苦瓜枯萎病抗性生理研究及鑒定評價體系構(gòu)建

凌怡，楊衍，牛玉，于仁波，劉昭華，劉平武，韓旭

摘? ? 要：通過苦瓜枯萎病抗性生理研究，構(gòu)建高效精準(zhǔn)的苦瓜枯萎病抗性鑒定評價體系，旨在為苦瓜抗枯萎病種質(zhì)資源篩選及抗病品種選育提供理論基礎(chǔ)。以熱科2號苦瓜為試驗材料，選用灌根法、胚根法和傷根法在苦瓜2葉1心期接種不同濃度的苦瓜枯萎病菌，分析不同接種時間的病情指數(shù)和生理響應(yīng)的差異情況，以及不同接種方法和接種濃度對病害的影響。結(jié)果表明，采用灌根法接種1×106 個·mL-1的枯萎病菌，在第25天時病情指數(shù)為37.1，顯著低于1×107 個·mL-1、顯著高于1×104 個·mL-1，苯丙氨酸解氨酶活性和葉綠素含量顯著低于胚根法，多酚氧化酶活性與可溶性蛋白含量與胚根法相比無顯著差異。在苦瓜幼苗2葉1心時采用灌根法接種1×106 個·mL-1的枯萎病菌，25 d時鑒定發(fā)病情況，可作為精準(zhǔn)高效鑒定苦瓜枯萎病抗性的體系。

關(guān)鍵詞：苦瓜；枯萎?。徊∏橹笖?shù)；抗性生理；鑒定評價技術(shù)

中圖分類號：S642.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-069-10

Resistance physiological study and evaluation system establishment on Fusarium wilt of bitter gourd

LING Yi1， 2， YANG Yan2， NIU Yu2， YU Renbo2， LIU Zhaohua2， LIU Pingwu1， HAN Xu2

（1. College of Tropical Agroforestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， Hainan， China）

Abstract： Through the study of bitter gourd Fusarium wilt resistance physiology， the authors have constructed an efficient and precise identification and evaluation system for bitter gourd Fusarium wilt resistance， aiming to provide a theoretical basis for the screening and evaluation of Fusarium-resistant germplasm resources and the selection and breeding of disease-resistant varieties. In this study， Reke No. 2 bitter gourd was used as the test material， and selected the root irrigation， radicle root and injure root methods to inoculate different concentrations of Fusarium wilt fungus liquid at the time of two-leaf and one heart of bitter gourd， and investigated the effects of different inoculation methods and inoculation concentrations on the Fusarium wilt by analyzing the differences in disease index and physiological responses at different inoculation times. The results showed that the disease index was 37.1 using the root irrigation inoculated fungus with 1×106·mL-1 at 25 d， which was significantly lower than that of 1×107·mL-1， and significantly higher than that of 1×104 ·mL-1. PAL activity and chlorophyll content were significantly lower than the radicle method， and no significant difference existed between PPO activity and soluble protein content. When bitter gourd seedlings of two-leaf and one heart were inoculated with 1×106·mL-1 fungus using the root irrigation method， the disease incidence was identified at 25 d， which can serve as an accurate and efficient identification system of bitter gourd Fusarium wilt resistance.

Key words： Bitter gourd; Fusarium wilt; Disease index; Resistance physiology; Identification and evaluation technology

苦瓜（Momordica charantia L.）屬葫蘆科苦瓜屬植物，是重要的食藥同源蔬菜作物，亦是海南省冬種北運(yùn)的主要蔬菜作物，占據(jù)著冬季蔬菜市場的重要份額[1]?？喙峡菸∈怯杉怄哏牭毒喙蠈；停‵usarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一種嚴(yán)重影響苦瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的土傳病害，在任何生育期均能侵染并造成危害，嚴(yán)重時可引起整株萎蔫死亡[2]。隨著復(fù)種指數(shù)的逐年增加，苦瓜枯萎病日益加劇，嚴(yán)重制約著苦瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]?？喙峡菸【谕寥乐械拇婊盍椭虏×^強(qiáng)，難防難治，選育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，而高效精準(zhǔn)的鑒定評價技術(shù)體系是抗病品種選育的重要基礎(chǔ)。近年來有關(guān)瓜類作物枯萎病抗性鑒定評價的研究多集中在黃瓜和西瓜上，關(guān)于苦瓜枯萎病抗性鑒定技術(shù)的研究鮮有報道[4]，目前仍未形成精準(zhǔn)完善的高效鑒定評價技術(shù)體系。尖孢鐮刀菌常用的接種方法有灌根法、胚根法、傷根法、蘸根法、浸根法等[5]。左存武等[6]用浸根法和灌根法將Foc TR4接種不同抗性的香蕉品種，比較分析接種后香蕉的發(fā)病情況，結(jié)果表明，灌根法的接種效果最好，接種后各品種發(fā)病情況與品種本身的實際抗性最為接近。種質(zhì)來源、環(huán)境條件、接種方法、接種濃度、鑒定時間等均能影響苦瓜枯萎病的抗性鑒定，因此，制定簡單、高效、統(tǒng)一的鑒定評價技術(shù)方案是解決這一問題的重要手段。筆者以中抗枯萎病品種熱科2號苦瓜為試驗材料，采用不同接種方法、不同菌液濃度、不同鑒定時間等方法研究苦瓜枯萎病的抗性生理機(jī)制，綜合分析病情指數(shù)、根系形態(tài)及各項生理指標(biāo)等，構(gòu)建高效精準(zhǔn)的鑒定評價技術(shù)體系，為提高苦瓜種質(zhì)枯萎病鑒定評價效率和精準(zhǔn)度及抗病品種選育提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

苦瓜品種熱科2號是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所自主選育的中抗枯萎病品種。

供試病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌4501（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae），由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所陳振東研究員提供。

1.2 方法

試驗于2023年6－7月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所植物培養(yǎng)室及抗逆生理與分子生物學(xué)實驗室完成。

1.2.1 浸種催芽 供試苦瓜種子浸泡于55 ℃溫水中8 h，用濕潤的4層紗布包裹種子，放置在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，種子露白待用。

1.2.2 枯萎病菌菌液的制備 試驗以清水為對照（CK），以不同孢子濃度（1×104、1×105、1×106、1×107個·mL-1）的尖孢鐮刀菌4501為處理。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上接種尖孢鐮刀菌4501，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，使用打孔器取直徑7 mm的尖孢鐮刀菌菌餅接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）中，在溫度為28 ℃、120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)7 d，然后用雙層紗布過濾菌絲，留母液待用。

1.2.3 接種方法 為提高鑒定評價的精準(zhǔn)度，所有試驗均在人工培養(yǎng)室中進(jìn)行，室內(nèi)溫度保持在（28±1） ℃，濕度80%，光照度2500 lx。分別對灌根法、胚根法和傷根法3種接種方法的病情指數(shù)和抗病等級進(jìn)行鑒定，篩選適宜的接種方法。

灌根法：將露白的苦瓜種子播種于裝滿滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽（7 cm×7 cm）中，置于塑料托盤內(nèi)（每個托盤放21個營養(yǎng)缽），每隔2 d在托盤中加入500 mL水以保證基質(zhì)濕潤。待苦瓜幼苗生長至2葉1心時采用灌根法接種枯萎病菌[7]，在距根際1 cm處用注射器注入20 mL菌液，菌液中分生孢子濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107 個·mL-1，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每次重復(fù)63株幼苗，共252株苗。

胚根法：種子露白后待胚根長至1 cm時采用胚根法接種枯萎病菌[8]，將種子浸泡在菌液中1 h，菌液中分生孢子濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107 個·mL-1，后將種子播于裝滿無菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，并置于塑料托盤內(nèi)，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每次重復(fù)63株幼苗，共252株苗。

傷根法：將露白的苦瓜種子播種于裝滿滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，并置于塑料托盤內(nèi)，當(dāng)幼苗長至2葉1心時采用傷根法接種枯萎病菌[9]，將幼苗根部基質(zhì)洗凈，剪掉根的三分之一，在孢子懸浮液中浸泡30 min，菌液中分生孢子濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107 個·mL-1，后將幼苗重新移栽至無菌基質(zhì)中，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每次重復(fù)63株幼苗，共252株苗。

1.2.4 測定指標(biāo)與方法 選擇2種適宜的接種方法，分別于接種后0、5、10、15、20和25 d采集根系和同一葉位（第1、2片真葉）的葉片樣品，每個處理隨機(jī)取9株，設(shè)3次重復(fù)，根系樣品拍照用以分析根系形態(tài)，葉片用錫紙包裹迅速轉(zhuǎn)移至液氮中速凍，取樣完成后將葉片樣品儲存于-80 ℃超低溫冰箱中，待測各項生理指標(biāo)。采用胚根法接種菌液的植株在0 d時還處于種子階段，因此在0 d時無法進(jìn)行葉片取樣。

取0.2 g苦瓜葉片樣品放置于已預(yù)冷的研缽中，隨后加入1 mL pH=7.8的磷酸緩沖液，在冰浴條件下將其研磨成勻漿，然后使用磷酸緩沖液沖洗研缽及研磨棒，將其倒入勻漿中，使總體積為10 mL。將樣品在4 ℃條件下進(jìn)行10 000 r·min-1的離心操作，離心20 min后得到上清液，上清液作為苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）以及可溶性蛋白質(zhì)的提取液。參照鄒芳斌等[10]的方法測定PAL活性，參照鄭蓮姬等[11]的方法測定PPO活性，參照王鳳婷等[12]的方法測定葉綠素含量，參照青格爾等[13]的方法測定可溶性蛋白含量。

采用萬深LA-S系列植物圖像根系分析系統(tǒng)對根系形態(tài)進(jìn)行分析。

1.3 抗病分級標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)（DI）=Σ（病株數(shù)×該級代表值）/（總株數(shù)×最高級代表值）×100。

參考南宇航等[14]的鑒定方法，調(diào)查病情指數(shù)，植株被定為0～5級：0級，無病癥；1級，子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫；2級，1片真葉萎蔫或子葉較重萎（≤60%）；3級，子葉及部分真葉萎蔫（＞60%）；4級，整株萎蔫，60%以上枯死，但心葉仍成活；5級，整株枯死?？喙峡菸〔∏榉旨壴斠妶D1。

抗性分級標(biāo)準(zhǔn)：高抗（HR）：DI＜10；抗?。≧）：10≤DI＜30；中抗（MR）：30≤DI＜50；感?。⊿）：50≤DI＜70；高感（HS）：DI≥70。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，利用SPSS26軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜枯萎病病情指數(shù)的影響

如表1所示，不同接種方法和菌液濃度對苦瓜枯萎病發(fā)病情況的影響不同。灌根法接種的苦瓜幼苗病情指數(shù)隨著菌液濃度的增加而提高，且菌液濃度為1×105和1×106 個·mL-1的處理間無顯著差異，抗病等級分別為R、MR、MR、S；胚根法各菌液濃度間病情指數(shù)無顯著差異，抗病等級均為MR；傷根法菌液濃度為1×104個·mL-1時病情指數(shù)顯著低于菌液濃度為1×105、1×106、1×107 個·mL-1的處理，抗病等級分別為S、HS、HS、HS。不同接種方法及不同菌液濃度均不同程度影響苦瓜對枯萎病的抗性表型。采用傷根法接種苦瓜枯萎病菌病情指數(shù)過高，抗病等級為感病或高感，無法準(zhǔn)確鑒定出品種抗性。為保證苦瓜枯萎病抗性鑒定評價體系的精準(zhǔn)性，筆者選擇灌根法及胚根法進(jìn)行下一步研究。

2.2 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜葉片苯丙氨酸解氨酶活性的影響

如圖2所示，灌根法接種不同濃度枯萎病菌后的苦瓜葉片PAL活性呈不同的變化趨勢，接種后25 d時，菌液濃度為1×106 個·mL-1的處理苦瓜葉片及未接菌處理的苦瓜葉片PAL活性顯著低于其他處理。胚根法接種不同濃度枯萎病菌后的苦瓜葉片PAL活性呈不同的變化趨勢，接種25 d時未接菌處理的苦瓜葉片PAL活性低于接菌處理。采用胚根法接種濃度為1×105和1×106 個·mL-1的枯萎病菌菌液分別在20和25 d時，苦瓜葉片PAL活性顯著高于灌根法，而接種菌液濃度為1×107 個·mL-1在25 d時顯著低于灌根法。

2.3 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜葉片多酚氧化酶活性的影響

灌根法和胚根法接種不同濃度枯萎病菌后的苦瓜葉片PPO活性表現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖3）。灌根法接種后20 d各菌液濃度處理間PPO活性無顯著差異，第25天時各菌液濃度處理間PPO活性高于未接菌處理，僅1×107 個·mL-1處理與CK呈顯著差異。胚根法接種后20 d，菌液濃度為1×106 個·mL-1的處理葉片PPO活性顯著高于其他菌液濃度及未接菌處理，接種后25 d各菌液濃度處理間PPO活性無顯著差異。菌液濃度為1×106 個·mL-1的處理接種后20 d，胚根法的葉片PPO活性顯著高于灌根法。胚根法及灌根法接種不同濃度菌液25 d的苦瓜葉片PPO活性無顯著差異。

2.4 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜葉片葉綠素含量的影響

灌根法接種不同濃度枯萎病菌后的苦瓜葉片葉綠素含量在0～5 d無顯著差異，15～25 d未接菌處理的葉片葉綠素含量顯著高于接菌處理（圖4）。灌根法接種后20 d，菌液濃度為1×104 個·mL-1的處理苦瓜葉片葉綠素含量顯著高于其他接菌處理，接種后25 d，菌液濃度為1×107 個·mL-1的處理葉綠素含量低于其他菌液濃度處理。胚根法接種后20和25 d，未接菌處理的葉片葉綠素含量高于接菌處理；接種20 d后，菌液濃度為1×104 個·mL-1處理的苦瓜葉片葉綠素含量顯著高于其他菌液濃度處理，接種25 d，菌液濃度為1×106 個·mL-1處理的苦瓜葉片葉綠素含量顯著高于菌液濃度為1×104、1×107 個·mL-1的處理。菌液濃度為1×104、1×107 個·mL-1的處理接種后20 d，灌根法的葉片葉綠素含量極顯著或顯著低于胚根法，而菌液濃度為1×105 個·mL-1的處理，灌根法顯著高于胚根法。采用灌根法接種濃度為1×105、1×106、1×107 個·mL-1的處理接種后25 d，苦瓜葉片葉綠素含量極顯著或顯著低于胚根法。

2.5 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜葉片可溶性蛋白含量的影響

如圖5所示，灌根法接種不同濃度枯萎病菌后的苦瓜葉片可溶性蛋白含量呈不同的變化趨勢，接種20 d時各處理間無顯著差異，25 d時接菌濃度為1×104 個·mL-1的葉片可溶性蛋白含量顯著低于其他接菌濃度。胚根法接菌20 d的苦瓜葉片，接菌濃度為1×106 個·mL-1處理的葉片可溶性蛋白含量顯著高于CK和其他接菌濃度，25 d時葉片可溶性蛋白含量隨接菌濃度的增加而降低，CK顯著高于接菌處理。采用灌根法接種20 d，接菌濃度分別為1×105、1×106、1×107 個·mL-1處理的苦瓜葉片可溶性蛋白含量均極顯著或顯著低于胚根法。接種25 d，灌根法接菌濃度分別為1×104、1×105、1×107 個·mL-1處理的苦瓜葉片可溶性蛋白含量均極顯著或顯著低于胚根法。

2.6 不同接種方法及菌液濃度對苦瓜根系形態(tài)的影響

如表2所示，灌根法接種枯萎病菌的苦瓜根系長度隨菌液濃度增加呈下降趨勢，表面積和體積無顯著差異，菌液濃度為1×106 個·mL-1處理的根尖數(shù)及分叉數(shù)顯著低于其他處理。胚根法接種枯萎病菌在菌液濃度為1×105、1×106 、1×107 個·mL-1處理的根系長度顯著低于1×104個·mL-1的處理，表面積和體積無顯著差異，根尖數(shù)及分叉數(shù)隨著菌液濃度的增加呈降低趨勢。從對照以及灌根法、胚根法不同接菌濃度處理的根系形態(tài)圖（圖6）可以看出，隨著接菌濃度的升高，植株受枯萎病菌侵染程度加重，根系生長受到的影響也加重。

3 討論與結(jié)論

不同接種方法、菌液濃度、鑒定時間等均會影響抗性鑒定的準(zhǔn)確性[15]。筆者采用3種不同方法接種不同濃度的苦瓜枯萎病菌，通過病情指數(shù)篩選出最適宜的接種方法。經(jīng)比較分析，筆者認(rèn)為適用于鑒定苦瓜枯萎病的接種方法依次為灌根法、胚根法、傷根法。在3種不同接種方法中，灌根法接種枯萎病菌的優(yōu)點是發(fā)病整齊且有規(guī)律性，易于鑒定植株枯萎病抗性等級。胚根法接種枯萎病菌可能由于在菌液浸種時胚根吸收的菌液不足，以致苦瓜植株發(fā)病或胚根法本身致病力弱、發(fā)病率低，品種未表現(xiàn)出應(yīng)有抗性，不同接菌濃度間病情指數(shù)無顯著差異，難以準(zhǔn)確判斷枯萎病侵染程度，不利于對苦瓜植株抗性進(jìn)行分級。傷根法可能由于在接種菌液過程中進(jìn)行了傷根處理導(dǎo)致根系損傷，使苦瓜植株受枯萎病菌的影響發(fā)病程度較重，從而導(dǎo)致病情指數(shù)過高且死苗過多，難以進(jìn)行抗性分級，不利于篩選精準(zhǔn)的鑒定評價體系。因此，筆者認(rèn)為灌根法是最適用于接種苦瓜枯萎病菌進(jìn)行抗病性鑒定的接種方法。

接種濃度過低會導(dǎo)致發(fā)病率低，抗性種質(zhì)假陽性現(xiàn)象增加，病情潛伏期長，導(dǎo)致鑒定周期延長，影響鑒定效率[16]；接種濃度過高，無法進(jìn)行病情分級和篩選出抗性種質(zhì)[17]。筆者采用4種不同接菌濃度對苦瓜進(jìn)行枯萎病菌的接種，菌液濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107 個·mL-1，經(jīng)比較分析，認(rèn)為采用菌液濃度為1×106 個·mL-1對苦瓜進(jìn)行枯萎病菌的接種為最適濃度，選用灌根法接種1×106 個·mL-1的枯萎病菌的植株，病情指數(shù)顯著低于接種1×107 個·mL-1枯萎病菌的植株，但顯著高于接種1×104 個·mL-1枯萎病菌的植株。采用適當(dāng)濃度接種枯萎病菌有利于提高苦瓜枯萎病抗性鑒定的準(zhǔn)確性。這與前人研究結(jié)果一致，楊凡等[18]研究認(rèn)為當(dāng)病原菌孢子最適接種濃度為1×106個·mL-1時，能夠有效區(qū)分黃瓜枯萎病抗感性差異。

苯丙氨酸解氨酶活性在植物抗病、抗蟲、抗逆境脅迫等方面起重要作用[19]。在本研究中，采用灌根法接種濃度為1×106 個·mL-1枯萎病菌的處理，接種25 d的苦瓜葉片PAL活性顯著低于菌液濃度為1×107 個·mL-1的處理?？喙嫌酌缭馐芸菸〔≡秩竞?，葉片中PAL活性隨著枯萎病發(fā)病率升高呈先上升后下降再上升的變化趨勢，說明PAL具有抵御枯萎病菌的作用。這與關(guān)峰等[20]研究結(jié)果相似，該結(jié)果表明，在枯萎病菌脅迫下，苦瓜葉片中的PAL活性隨著接種時間的延長呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，較對照PAL活性均有大幅升高，且抗病品種PAL活性顯著高于感病品種。PAL在苯丙烷代謝途徑中起重要作用，使植物對逆境或細(xì)胞組織衰老做出應(yīng)激反應(yīng)，其活性與植物抗病性呈正相關(guān)[21]。

多酚氧化酶活性可作為植物抗病能力的生理指標(biāo)。在本研究中，灌根法接種枯萎病菌25 d的苦瓜葉片PPO活性略高于胚根法。葉片中PPO活性在枯萎病菌的脅迫下，呈先下降再升高的趨勢。本研究結(jié)果與前人一致，趙秀娟等[22]研究結(jié)果表明，接種后植株莖基部PPO活性均呈明顯升高的趨勢，感病自交系葉片PPO活性顯著高于未接種對照。在苦瓜植株受到枯萎病菌脅迫時葉片防御酶系統(tǒng)啟動，酶活性升高，隨著侵染的加劇，超出了防御酶的清除能力時，酶活性下降。

葉綠素是植物中非常重要的色素，當(dāng)病原菌入侵植物后，往往導(dǎo)致葉綠體解體，影響葉綠體的生物合成，出現(xiàn)葉片褪綠、黃化或花葉等癥狀，從而引起葉綠素含量降低[23]。葉綠素含量的高低往往能客觀反映植物抗病性的強(qiáng)弱[24]。隨著枯萎病菌對植株侵染程度的加重，葉片萎蔫，葉綠素含量也隨之降低。本研究中枯萎病菌液濃度為1×104、1×105、1×107 個·mL-1 3個處理接種后20 d，胚根法接種的葉片葉綠素含量顯著高于灌根法；25 d的葉綠素含量灌根法則低于胚根法。

在植物生長發(fā)育過程中可溶性蛋白含量會發(fā)生變化，當(dāng)植物組織受外界侵染時可溶性蛋白含量也會隨之變化[25]。本研究結(jié)果表明，胚根法接種枯萎病菌20和25 d的葉片可溶性蛋白含量高于灌根法。灌根法致病力強(qiáng)于胚根法，葉片受枯萎病菌侵染程度高，枯萎病菌的侵染影響了葉片的可溶性蛋白含量，隨著枯萎病病原菌對苦瓜幼苗的侵染，葉片中可溶性蛋白含量呈下降趨勢。吳美艷等[26]研究表明，木薯苗期接種病原菌葉片的可溶性蛋白含量較不接菌對照呈下降趨勢，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，筆者認(rèn)為在苦瓜2葉1心時采用灌根法接種濃度為1×106 個·mL-1的苦瓜枯萎病菌的孢子懸浮液20 mL，接菌后25 d進(jìn)行苦瓜枯萎病抗病性鑒定，是精準(zhǔn)高效的枯萎病抗性鑒定評價技術(shù)體系。

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