樟葉總木脂素提取工藝及其抑菌活性研究

張嵐雄　鄭威　陳源桉　沈婧　鄒雙全　伍建榕　倪林

摘要：為研究樟葉總木脂素的最佳回流提取工藝及抑菌活性，以樟葉為研究對象，測定其芝麻素和9-羥基芝麻素含量，通過單因素聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法對樟葉總木脂素回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用帶毒平板法對總木脂素的抑菌活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，回流提取最佳工藝條件為提取溫度86 ℃、料液比1∶8.39（g·mL-1）、提取時間43 min、提取溶劑為無水乙醇，在此條件下木脂素提取率達(dá)0.380 4%。各因素對提取率的影響表現(xiàn)為提取溫度>提取時間>料液比。抑菌活性試驗(yàn)表明，木脂素含量為2 mg·mL-1時對鏈孢粘帚霉菌（Gliocladiumcatenulatum）、蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、西瓜尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporumf）和瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）的抑菌效果最佳，抑菌率均達(dá)到50% 以上；有效中質(zhì)量濃度（EC50）分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。以上研究結(jié)果為樟葉開發(fā)利用及植物源農(nóng)藥研究及開發(fā)提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：樟；木脂素；響應(yīng)面法；抑菌活性；毒力

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0281

中圖分類號：S792.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）05013810

樟（Cinnamomum camphora L. Presl）為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠喬木植物，是我國亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一[12]，主要分布在福建、臺灣、江西、廣東等地區(qū)[3-5]。樟樹廣泛用于中醫(yī)藥材，樟樹的根、果、枝和葉均可入藥，用于治療風(fēng)濕骨痛、胃腹冷痛、腹脹、吐瀉等[6]。研究表明，樟葉含有揮發(fā)性油[7]、木脂素[8]、黃酮類[9]和甾醇[10]等成分，具有抗氧化、抗炎、殺蟲、抑菌等活性[11]。本課題組致力于樟樹及其化合物藥用價值的開發(fā)與利用研究，且前期從樟葉中分離、鑒定出木脂素類成分芝麻素和9-羥基芝麻素，其中9-羥基芝麻素是樟葉中含量最高的化合物，達(dá)0.20%，芝麻素含量也較高，可達(dá)0.02%[12]。研究表明，木脂素具有多種生物活性，如保護(hù)肝臟、抗氧化、抗病毒、抑菌等功效[13]。

已報道的樟葉木脂素回流提取工藝中存在回流次數(shù)多、回流時間長、料液比高等缺點(diǎn)[1415]。如何高效地從樟葉中提取木脂素成為當(dāng)前亟需解決的問題，本課題組擬采用響應(yīng)面法[16]優(yōu)化回流提取樟葉木脂素的工藝，以含量較高的芝麻素和9-羥基芝麻素為指標(biāo)，使用高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）對木脂素含量進(jìn)行鑒定，旨在尋求最佳提取工藝；并采用帶毒平板法和菌絲生長速率法[1718]對其抑菌活性進(jìn)行探討，為樟樹及其提取物的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試植物與供試病原菌

供試樣品樟葉于2022年3月采自福建省泉州市南安市向陽鄉(xiāng)海山果林場（25° 17′38″N、118°31′10″E，海拔700 m）。經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全研究員鑒定為樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）樟（C. camphora）。標(biāo)本存放于福建農(nóng)林大學(xué)自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心樣品室[19]。4種供試植物病原菌[20]（表1）均由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)藥學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥與制藥工程系樣品室。

1.2 試驗(yàn)試劑

甲醇、乙醇、乙酸乙酯為分析純，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；乙腈為色譜級，購自德國默克集團(tuán)有限公司；純水、超純水由實(shí)驗(yàn)室自制；芝麻素、9-羥基芝麻素標(biāo)品由實(shí)驗(yàn)室自制，純度>98%；馬鈴薯購自永輝超市；葡萄糖、瓊脂粉購自上海神尚科技公司；工業(yè)酒精購自福州艾市佳科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

主要儀器包括TQ-400Y 高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）、PR224ZH/E型電子分析天平（美國OHAUS公司）、RV3V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）、HH-W600電熱恒溫水浴鍋（濟(jì)南歐萊博生物公司）、 KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、RC 2 Control冷卻循環(huán)器（德國IKA公司）、Waters W2695-QDA高效液相色譜儀（美國Waters公司）、SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、PRX-250B智能人工氣候箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、DGL-50B立式高壓滅菌鍋（江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司）。

1.4 樟木脂素的提取及其含量測定

1.4.1 HPLC分析條件

色譜條件參照郭茂等[21]的方法，采用Diamonsil C18 分析型反相色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm），以乙腈（A）–水（B）為流動相，梯度洗脫（0～30 min，30% A → 42% A；30～45 min，42% A → 65% A），流速1.0 mL·min-1，檢測波長235 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 對照品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考郭茂等[21]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別精密稱量10.8 mg芝麻素和12.3 mg 9-羥基芝麻素對照品，加入乙酸乙酯并稀釋定容至5 mL，制得對照品儲存溶液。量取1.0 mL對照品儲存溶液混合，即得芝麻素含量為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素含量為1.23 mg·mL-1 的混合對照品溶液（H1）；各準(zhǔn)確量取0.4 mL 對照品儲存溶液混合并定容至10 mL，得到芝麻素含量為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素含量為0.08 mg·mL-1 的混合對照品溶液（H2）。將配制的混合對照品溶液H1和H2按1.4.1的條件進(jìn)行檢測，其中混合對照品溶液H1 分別進(jìn)樣1、6、10、20 μL；混合對照樣品H2 分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，測定峰面積；以峰面積為縱坐標(biāo)，分別以對照品的2 個含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 樟木脂素回流提取工藝

將采集的樟葉置于陰涼處風(fēng)干，隨后取干燥樟葉用高速多功能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，稱取5.000 g 樟葉粉末并倒入500 mL平底燒瓶中，在不同條件下進(jìn)行熱回流提取，抽濾，即得到含木脂素的提取液。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)置

以芝麻素和9-羥基芝麻素的總含量為樟木脂素總提取率的評價指標(biāo)，分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比對木脂素總提取率的影響。

1.5.1 提取溶劑對提取率的影響

稱取5.000 g樟葉粉末，固定料液比1∶8（g·mL-1），提取時間40 min，提取溫度90 ℃，將提取溶劑分別設(shè)置為甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯，按照1.4 的方法進(jìn)行測定。

1.5.2 提取溫度對提取率的影響

稱取5 g樟葉粉末固定料液比1∶8（g·mL-1），提取時間40 min，提取溶劑為無水乙醇，分別設(shè)置提取溫度為80、85、90、95、100 ℃，按照1.4的方法進(jìn)行測定。

1.5.3 料液比對提取率的影響

稱取5 g樟葉粉末固定提取時間40 min，提取溫度90℃，提取溶劑為無水乙醇，將料液比分別設(shè)置為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g·mL-1），按照1.4的方法進(jìn)行測定。

1.5.4 提取時間對提取率的影響

稱取5 g樟葉粉末固定料液比1∶8（g·mL-1），提取溫度90℃，提取溶劑無水乙醇，提取時間分別為20、30、40、50、60 min，按照1.4的方法進(jìn)行測定。

1.6 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)得出提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）3個因素的水平值（表2），使用Design Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，共設(shè)計17 組試驗(yàn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 樟葉提取物抑菌試驗(yàn)

以樟葉中提取出的木脂素為研究對象，采用帶毒平板法及菌絲生長速率法對西瓜尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporumf）、鏈孢粘帚霉菌（Gliocladiumcatenulatum）、蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali Miyabeet Yamada）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）4種供試植物病原菌進(jìn)行抑菌活性研究。用乙酸乙酯對樟木脂素進(jìn)行溶解，藥液最終質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1，以相同溶解條件的溶液作為空白對照，測定抑菌活性。當(dāng)抑制率≥50%時，將木脂素配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1 的含藥PDA培養(yǎng)基，接種4種植物病原菌培養(yǎng)后再次測定其抑菌活性，并計算毒力回歸方程、有效中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（r），每處理組3次重復(fù)。菌絲生長抑制率（%）的計算公式如下。

抑菌率=[（D1-D2）/（D1-0.5）]×100% （1）

式中，D1 為對照菌落直徑，D2 為處理菌落直徑。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2016及SPSS 26對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，使用Orign 9.8.5.204對圖表進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 檢測結(jié)果

混合對照品與樣品的色譜圖如圖1 所示。9-羥基芝麻素和芝麻素在檢測波長235 nm處能實(shí)現(xiàn)分離，二者分離度均高于1.5，保留時間分別為30.769和43.740 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樟葉中芝麻素和9-羥基芝麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。芝麻素和9-羥基芝麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如下所示。

y=2×109x+8 316.5，R2=0.999 7 （2）

y=2×109x+144 585.0，R2=0.999 6 （3）

2.3 單因素試驗(yàn)分析

不同因素下的木脂素提取率如圖3所示。提取溶劑為無水乙醇時，木脂素的提取率極顯著高于乙酸乙酯，顯著高于甲醇，故選擇無水乙醇為最優(yōu)提取溶劑。

木脂素提取率隨提取溫度的提高先升高后降低。當(dāng)提取溫度為85 ℃時，樟木脂素提取率最高，極顯著高于90、95和100 ℃（P<0.01），顯著高于80 ℃（P<0.05）。因此選擇85 ℃作為響應(yīng)面分析中提取溫度的中心點(diǎn)。

木脂素的提取率隨料液比的減小先升高后降低，在1∶8（g·mL-1）時最大。當(dāng)料液比為1∶8（g·mL-1）時，木脂素的提取率極顯著高于料液比1∶10（g·mL-1）（P<0.01），顯著高于料液比1∶4（g·mL-1）（P<0.05），與料液比1∶6（g·mL-1）差異不顯著（P>0.05）。根據(jù)上述結(jié)果，選擇1∶8（g·mL-1）作為響應(yīng)面分析中料液比的中心點(diǎn)。

木脂素的提取率隨提取時間的延長呈先升高后降低趨勢，當(dāng)提取時間為40 min時，木脂素的提取率最高，極顯著高于20、50和60 min（P<0.01），顯著高于30 min（P<0.05），故選擇40 min為最優(yōu)提取時間。

2.4 響應(yīng)面分析

2.4.1 響應(yīng)面回歸模型建立與方差分析

依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表3），通過Design-Expert 8.0.6軟件二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到木脂素提取率（Y）與提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）3個因素的三元二次多項(xiàng)次回歸方程，如下所示。

Y=3.791×10-3+3.985×10-5A+2.633×10-5B+3.692×10-5C+2.608×10-5AB-9.972×10-6AC-1.126×10-5BC-9.758×10-5A2-7.222×10-5B2-5.103×10-5C2 （2）

對該回歸模型進(jìn)行方差分析（表4）可知，該回歸模型達(dá)到極顯著水平（P<0.000 1），決定系數(shù)（R2）為0.985 5，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.309 2），說明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高。

在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B、C 均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），表明影響樟木脂素提取率的因素依次為提取溫度、提取時間、料液比；二次項(xiàng)A2、B2、C2也均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；A 和B 交互作用達(dá)顯著水平（P<0.05），A 和C 及B 和C 的交互作用不顯著（P>0.05）。由此表明，3個因素對樟木脂素提取率的影響較為復(fù)雜，為非線性關(guān)系。

2.4.2 等高線圖與響應(yīng)曲面分析

由圖4可知，提取溫度與料液比的交互作用顯著影響樟木脂素提取率（P<0.05），主要表現(xiàn)為當(dāng)提取溫度逐漸升高時，提取率先逐漸增大后趨于平緩；當(dāng)料液比逐漸增加時，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當(dāng)提取溫度為86 ℃、料液比1∶8.39（g·mL-1）時，木脂素提取率最大。提取溫度和提取時間的交互作用對木脂素提取率影響不顯著，當(dāng)提取溫度為86 ℃、提取時間為43 min時，提取率達(dá)到最大；由等高線圖可知，相較于提取時間，提取溫度對木脂素提取率的影響更為顯著。料液比和提取時間的交互作用對木脂素提取率影響不顯著，當(dāng)料液比為1∶8.39（g·mL-1）、提取時間為43 min時，提取率最大；由等高線圖可知，相比于料液比，提取時間對木脂素提取率的影響更為顯著。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)分析

通過響應(yīng)面分析得到樟葉木脂素回流提取的最佳工藝條件：提取溫度86℃、料液比1∶8.39（g·mL-1），提取時間43 min，該條件下木脂素提取率的預(yù)測值為0.380 4%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在以上工藝條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果（表5）表明，木脂素的平均提取率為0.380 5%，與預(yù)測值接近，且符合正態(tài)分布，兩者的相對誤差為0.015 6%，表明響應(yīng)面建立的回歸模型與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較高，能較好地預(yù)測樟葉木脂素的提取情況。

2.6 樟提取物抑菌活性

由圖5可知，當(dāng)樟葉木脂素含量為2 mg·mL-1時，對4種供試植物病原菌均有良好的抑菌效果，抑菌率均達(dá)到50%以上。對4種供試植物病原菌毒力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6和表5所示，隨著劑量的增加，對這4種病原菌的抑菌效果也越來越明顯，EC50分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。

3 討論

在工業(yè)生產(chǎn)中樟常用于精油提取，但精油提取率較低。為豐富樟樹的多樣化利用，本研究利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化樟葉木脂素回流提取工藝，優(yōu)化后的最佳回流提取工藝為提取溫度86 ℃，料液比1∶8.39（g·mL-1），提取時間43 min，提取溶劑為無水乙醇，此時木脂素提取率為0.380 4%。與周海旭等[22]、袁列江等[23]優(yōu)化的工藝條件相比，回流次數(shù)減少，時間大幅度縮短，由2 h縮短至43 min，料液比從1∶11（g·mL-1）減少至1∶8.39（g·mL-1），得到的木脂素提取率與傳統(tǒng)提取率（0.392 1%）相近。與紫外分光光度法進(jìn)行樟葉木脂素含量測定不同，本研究以含量較高的芝麻素和9-羥基芝麻素為指標(biāo)，并采用HPLC對總木脂素含量進(jìn)行測定，HPLC具有靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)[2425]，得到的結(jié)果準(zhǔn)確性更高、專屬性更強(qiáng)、重復(fù)性更好。同時，本研究還研究了樟葉木脂素對4種常見植物致病真菌的抑菌率，發(fā)現(xiàn)其對鏈孢粘帚霉病菌、蘋果黑腐皮殼病菌、西瓜尖孢鐮孢菌和瓜果腐霉菌這4種病原菌均有較好的抑菌效果，抑菌均達(dá)到50%以上；毒力測定表明其對4種病原菌的有效中濃度（EC50）分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1，為后續(xù)樟葉開發(fā)利用及植物源農(nóng)藥研究及開發(fā)提供了一定的理論參考。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）

基金項(xiàng)目：福建省林業(yè)科技研究項(xiàng)目（No.2023FKJ28）；福建省科技計劃項(xiàng)目（2023N0003）。