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    樟葉總木脂素提取工藝及其抑菌活性研究

    2024-07-01 08:05:06張嵐雄鄭威陳源桉沈婧鄒雙全伍建榕倪林
    關(guān)鍵詞:木脂素抑菌活性響應(yīng)面法

    張嵐雄 鄭威 陳源桉 沈婧 鄒雙全 伍建榕 倪林

    摘要:為研究樟葉總木脂素的最佳回流提取工藝及抑菌活性,以樟葉為研究對象,測定其芝麻素和9-羥基芝麻素含量,通過單因素聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法對樟葉總木脂素回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并采用帶毒平板法對總木脂素的抑菌活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明,回流提取最佳工藝條件為提取溫度86 ℃、料液比1∶8.39(g·mL-1)、提取時間43 min、提取溶劑為無水乙醇,在此條件下木脂素提取率達(dá)0.380 4%。各因素對提取率的影響表現(xiàn)為提取溫度>提取時間>料液比。抑菌活性試驗(yàn)表明,木脂素含量為2 mg·mL-1時對鏈孢粘帚霉菌(Gliocladiumcatenulatum)、蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、西瓜尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporumf)和瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的抑菌效果最佳,抑菌率均達(dá)到50% 以上;有效中質(zhì)量濃度(EC50)分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。以上研究結(jié)果為樟葉開發(fā)利用及植物源農(nóng)藥研究及開發(fā)提供了理論參考。

    關(guān)鍵詞:樟;木脂素;響應(yīng)面法;抑菌活性;毒力

    doi:10.13304/j.nykjdb.2023.0281

    中圖分類號:S792.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:10080864(2024)05013810

    樟(Cinnamomum camphora L. Presl)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木植物,是我國亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一[12],主要分布在福建、臺灣、江西、廣東等地區(qū)[3-5]。樟樹廣泛用于中醫(yī)藥材,樟樹的根、果、枝和葉均可入藥,用于治療風(fēng)濕骨痛、胃腹冷痛、腹脹、吐瀉等[6]。研究表明,樟葉含有揮發(fā)性油[7]、木脂素[8]、黃酮類[9]和甾醇[10]等成分,具有抗氧化、抗炎、殺蟲、抑菌等活性[11]。本課題組致力于樟樹及其化合物藥用價值的開發(fā)與利用研究,且前期從樟葉中分離、鑒定出木脂素類成分芝麻素和9-羥基芝麻素,其中9-羥基芝麻素是樟葉中含量最高的化合物,達(dá)0.20%,芝麻素含量也較高,可達(dá)0.02%[12]。研究表明,木脂素具有多種生物活性,如保護(hù)肝臟、抗氧化、抗病毒、抑菌等功效[13]。

    已報道的樟葉木脂素回流提取工藝中存在回流次數(shù)多、回流時間長、料液比高等缺點(diǎn)[1415]。如何高效地從樟葉中提取木脂素成為當(dāng)前亟需解決的問題,本課題組擬采用響應(yīng)面法[16]優(yōu)化回流提取樟葉木脂素的工藝,以含量較高的芝麻素和9-羥基芝麻素為指標(biāo),使用高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)對木脂素含量進(jìn)行鑒定,旨在尋求最佳提取工藝;并采用帶毒平板法和菌絲生長速率法[1718]對其抑菌活性進(jìn)行探討,為樟樹及其提取物的開發(fā)與利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試植物與供試病原菌

    供試樣品樟葉于2022年3月采自福建省泉州市南安市向陽鄉(xiāng)海山果林場(25° 17′38″N、118°31′10″E,海拔700 m)。經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全研究員鑒定為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)樟(C. camphora)。標(biāo)本存放于福建農(nóng)林大學(xué)自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心樣品室[19]。4種供試植物病原菌[20](表1)均由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)藥學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,菌種保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥與制藥工程系樣品室。

    1.2 試驗(yàn)試劑

    甲醇、乙醇、乙酸乙酯為分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;乙腈為色譜級,購自德國默克集團(tuán)有限公司;純水、超純水由實(shí)驗(yàn)室自制;芝麻素、9-羥基芝麻素標(biāo)品由實(shí)驗(yàn)室自制,純度>98%;馬鈴薯購自永輝超市;葡萄糖、瓊脂粉購自上海神尚科技公司;工業(yè)酒精購自福州艾市佳科技有限公司。

    1.3 試驗(yàn)儀器

    主要儀器包括TQ-400Y 高速多功能粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)、PR224ZH/E型電子分析天平(美國OHAUS公司)、RV3V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)、HH-W600電熱恒溫水浴鍋(濟(jì)南歐萊博生物公司)、 KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、RC 2 Control冷卻循環(huán)器(德國IKA公司)、Waters W2695-QDA高效液相色譜儀(美國Waters公司)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、PRX-250B智能人工氣候箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、DGL-50B立式高壓滅菌鍋(江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司)。

    1.4 樟木脂素的提取及其含量測定

    1.4.1 HPLC分析條件

    色譜條件參照郭茂等[21]的方法,采用Diamonsil C18 分析型反相色譜柱(250 mm×20 mm,5 μm),以乙腈(A)–水(B)為流動相,梯度洗脫(0~30 min,30% A → 42% A;30~45 min,42% A → 65% A),流速1.0 mL·min-1,檢測波長235 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

    1.4.2 對照品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    參考郭茂等[21]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別精密稱量10.8 mg芝麻素和12.3 mg 9-羥基芝麻素對照品,加入乙酸乙酯并稀釋定容至5 mL,制得對照品儲存溶液。量取1.0 mL對照品儲存溶液混合,即得芝麻素含量為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素含量為1.23 mg·mL-1 的混合對照品溶液(H1);各準(zhǔn)確量取0.4 mL 對照品儲存溶液混合并定容至10 mL,得到芝麻素含量為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素含量為0.08 mg·mL-1 的混合對照品溶液(H2)。將配制的混合對照品溶液H1和H2按1.4.1的條件進(jìn)行檢測,其中混合對照品溶液H1 分別進(jìn)樣1、6、10、20 μL;混合對照樣品H2 分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL,測定峰面積;以峰面積為縱坐標(biāo),分別以對照品的2 個含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4.3 樟木脂素回流提取工藝

    將采集的樟葉置于陰涼處風(fēng)干,隨后取干燥樟葉用高速多功能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,稱取5.000 g 樟葉粉末并倒入500 mL平底燒瓶中,在不同條件下進(jìn)行熱回流提取,抽濾,即得到含木脂素的提取液。

    1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)置

    以芝麻素和9-羥基芝麻素的總含量為樟木脂素總提取率的評價指標(biāo),分別考察提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比對木脂素總提取率的影響。

    1.5.1 提取溶劑對提取率的影響

    稱取5.000 g樟葉粉末,固定料液比1∶8(g·mL-1),提取時間40 min,提取溫度90 ℃,將提取溶劑分別設(shè)置為甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯,按照1.4 的方法進(jìn)行測定。

    1.5.2 提取溫度對提取率的影響

    稱取5 g樟葉粉末固定料液比1∶8(g·mL-1),提取時間40 min,提取溶劑為無水乙醇,分別設(shè)置提取溫度為80、85、90、95、100 ℃,按照1.4的方法進(jìn)行測定。

    1.5.3 料液比對提取率的影響

    稱取5 g樟葉粉末固定提取時間40 min,提取溫度90℃,提取溶劑為無水乙醇,將料液比分別設(shè)置為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g·mL-1),按照1.4的方法進(jìn)行測定。

    1.5.4 提取時間對提取率的影響

    稱取5 g樟葉粉末固定料液比1∶8(g·mL-1),提取溫度90℃,提取溶劑無水乙醇,提取時間分別為20、30、40、50、60 min,按照1.4的方法進(jìn)行測定。

    1.6 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計

    根據(jù)單因素試驗(yàn)得出提取溫度(A)、料液比(B)、提取時間(C)3個因素的水平值(表2),使用Design Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析,共設(shè)計17 組試驗(yàn),中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次。

    1.7 樟葉提取物抑菌試驗(yàn)

    以樟葉中提取出的木脂素為研究對象,采用帶毒平板法及菌絲生長速率法對西瓜尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporumf)、鏈孢粘帚霉菌(Gliocladiumcatenulatum)、蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)4種供試植物病原菌進(jìn)行抑菌活性研究。用乙酸乙酯對樟木脂素進(jìn)行溶解,藥液最終質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1,以相同溶解條件的溶液作為空白對照,測定抑菌活性。當(dāng)抑制率≥50%時,將木脂素配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1 的含藥PDA培養(yǎng)基,接種4種植物病原菌培養(yǎng)后再次測定其抑菌活性,并計算毒力回歸方程、有效中濃度(EC50)和相關(guān)系數(shù)(r),每處理組3次重復(fù)。菌絲生長抑制率(%)的計算公式如下。

    抑菌率=[(D1-D2)/(D1-0.5)]×100% (1)

    式中,D1 為對照菌落直徑,D2 為處理菌落直徑。

    1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

    運(yùn)用Excel 2016及SPSS 26對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析,使用Orign 9.8.5.204對圖表進(jìn)行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC 檢測結(jié)果

    混合對照品與樣品的色譜圖如圖1 所示。9-羥基芝麻素和芝麻素在檢測波長235 nm處能實(shí)現(xiàn)分離,二者分離度均高于1.5,保留時間分別為30.769和43.740 min。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    樟葉中芝麻素和9-羥基芝麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。芝麻素和9-羥基芝麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如下所示。

    y=2×109x+8 316.5,R2=0.999 7 (2)

    y=2×109x+144 585.0,R2=0.999 6 (3)

    2.3 單因素試驗(yàn)分析

    不同因素下的木脂素提取率如圖3所示。提取溶劑為無水乙醇時,木脂素的提取率極顯著高于乙酸乙酯,顯著高于甲醇,故選擇無水乙醇為最優(yōu)提取溶劑。

    木脂素提取率隨提取溫度的提高先升高后降低。當(dāng)提取溫度為85 ℃時,樟木脂素提取率最高,極顯著高于90、95和100 ℃(P<0.01),顯著高于80 ℃(P<0.05)。因此選擇85 ℃作為響應(yīng)面分析中提取溫度的中心點(diǎn)。

    木脂素的提取率隨料液比的減小先升高后降低,在1∶8(g·mL-1)時最大。當(dāng)料液比為1∶8(g·mL-1)時,木脂素的提取率極顯著高于料液比1∶10(g·mL-1)(P<0.01),顯著高于料液比1∶4(g·mL-1)(P<0.05),與料液比1∶6(g·mL-1)差異不顯著(P>0.05)。根據(jù)上述結(jié)果,選擇1∶8(g·mL-1)作為響應(yīng)面分析中料液比的中心點(diǎn)。

    木脂素的提取率隨提取時間的延長呈先升高后降低趨勢,當(dāng)提取時間為40 min時,木脂素的提取率最高,極顯著高于20、50和60 min(P<0.01),顯著高于30 min(P<0.05),故選擇40 min為最優(yōu)提取時間。

    2.4 響應(yīng)面分析

    2.4.1 響應(yīng)面回歸模型建立與方差分析

    依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表3),通過Design-Expert 8.0.6軟件二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到木脂素提取率(Y)與提取溫度(A)、料液比(B)、提取時間(C)3個因素的三元二次多項(xiàng)次回歸方程,如下所示。

    Y=3.791×10-3+3.985×10-5A+2.633×10-5B+3.692×10-5C+2.608×10-5AB-9.972×10-6AC-1.126×10-5BC-9.758×10-5A2-7.222×10-5B2-5.103×10-5C2 (2)

    對該回歸模型進(jìn)行方差分析(表4)可知,該回歸模型達(dá)到極顯著水平(P<0.000 1),決定系數(shù)(R2)為0.985 5,失擬項(xiàng)不顯著(P=0.309 2),說明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高。

    在回歸模型中,一次項(xiàng)A、B、C 均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),表明影響樟木脂素提取率的因素依次為提取溫度、提取時間、料液比;二次項(xiàng)A2、B2、C2也均達(dá)到極顯著水平(P<0.01);A 和B 交互作用達(dá)顯著水平(P<0.05),A 和C 及B 和C 的交互作用不顯著(P>0.05)。由此表明,3個因素對樟木脂素提取率的影響較為復(fù)雜,為非線性關(guān)系。

    2.4.2 等高線圖與響應(yīng)曲面分析

    由圖4可知,提取溫度與料液比的交互作用顯著影響樟木脂素提取率(P<0.05),主要表現(xiàn)為當(dāng)提取溫度逐漸升高時,提取率先逐漸增大后趨于平緩;當(dāng)料液比逐漸增加時,提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;當(dāng)提取溫度為86 ℃、料液比1∶8.39(g·mL-1)時,木脂素提取率最大。提取溫度和提取時間的交互作用對木脂素提取率影響不顯著,當(dāng)提取溫度為86 ℃、提取時間為43 min時,提取率達(dá)到最大;由等高線圖可知,相較于提取時間,提取溫度對木脂素提取率的影響更為顯著。料液比和提取時間的交互作用對木脂素提取率影響不顯著,當(dāng)料液比為1∶8.39(g·mL-1)、提取時間為43 min時,提取率最大;由等高線圖可知,相比于料液比,提取時間對木脂素提取率的影響更為顯著。

    2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)分析

    通過響應(yīng)面分析得到樟葉木脂素回流提取的最佳工藝條件:提取溫度86℃、料液比1∶8.39(g·mL-1),提取時間43 min,該條件下木脂素提取率的預(yù)測值為0.380 4%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性,在以上工藝條件下進(jìn)行3次試驗(yàn),結(jié)果(表5)表明,木脂素的平均提取率為0.380 5%,與預(yù)測值接近,且符合正態(tài)分布,兩者的相對誤差為0.015 6%,表明響應(yīng)面建立的回歸模型與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較高,能較好地預(yù)測樟葉木脂素的提取情況。

    2.6 樟提取物抑菌活性

    由圖5可知,當(dāng)樟葉木脂素含量為2 mg·mL-1時,對4種供試植物病原菌均有良好的抑菌效果,抑菌率均達(dá)到50%以上。對4種供試植物病原菌毒力進(jìn)行測定,結(jié)果如圖6和表5所示,隨著劑量的增加,對這4種病原菌的抑菌效果也越來越明顯,EC50分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1。

    3 討論

    在工業(yè)生產(chǎn)中樟常用于精油提取,但精油提取率較低。為豐富樟樹的多樣化利用,本研究利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化樟葉木脂素回流提取工藝,優(yōu)化后的最佳回流提取工藝為提取溫度86 ℃,料液比1∶8.39(g·mL-1),提取時間43 min,提取溶劑為無水乙醇,此時木脂素提取率為0.380 4%。與周海旭等[22]、袁列江等[23]優(yōu)化的工藝條件相比,回流次數(shù)減少,時間大幅度縮短,由2 h縮短至43 min,料液比從1∶11(g·mL-1)減少至1∶8.39(g·mL-1),得到的木脂素提取率與傳統(tǒng)提取率(0.392 1%)相近。與紫外分光光度法進(jìn)行樟葉木脂素含量測定不同,本研究以含量較高的芝麻素和9-羥基芝麻素為指標(biāo),并采用HPLC對總木脂素含量進(jìn)行測定,HPLC具有靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)[2425],得到的結(jié)果準(zhǔn)確性更高、專屬性更強(qiáng)、重復(fù)性更好。同時,本研究還研究了樟葉木脂素對4種常見植物致病真菌的抑菌率,發(fā)現(xiàn)其對鏈孢粘帚霉病菌、蘋果黑腐皮殼病菌、西瓜尖孢鐮孢菌和瓜果腐霉菌這4種病原菌均有較好的抑菌效果,抑菌均達(dá)到50%以上;毒力測定表明其對4種病原菌的有效中濃度(EC50)分別為1.238、1.280、1.486和0.419 mg·mL-1,為后續(xù)樟葉開發(fā)利用及植物源農(nóng)藥研究及開發(fā)提供了一定的理論參考。

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    (責(zé)任編輯:張冬玲)

    基金項(xiàng)目:福建省林業(yè)科技研究項(xiàng)目(No.2023FKJ28);福建省科技計劃項(xiàng)目(2023N0003)。

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