ghrelin-/-組小鼠黑質(zhì)中GSK-3β mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，這進(jìn)一步提示ghrelin敲除后，可能會(huì)引起小鼠NMDAR依賴(lài)性LTP增加。

綜上所述，在ghrelin基因敲除小鼠中，中腦黑質(zhì)區(qū)GluA3蛋白表達(dá)水平增加，GSK-3β蛋白表達(dá)水平降低，這可能會(huì)引起多巴胺能神經(jīng)元AMPAR以及NMDAR介導(dǎo)的LTP的發(fā)生，從而增強(qiáng)興奮性突觸傳遞活動(dòng)。本研究結(jié)果為ghrelin在神經(jīng)元突觸調(diào)控中的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-AEC-2023135）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作標(biāo)準(zhǔn)》的條例進(jìn)行。

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