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    玉米木質(zhì)素合成途徑基因ZmCCoAOMT1 功能研究及轉(zhuǎn)錄組分析

    2024-07-01 10:07:21徐佳睿王逸茹趙紹賡李坤鄭軍
    關(guān)鍵詞:青貯玉米木質(zhì)素

    徐佳睿 王逸茹 趙紹賡 李坤 鄭軍

    摘要:青貯玉米是一種優(yōu)良的飼料作物,是畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源。咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl-CoA-O-methyltransferase, CCoAOMT)是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶。從玉米自交系B73的EMS突變體庫獲得了ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變體,通過表型分析、生理生化分析、基因表達(dá)分析驗證了ZmCCoAOMT1 的功能。研究發(fā)現(xiàn),ZmCCoAOMT1 突變造成莖稈木質(zhì)化程度降低、木質(zhì)素含量顯著減少、G型木質(zhì)素(guaiacyl lignin)和S型木質(zhì)素(syringa lignin)含量下降、體外干物質(zhì)消化率提高。此外,突變體莖稈中ZmCCoAOMT1 的表達(dá)量也顯著低于野生型。轉(zhuǎn)錄組分析表明,ZmCCoAOMT1 基因的突變可能調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而引起木質(zhì)素含量和單體組成發(fā)生變化。因此,ZmCCoAOMT1 基因是培育高消化率優(yōu)質(zhì)青貯玉米品種的重要基因資源,研究結(jié)果為木質(zhì)素合成代謝途徑遺傳機理研究提供了重要理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:青貯玉米;木質(zhì)素;轉(zhuǎn)錄組分析;ZmCCoAOMT1

    doi:10.13304/j.nykjdb.2024.0186

    中圖分類號:S513,Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:10080864(2024)05003014

    玉米(Zea mays L.)是我國主要糧食作物之一,也是重要的飼料來源。近年來,由于國內(nèi)畜牧業(yè)的迅速擴張,導(dǎo)致人畜之間的糧食競爭愈加激烈[1],因此,培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的玉米品種至關(guān)重要。青貯玉米是指在籽粒乳熟末期至蠟熟前期收獲的地上全部綠色植株(包括果穗)經(jīng)過青貯發(fā)酵后制作而成的青貯飼料,具有青綠多汁、產(chǎn)量高、適口性好、耐貯存等特點[2]。20世紀(jì)80年代之前,我國尚未培育出專用的青貯玉米品種,為了滿足青貯飼料的需求,許多地區(qū)采用籽粒玉米品種替代[3]。青貯玉米中木質(zhì)素含量過高可能導(dǎo)致牲畜對飼料的消化利用效率下降,嚴(yán)重影響家畜的生產(chǎn)性能。

    木質(zhì)素是由苯丙烷基為基本結(jié)構(gòu)單元組成的高分子材料,在植物體內(nèi)占比約為15%~36%,具有緊湊的分子結(jié)構(gòu)[4]。植物苯丙烷代謝途徑(phenylpropanoid metabolic pathway)主要分為3部分:首先是莽草酸途徑,通過糖的代謝過程將葡萄糖轉(zhuǎn)化為莽草酸,再轉(zhuǎn)化為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸;其次是公共苯丙烷途徑,這個過程從苯丙氨酸出發(fā),經(jīng)多級酶聯(lián)反應(yīng),最終生成相應(yīng)的輔酶A;最后是特異木質(zhì)素合成途徑,將催化生成的中間產(chǎn)物輔酶A轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的木質(zhì)素單體:對香豆醇(對羥苯基木質(zhì)素,P-hydroxyphenyl lignin,H型木質(zhì)素)、松柏醇(愈創(chuàng)木基木質(zhì)素,guaiacyllignin,G型木質(zhì)素)和芥子醇(紫丁香基木質(zhì)素,syringa lignin,S 型木質(zhì)素),進(jìn)而參與木質(zhì)素合成[5]。

    CCoAOMT 屬于S- 腺苷-L- 甲硫氨酸(Sadenosylmethionine,SAM)甲基轉(zhuǎn)移酶,在苯丙烷代謝通路中存在于公共苯丙烷途徑,主要負(fù)責(zé)將咖啡酰輔酶A轉(zhuǎn)化為阿魏酰輔酶A,在木質(zhì)素合成中起重要作用[6]。其最早在歐芹[7]中發(fā)現(xiàn),之后在百日草[8] 中首次被證實參與木質(zhì)素合成。CCoAOMT具備催化諸如黃酮類、生物堿等化合物生成甲基化酚類代謝產(chǎn)物的能力[9],其以咖啡酰輔酶A為底物,將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團(tuán)傳遞至木質(zhì)素單體,從而促進(jìn)G 型木質(zhì)素的合成[10]。Chen 等[11]揭示了CCoAOMT 基因可以甲基化咖啡酰輔酶A的C3位,進(jìn)一步催化生成木質(zhì)素單體的前體阿魏酰輔酶A。在擬南芥中有2種類型的CCoAOMT:Ⅰ類包含CCoAOMT1,Ⅱ類則包含CCoAOMT2-7[12],CCoAOMT1 在CCoAOMT 家族基因中是最早被確認(rèn)參與木質(zhì)素合成的[13]。

    目前,已從擬南芥、苜蓿、小麥、毛白楊等植物中克隆獲得CCoAOMT 基因。例如,在煙草中抑制CCoAOMT 基因的表達(dá),導(dǎo)致植株明顯矮化,木質(zhì)素含量下降22.3%,S型和G型木質(zhì)素單體的比例(S/G)增加[14]。在苜蓿中,抑制CCoAOMT1 基因的表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株的G型木質(zhì)素含量下降50%左右,而S型木質(zhì)素的含量保持不變,因此S/G顯著上升,細(xì)胞壁的消化率顯著增加[15]。同時,CCoAOMT對生物和非生物脅迫有重要調(diào)控作用,例如在擬南芥中過量表達(dá)CCoAOMT1 可以提高其對丁香假單胞菌DC3000 的抗性[16];Chun 等[17]發(fā)現(xiàn),AtCCoAOMT1 還可以通過ROS和ABA信號通路提高擬南芥的抗旱性,且在同等環(huán)境下擬南芥轉(zhuǎn)基因植株吸收鎘的能力是野生型的2倍,證明了CCoAOMT1 基因能夠降低重金屬對植株的影響,提高植物的修復(fù)能力[18]。

    迄今,在玉米基因組中共發(fā)現(xiàn)4個CCoAOMT基因,分別是ZmCCoAOMT1、ZmCCoAOMT2、ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4。Fornalé 等[19] 對ZmCOMT2 和ZmCCoAOMT1 的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)ZmCCoAOMT1下調(diào)表達(dá)時,莖稈中H型單體的含量有所上升,S型單體略有減少,木質(zhì)素含量減少6.7%。Brenner 等[20] 通過分析40 份青貯玉米自交系發(fā)現(xiàn),ZmCCoAOMT1 和ZmCCoAOMT2 均與秸稈細(xì)胞壁消化率高度關(guān)聯(lián);Yang 等[21] 對ZmCCoAOMT2 的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),ZmCCoAOMT2 對小斑病和灰斑病具有顯著抗性。上述研究表明,ZmCCoAOMT 在控制木質(zhì)素含量和不同單體組成以及植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用。目前ZmCCoAOMT 基因在玉米中的研究仍然較少。本研究利用ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變體,結(jié)合表型分析、生理生化分析、基因表達(dá)分析和轉(zhuǎn)錄組分析來探究ZmCCoAOMT1 的遺傳機制,對于理解木質(zhì)素合成及代謝途徑具有極其重要的參考價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料和田間試驗

    供試材料ZmCCoAOMT1(Zm00001d036293)基因EMS單堿基突變體(ems-0869cd,ccoaomt1)和同一世代分離的野生型(WT)來自B73玉米突變體庫(www.elabcaas.cn/memd/)。田間試驗在北京市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義基地完成,2022年夏季播種,行長4 m,行距0.6 m,株距0.25 m,每行20穴,每小區(qū)3行。收獲時每個小區(qū)隨機選取15株測定株高(plant height,PH)、穗位高(ear height,EH)等農(nóng)藝性狀[22]。

    1.2 基因組DNA、RNA 的提取以及cDNA 的制備

    取2 葉1 心期的玉米幼苗第2 片葉,用植物DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取DNA;分別在玉米拔節(jié)期(V9)和吐絲期取地上部第3 節(jié)莖部,RNA prep pure 植物總 RNA 提取試劑盒(Vazyme,南京)提取RNA并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme,南京)制備cDNA。

    1.3 EMS 材料篩選與鑒定

    利用玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB(https://maizegdb.org)檢索ZmCCoAOMT1 基因(登錄號:Zm00001d036293)序列,設(shè)計引物ZmCCoAOMT1-EMS-F1/R1(表1)進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系50 μL:Phanta Uc Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、正反向引物各2 μL、dNTP Mix 1 μL、5 × Uc Bufferfor Library Amplification 10 μL、DNA 2 μL、ddH2O32 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 3 min;95 ℃變性15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 60 s,30 個循環(huán);72 ℃終延伸 5 min。將擴增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司測序。

    1.4 木質(zhì)素染色

    取成熟期的突變體和野生型地上部第3莖節(jié)節(jié)間,浸泡在FAA 固定液(70% 乙醇90 mL、38%甲醛5 mL、冰醋酸5 mL、甘油5 mL)中固定2 h后取出,用3% 瓊脂糖包埋,進(jìn)而用震蕩切片機(LeicaVT1000s,德國)切片,厚度為45 μm。將切片平整展于載玻片上,加Wiesner試劑染色2 min[23],用體式顯微鏡(Leica M205 FA,德國)觀察拍照。

    1.5 木質(zhì)素相關(guān)性狀測定

    在玉米授粉后30~40 d,選取8株長勢一致的植株,截取地上部倒數(shù)第3~4莖節(jié),立即在105 ℃下殺青30 min,65 ℃烘干至恒重,用粉碎機粉碎,過40目網(wǎng)篩,再次烘干,粉末用于木質(zhì)素總量、消化品質(zhì)和單體組成測量。每次實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

    1.5.1 木質(zhì)素含量測定

    取研磨好的玉米莖稈粉末2 mg,使用木質(zhì)素含量測定試劑盒(科銘生物有限公司)進(jìn)行處理,將木質(zhì)素中的酚羥基乙?;笊梢阴D举|(zhì)素,使用Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司,美國)測定280 nm波長處的特征吸收峰,通過吸光值的變化定量木質(zhì)素的含量。

    1.5.2 木質(zhì)素消化品質(zhì)測定

    將研磨好的玉米莖稈粉末裝滿于10 mL西林瓶中,放置在MPA近紅外光譜儀(布魯克科技有限公司,德國)的樣品旋轉(zhuǎn)池中,每個樣品重復(fù)3次,分別測定酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin,ADL)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)和體外干物質(zhì)消化率(in vitro dry matter digestibility,IVDMD)[24]。

    1.5.3 木質(zhì)素單體測定

    取研磨好的玉米莖稈粉末1 g,采用硫代酸解法對玉米莖稈粉末進(jìn)行處理使木質(zhì)素分子鏈上的β-O-4醚鍵斷裂,生成木質(zhì)素單體,利用GCMS-TQ 8050 NX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(SHIMADZU,日本)測定對羥基苯甲醛(H型)、丁香醛(S型)、香草醛(G型)3種木質(zhì)素單體含量[25]。

    1.6 基因表達(dá)量分析

    qRT-PCR 用熒光定量試劑盒ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,南京)檢測ZmCCoAOMT 基因在玉米不同生長時期的表達(dá)量,所用引物為ZmCCoAOMT1-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT2-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT3-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT4-Q-F1/R1,內(nèi)參基因選擇玉米三磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH(表1)。反應(yīng)體系20 μL:2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O7.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40 個循環(huán)。用2-ΔΔCT 法[26]計算基因的相對表達(dá)水平。

    1.7 轉(zhuǎn)錄組分析

    分別在突玉米拔節(jié)期(V9)和吐絲期取變體和野生型的的莖稈提取RNA,送安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司(北京)構(gòu)建cDNA測序文庫。樣品分成Ⅰ(V9-WT)、Ⅱ(V9-ccoaomt1)、Ⅲ(吐絲-WT)和Ⅳ(吐絲-ccoaomt1)4個組,3次重復(fù)。對其文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測,質(zhì)量合格的cDNA文庫用Illumina 高通量測序平臺進(jìn)行測序。用RSEM軟件對樣本中的基因豐度進(jìn)行定量分析,用FPKM方法對各個樣本中的基因表達(dá)量進(jìn)行計算,比較不同樣本間的數(shù)據(jù)篩選出差異表達(dá)基因,用 DESeq 進(jìn)行差異基因分析,以FDR<0.05且|log2 FC|>1(FC為變異倍數(shù),fold change)為標(biāo)準(zhǔn)篩差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。

    對差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO[27](geneontology,http://www.geneontologyorg/)功能富集分析;以及利用KEGG[28](kyoto encyclopedia ofgenes and genomes,http://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行通路(pathway)富集分析,以 KEGG 數(shù)據(jù)庫中通路為單位,以參考基因組背景為對照,將差異基因顯示于KEGG通路圖上。閾值設(shè)置為顯著性P<0.05,使用R 軟件中clusterProfiler 語言包對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析和可視化[29],并利用ggplot2語言包作圖。

    為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)的準(zhǔn)確性,隨機挑選了15個在2個時期苯丙氨酸途徑的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZmCCoAOMT1 突變體的鑒定

    為了探究ZmCCoAOMT1 基因的功能,從B73玉米突變體庫獲得了ZmCCoAOMT1 單堿基突變體ccoaomt1,突變類型為翻譯提前終止,CDS序列第558 位堿基由C 突變成T(圖1A~C),野生型為同一世代分離出的顯性純合體。對突變體和野生型進(jìn)行qRT-PCR,結(jié)果表明,突變體中ZmCCoAOMT1 基因的表達(dá)量與野生型相比顯著降低(圖1D),說明該單堿基突變對ZmCCoAOMT1基因表達(dá)有顯著影響。

    2.2 ZmCCoAOMT1 的進(jìn)化樹分析

    ZmCCoAOMT1 的開放閱讀框長度為792 bp,編碼258個氨基酸,通過Protein BLAST數(shù)據(jù)庫篩選出與ZmCCoAOMT家族編碼的同源性較高的物種,包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小麥(Triticum aestivum)、稷(Panicum miliaceum)等。CCoAOMT氨基酸序列分為5類(圖2):Ⅰ類包括ZmCCoAOMT1和ZmCCoAOMT2和絕大部分高粱CCoAOMT 氨基酸序列,Ⅱ類包括ZmCCoAOMT3和大部分煙草CCoAOMT氨基酸序列,Ⅲ和Ⅳ為擬南芥CCoAOMT 的氨基酸序列,Ⅴ 類僅有ZmCCoAOMT4。結(jié)果表明,ZmCCoAOMT1 和ZmCCoAOMT2親緣關(guān)系最近,與ZmCCoAOMT3和ZmCCoAOMT4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    2.3 ZmCCoAOMT1 突變對株型的影響

    對突變體和野生型農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),ccoaomt1 突變體的株高和穗位高與野生型相比略有增高,但不顯著,分別增加了1.4% 和6.9%(圖3A和B),說明ZmCCoAOMT1 單堿基突變未對玉米株高等株型性狀產(chǎn)生顯著正向作用。

    2.4 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素合成代謝的影響

    2.4.1 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素染色的影響

    為了初步探究ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素的影響,對野生型和突變體莖稈進(jìn)行木質(zhì)素染色,與野生型相比,突變體莖稈的染色變淺,木質(zhì)化程度明顯降低,細(xì)胞中的維管束和厚壁組織有所減少,表明ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變影響植株的木質(zhì)素含量(圖4)。

    2.4.2 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素含量、組成及消化品質(zhì)的影響

    為了進(jìn)一步探究ZmCCoAOMT1突變對木質(zhì)素組分的影響,對突變體和野生型的ADL、ADF、NDF、IVDMD和木質(zhì)素單體等關(guān)鍵成分進(jìn)行比較,結(jié)果如圖5和表2所示。與野生型相比,突變體莖稈中木質(zhì)素含量顯著降低,ADF和NDF略微下降,消化率提高了6.8%。木質(zhì)素單體中G型含量下降4.9%,S型含量下降18.8%,H型因峰圖出現(xiàn)干擾而造成數(shù)據(jù)波動較大。上述結(jié)果表明,ZmCCoAOMT1 基因的突變會降低木質(zhì)素含量并提高消化率,G型和S型木質(zhì)素顯著下降。

    2.5ZmCCoAOMT 基因表達(dá)量分析

    為了探究ZmCCoAOMT1 基因突變是否會對該家族其他基因表達(dá)造成影響,在V9期和吐絲期利用qRT-PCR 檢測ZmCCoAOMT1、ZmCCoAOMT2、ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4 基因在莖中的表達(dá)量。結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn),在V9 期ccoaomt1 突變體中,ZmCCoAOMT1 表達(dá)量呈顯著下降,ZmCCoAOMT2 略微上升,ZmCCoAOMT3 略微下降,ZmCCoAOMT4 略微上升;在吐絲時期ccoaomt1突變體中,ZmCCoAOMT1 基因表達(dá)量呈極顯著下降,ZmCCoAOMT2 呈極顯著上升,ZmCCoAOMT3略微上升,ZmCCoAOMT4略微下降。上述結(jié)果說明ZmCCoAOMT2對ZmCCoAOMT1基因可能存在補償效應(yīng)。

    2.6 野生型和ccoaomt1 突變體在V9 時期和吐絲期的轉(zhuǎn)錄組分析

    2.6.1 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗證

    為了驗證轉(zhuǎn)錄組分析中RNA-seq 結(jié)果的準(zhǔn)確性,利用qRT-PCR對隨機挑選15個差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量分析驗證。結(jié)果表明,qRT-PCR的表達(dá)量結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果一致(圖7A),兩種方法檢測的結(jié)果之間相關(guān)系數(shù)(r)為0.934 9(圖7B),驗證了RNA-Seq分析結(jié)果的可靠性。

    2.6.2 差異表達(dá)基因分析

    對V9期和吐絲期的野生型和ccoaomt1 突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,經(jīng)過測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在V9時期一共篩選出3 976 個DEGs,其中有1 637 個基因上調(diào),2 339 個基因下調(diào);在吐絲時期一共篩選出2 542個DEGs,其中有904個基因上調(diào),1 638個基因下調(diào)。V9時期和吐絲時期共同表達(dá)的基因為682個,突變體中同時上調(diào)的基因為258個,同時下調(diào)的基因為424個(圖8)。

    2.6.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG分析

    對顯著的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果如圖9所示。在V9期,GO富集分析DEGs共106個條目,主要富集到脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)錄(DNAtemplatedtranscription) 、細(xì)胞質(zhì)膜(plasmamembrane)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(DNAbindingtranscription factor activity)等類別( 圖9A)。在吐絲期,GO富集分析DEGs共29個條目,主要富集到防御反應(yīng)(defense response)、細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane)、DNA 結(jié)合(DNA binding)等類別(圖9B)。

    2.6.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG分析

    為了進(jìn)一步分析DEGs的功能,對鑒定到的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果(圖10)顯示,在V9 期主要被富集到苯丙烷生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、植物-病原體相互作用(plant?pathogen interaction)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)等相關(guān)的通路(圖10A);在吐絲期主要被富集到谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、脫氧核糖核酸復(fù)制(DNA replication)等相關(guān)的通路(圖10B)。

    2.6.5 木質(zhì)素苯丙烷合成通路相關(guān)基因表達(dá)分析

    根據(jù)KEGG分析結(jié)果,V9期差異表達(dá)基因主要富集到與木質(zhì)素合成代謝通路相關(guān)的苯丙烷生物合成途徑。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),25個與木質(zhì)素合成代謝有關(guān)的基因差異表達(dá),其中4個基因表達(dá)量上調(diào),均為編碼過氧化物酶(peroxidase,POD)基因;21個表達(dá)量下調(diào)基因,其中編碼過氧化物酶基因13個,以及CCR、HCT、CSE 等控制木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因8個(表3)。

    3 討論

    3.1 ZmCCoAOMT1 基因突變影響玉米木質(zhì)素合成和消化率

    咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、咖啡醜輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)和阿魏酸5-羥基化酶(F5H)是參與調(diào)節(jié)植物木質(zhì)素特異生物合成的3 類主要酶類。Fornalé 等[19]發(fā)現(xiàn),ZmCCoAOMT1的突變會引起突變體的株高略微下降,但沒有引起顯著性差異,葉中脈未出現(xiàn)褐色顯色變化。本研究發(fā)現(xiàn),和野生型相比,ccoaomt1 突變體株高和穗位高略微增加但并沒有發(fā)生顯著改變,葉中脈無褐色顯色反應(yīng),與上述結(jié)論一致。木質(zhì)素是制約動物消化的關(guān)鍵因素,利用酸性間苯三酚(wiesner試劑)染色觀察莖部的木質(zhì)化部位,莖部維管束染色略有降低,且靠近維管束內(nèi)部紅色較深,維管束鞘顏色較淺,說明ZmCCoAOMT1基因的突變會造成莖稈中次生細(xì)胞壁的木質(zhì)化程度降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),突變體中木質(zhì)素總含量極顯著降低,G型和S型木質(zhì)素單體含量都有下降趨勢,但未達(dá)到極顯著水平,且體外干物質(zhì)消化率略有提高。木質(zhì)素合成通路中,CCoAOMT 基因編碼的酶是主要控制向G型木質(zhì)素單體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶,而本研究中G、S型木質(zhì)素單體含量變化差異未達(dá)到極顯著水平,在Fornalé 等[19] 的研究中發(fā)現(xiàn),ZmCCoAOMT1 基因的敲除對木質(zhì)素總量和單體含量均未造成明顯改變,推測可能是由于ZmCCoAOMT 蛋白家族的其他成員在ZmCCoAOMT1 基因突變后維持了部分甲基轉(zhuǎn)移酶的豐度。

    3.2 ZmCCoAOMT2 對ZmCCoAOMT1 基因表達(dá)存在補償效應(yīng)

    利用qRT-PCR 對突變體和野生型ZmCCoAOMT 家族4 個基因在V9 和吐絲期的表達(dá)量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)V9 期和吐絲期突變體中ZmCCoAOMT1 表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢,ZmCCoAOMT2 的表達(dá)量增加,ZmCCoAOMT3 和ZmCCoAOMT4 在2個時期之間變化趨勢不同,且均未達(dá)到顯著水平。RNA-seq 結(jié)果顯示,ZmCCoAOMT2 在V9 期和吐絲期的表達(dá)量增高,盡管表達(dá)量差異未達(dá)到顯著但趨勢與qRT-PCR結(jié)果相同。通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),在玉米ZmCCoAOMT 基因家族中ZmCCoAOMT1 與ZmCCoAOMT2 之間親緣關(guān)系更近,而ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4 與ZmCCoAOMT1之間關(guān)系較遠(yuǎn)。從表達(dá)模式上可以推測ZmCCoAOMT2 對ZmCCoAOMT1 基因可能存在補償效應(yīng)。

    3.3 ZmCCoAOMT1 對木質(zhì)素合成通路的影響

    對突變體和野生型植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),在V9和吐絲2個時期共同差異表達(dá)的基因共682 個,經(jīng)過GO 富集分析顯示,在V9 期,ZmCCoAOMT1 表達(dá)量變化主要參與調(diào)節(jié)植物的轉(zhuǎn)錄、對環(huán)境脅迫的響應(yīng)以及細(xì)胞膜類的組成等方面;在吐絲期,ZmCCoAOMT1 突變對生物過程(biological process,BP)影響減少,對細(xì)胞組分(cell composition, CC)影響增加。說明該基因在發(fā)育前期可能主要參與調(diào)控植物的轉(zhuǎn)錄激活及對外環(huán)境脅迫的響應(yīng),在后期主要通過調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞組分(CC)來調(diào)控植物生長發(fā)育。

    苯丙烷是包括類黃酮、木質(zhì)素在內(nèi)的一大類植物次級代謝產(chǎn)物的總稱,木質(zhì)素合成途徑屬于苯丙烷代謝途徑的分支[30],KEGG分析顯示,在生育前期差異表達(dá)基因主要富集在苯丙烷代謝通路中, ZmCCoAOMT1 基因的突變可能導(dǎo)致了苯丙烷代謝途徑中若干基因表達(dá)量的變化進(jìn)而引起木質(zhì)素含量甚至單體組成發(fā)生了改變。對比V9期野生型和突變體,富集在苯丙烷代謝途徑中的差異表達(dá)基因中絕大多數(shù)都為下調(diào)表達(dá),與突變體中ZmCCoAOMT1 基因的表達(dá)量變化一致,符合預(yù)期。在苯丙烷代謝途徑中差異表達(dá)基因主要包括若干過氧化物酶基因,其編碼木質(zhì)素生物合成最后一步反應(yīng)的酶,將木質(zhì)素單體催化脫氫后聚合產(chǎn)生大分子木質(zhì)素[31]。由于植物細(xì)胞壁中過氧化物酶存在多種同工酶,其在木質(zhì)素合成過程中具有的多樣化作用對木質(zhì)素合成調(diào)控作用也因單體不同而造成差異[32]。本研究中過氧化物酶基因的下調(diào)表達(dá)可能對突變體中木質(zhì)素總含量和單體含量下降發(fā)揮了作用。除此之外,突變體中位于CCoAOMT 基因上下游的HCT、CSE、CCR 等基因的表達(dá)量也顯著降低,是由于ZmCCoAoMT1 基因的下調(diào)表達(dá)引起產(chǎn)物阿魏酸輔酶A減少后對上下游酶產(chǎn)生的反饋調(diào)節(jié)[33]。這些結(jié)果為進(jìn)一步理解木質(zhì)素合成與代謝提供參考,但還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)論證。

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    (責(zé)任編輯:溫小杰)

    基金項目:國家重點研發(fā)計劃項目(2023YFD1200500)。

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