蜜環(huán)菌菌株DJ1的分子鑒定、生物學(xué)特性及人工培養(yǎng)

史雪葉，朱國(guó)勝，黃萬(wàn)兵，李裕榮，陳之林，付少彬

摘? ? 要：為優(yōu)化蜜環(huán)菌的人工培養(yǎng)條件，以蜜環(huán)菌菌株DJ1為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定并通過(guò)生物學(xué)特性觀察，篩選其最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，通過(guò)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌株DJ1屬于高盧蜜環(huán)菌Armillaria gallica。DJ1生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基+木屑100 g，麩皮5 g，水1 L，pH=6，培養(yǎng)溫度23 ℃。出菇結(jié)果表明，在PDA+2%/4%/6%/8%玉米面培養(yǎng)基與木屑培養(yǎng)基中均可得到子實(shí)體，其中以添加4%玉米面的培養(yǎng)基出菇效果最好，出菇時(shí)間最快；隨著玉米面添加量的增加，蜜環(huán)菌子實(shí)體的出菇率呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。研究結(jié)果可為蜜環(huán)菌的快速培育和人工馴化提供參考。

關(guān)鍵詞：蜜環(huán)菌屬；食藥用菌；生物學(xué)特性；人工馴化

中圖分類號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）06-079-09

Molecular identification， biological characteristics and artificial cultivation of Armillaria strain DJ1

SHI Xueye1， 2， ZHU Guosheng3， HUANG Wanbing3， LI Yurong2， CHEN Zhilin2， FU Shaobin1

（1. Department of Pharmacy， Zunyi Medical University， Zunyi 563000， Guizhou， China; 2. Horticultural Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550006， Guizhou， China; 3. Guizhou Institute of Crop Germplasm Resources， Guiyang 550006， Guizhou， China）

Abstract： To optimize the artificial culture conditions of Armillaria， using the Armillaria strain DJ1 as the research object， the author conducted molecular identification and biological characteristics observation to select the optimal medium and culture conditions. The results revealed that the phylogenetic tree constructed based on the ITS sequence indicated that the strain DJ1 belongs to Armillaria gallica. The optimal culture conditions for DJ1 growth were PDA medium with sawdust 100 g， bran 5 g， water 1 L， pH=6， and cultivation temperature of 23 °C. The results of mushroom emergence showed that fruiting bodies could be obtained in PDA + 2%/4%/6%/8% cornmeal medium and sawdust medium. Among them， the medium with 4% cornmeal had the best mushroom production effect and the fastest mushroom emergence time. With the increase of cornmeal addition， the mushroom yield of the fruiting bodies of Armillaria increased first and then decreased. The results of this study can provide a reference for the rapid cultivation and artificial domestication of Armillaria.

Key words： Armillaria; Edible and medicinal mushrooms; Biological characteristics; Artificial domestication

蜜環(huán)菌屬真菌Armillaria （Fr.） Staude隸屬擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、傘菌目Agaricales、泡頭菌科Physalacriaceae [1]，是中藥材天麻與豬苓的必需共生菌[2-3]。此外，蜜環(huán)菌還可導(dǎo)致樹(shù)木的局部腐朽，是多種林木的致病菌，嚴(yán)重者甚至使樹(shù)木死亡[4-5]。蜜環(huán)菌子實(shí)體俗稱榛蘑，廣泛分布在溫帶到熱帶地區(qū)，味道鮮美，具有高蛋白、高粗纖維和低脂肪等特性[6-7]，是人們追求健康飲食的理想食品，經(jīng)常食用可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，被人們譽(yù)為“東北第四寶”。蜜環(huán)菌具有較高的藥用價(jià)值，子實(shí)體、菌絲、菌索都可以入藥，具有降血糖[8]、保護(hù)腦[9]、增強(qiáng)免疫[10]、抗菌消炎[11]、抗真菌[12]和抗病毒[13]等藥理作用。

貴州省擁有豐富的食用真菌和藥用真菌資源，野生食用菌種類在全國(guó)的80%以上，近年來(lái)貴州食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度較快[14-16]，但部分大型真菌依舊沒(méi)有實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)的完全馴化。目前，榛蘑生產(chǎn)主要依靠林地自然發(fā)生和人工無(wú)序采摘的方式，野生榛蘑自然產(chǎn)量較低且無(wú)序采摘導(dǎo)致其野生資源減少，野生資源的供應(yīng)又受到季節(jié)和地域的影響，使榛蘑價(jià)格居高不下[17]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)蜜環(huán)菌的研究多集中在活性成分、藥理作用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等方面[18]，對(duì)子實(shí)體的馴化栽培只有零星報(bào)道。目前的栽培研究大多是仿野生或者在野生生境下播種，利用自然的溫度、濕度等環(huán)境條件進(jìn)行生長(zhǎng)，但生產(chǎn)效益尚未達(dá)到理想水平，此項(xiàng)技術(shù)仍有待于深入研究[19-22]。蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程較復(fù)雜，子實(shí)體的形成需要低溫、光照和濕度等環(huán)境因素協(xié)同作用[23-24]，目前尚未實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。為更有效地利用蜜環(huán)菌資源，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，有必要加強(qiáng)對(duì)蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)技術(shù)的研究，筆者通過(guò)對(duì)貴州地區(qū)一種蜜環(huán)菌屬真菌進(jìn)行生物學(xué)鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，旨在為蜜環(huán)菌的快速培育和開(kāi)發(fā)利用提供關(guān)鍵的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1? ? 供試菌株? ? 蜜環(huán)菌菌株DJ1由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提供。

1.1.2? ? 供試培養(yǎng)基和栽培培養(yǎng)基? ? 供試培養(yǎng)基有6種，1號(hào)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然）；2號(hào)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基+木屑100 g，麩皮100 g，水1 L，pH自然；3號(hào)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米面30 g，瓊脂15 g，水1 L[25]，pH自然；4號(hào)培養(yǎng)基：木屑100 g，麩皮100 g，葡萄糖20 g，牛肉膏5 g，瓊脂15 g，水1 L[26]，pH自然。碳源培養(yǎng)基：2號(hào)培養(yǎng)基（不含葡萄糖）+4種碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米面）20 g，pH=6。氮源培養(yǎng)基：2號(hào)培養(yǎng)基（不含麩皮）+4種氮源（牛肉膏、酵母粉、麩皮、蛋白胨）5 g，pH=6。

栽培培養(yǎng)基有2種，玉米面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基+0%/2%/4%/6%/8%/0%玉米面，水1 L；木屑培養(yǎng)基：木屑與玉米面質(zhì)量比1∶0或1∶1，麩皮質(zhì)量=蔗糖質(zhì)量=1/10木屑質(zhì)量，含水量65%左右。

1.2 方法

1.2.1? ? 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的繪制? ? 供試菌株DNA基因的提取與擴(kuò)增：供試菌株活化后，取出菌絲，清除培養(yǎng)基后，用液氮速凍，磨成粉狀，DNA提取按照真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用真菌通用引物ITS1和ITS4（引物序列如表1）對(duì)菌株的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系共25 ?L，正反引物各1 μL，ddH2O為9.5 ?L。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將其擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的繪制：將測(cè)序序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線BLAST分析。使用MEGA 11軟件構(gòu)建鄰接樹(shù)，建樹(shù)時(shí)采用Maximum Composite Likelihood模型，經(jīng)Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可靠性。

1.2.2? ? 最優(yōu)培養(yǎng)基的篩選? ? 在1～4號(hào)培養(yǎng)基中分別接入菌株DJ1，每處理重復(fù)3次。接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，觀察菌株在4種培養(yǎng)基上菌索的生長(zhǎng)特性。

1.2.3? ? 不同pH對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響? ? 使用1 mol·L-1 NaOH和1 mol·L-1 HCl分別調(diào)節(jié)2號(hào)培養(yǎng)基不同的pH梯度（5、6、7、8、9），采用平板培養(yǎng)法將1 cm3菌塊接種于平板，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，采用十字交叉法，自接種之日起定時(shí)劃線測(cè)量（接種與測(cè)量方法下同）。

1.2.4? ? 不同溫度對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響? ? 調(diào)節(jié)2號(hào)培養(yǎng)基pH=6，接種菌株DJ1后分別置于不同溫度（13、18、23、28、33 ℃）下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5? ? 不同碳氮源配方對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響? ? 為繼續(xù)優(yōu)化菌株DJ1的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，分別設(shè)置在不同碳源、氮源的培養(yǎng)基上接種菌株DJ1，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，調(diào)節(jié)pH=6，置于23 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，以不加碳源、氮源為對(duì)照。

以上試驗(yàn)均于2022年春夏兩季在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.6? ? 菌株DJ1子實(shí)體的馴化栽培? ? 試驗(yàn)于2022年8月在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將玉米面培養(yǎng)基分別裝入三角瓶（250 mL）中，裝量150 mL，高壓滅菌30 min，冷卻后接種菌株DJ1，每處理3次重復(fù)，培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)25～30 d，然后轉(zhuǎn)入白天溫度22 ℃、晚上溫度16 ℃、12 h散射光環(huán)境中培養(yǎng)出菇。

將木屑栽培料裝入培養(yǎng)瓶（850 mL聚乙烯瓶），裝量1/2，高壓滅菌35 min，冷卻后接種菌株DJ1，每處理3次重復(fù)，培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)30 d至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)15 d，待菌絲充分后熟后，轉(zhuǎn)入白天溫度22 ℃，晚上溫度16 ℃，12 h散射光環(huán)境中培養(yǎng)出菇。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Adobe Photoshop 2021軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，菌株DJ1與參考序列OL411636 Armillaria gallica聚為1支，相似度為99%，覆蓋率100%。

2.2 最優(yōu)培養(yǎng)基的篩選

通過(guò)觀察記錄菌株DJ1在4種培養(yǎng)基上的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基為2號(hào)培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上菌株DJ1菌索長(zhǎng)勢(shì)良好、粗壯，菌索萌動(dòng)早，且長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)間短（表2、圖2）。

2.3 不同pH對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響

由表3、圖3可知，菌株DJ1在pH=5～9處理下均生長(zhǎng)良好，各處理組的菌索生長(zhǎng)量與粗細(xì)程度均無(wú)顯著差異，其中以pH=6菌索生長(zhǎng)最快且最粗壯。

2.4 不同溫度對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響

由表4、圖4可知，菌株DJ1在不同溫度培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況有較大差異，在33 ℃高溫培養(yǎng)下僅見(jiàn)少量白色菌絲萌發(fā)，后停止生長(zhǎng)；在13～28 ℃培養(yǎng)條件下均可生長(zhǎng)，其中在23 ℃培養(yǎng)下長(zhǎng)勢(shì)最好，生長(zhǎng)量最大，當(dāng)溫度低于18 ℃或高于28 ℃時(shí)菌索生長(zhǎng)速度緩慢。

2.5 不同碳氮源配方對(duì)菌株DJ1菌索生長(zhǎng)的影響

由表5、圖5、圖6可知，菌株DJ1在對(duì)碳源的利用中，加入葡萄糖、蔗糖和麥芽糖與不加碳源（CK）相比，均提高了菌索生長(zhǎng)量，但差異不顯著，菌索粗壯程度均優(yōu)于CK，其中以對(duì)葡萄糖的利用最佳，而菌株DJ1對(duì)玉米面的利用最差，菌索生長(zhǎng)量和菌索粗壯程度均低于CK。在對(duì)氮源的利用中，菌株DJ1對(duì)4種氮源的利用與不加氮源（CK）相比，菌索生長(zhǎng)量和粗壯程度均無(wú)顯著差異，其中以對(duì)麩皮的利用最佳。

綜上所述，菌株DJ1經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：PDA培養(yǎng)基+木屑100 g，麩皮5 g，水1 L，pH=6，溫度23 ℃。

2.6 菌株DJ1的馴化培養(yǎng)及生長(zhǎng)各時(shí)期的形態(tài)觀察

由表6、圖7可知，在不添加玉米面的2種栽培培養(yǎng)基中未見(jiàn)原基及子實(shí)體形成，而添加一定量玉米面的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)溫差和光照等刺激后，一些菌落開(kāi)始向子實(shí)體原基分化，在2種栽培培養(yǎng)基表面均可以觀察到其表層有很多氣生菌絲，但只有小部分氣生菌絲可以扭結(jié)形成原基，大部分菌落只停留在菌落堆狀態(tài)，沒(méi)有再進(jìn)一步分化為原基。其中在玉米面培養(yǎng)基中，菌株DJ1在PDA+0%、2%、4%、6%、8%、10%玉米面含量下的菌索生長(zhǎng)量無(wú)顯著差異，以在PDA+4%玉米面培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快。除未添加玉米面的培養(yǎng)基與添加10%玉米面的培養(yǎng)基未出菇外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培養(yǎng)基均有子實(shí)體出現(xiàn)，以添加4%玉米面的培養(yǎng)基出菇效果最好，出菇最快，其次是添加2%玉米面培養(yǎng)基。該結(jié)果表明，隨著玉米面添加量的增加，出菇率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。

菌株DJ1在固體培養(yǎng)基中接種后2～3 d菌絲萌發(fā)，乳白色，然后分化形成菌索（圖8-A），菌索能夠從為其提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基物中伸出，進(jìn)入另一個(gè)并不支持其生長(zhǎng)的基物中[27]，在這個(gè)過(guò)程中，菌索頂端二叉分支或不分支，幼嫩菌索淡黃色或乳白色（圖8-B～C），伴隨著生長(zhǎng)，不斷分支（圖8-D）。菌索由致密的紅褐色至黑褐色的外殼層和白色菌絲構(gòu)成的髓心組成（圖8-E），隨著菌索長(zhǎng)滿培養(yǎng)基（以木屑培養(yǎng)基為例），菌索會(huì)在培養(yǎng)基表層形成一層黑色脆弱的盤（圖8-F），充分后熟后，經(jīng)過(guò)溫度、光照等環(huán)境因素的刺激，開(kāi)始形成原基（圖8-G），給予合適的環(huán)境條件，逐漸生長(zhǎng)為菇蕾（圖8-H）、幼菇（圖8-I）及成熟子實(shí)體（圖8-J）。

3 討論與結(jié)論

珍貴中藥材天麻與豬苓生長(zhǎng)的優(yōu)劣與其必需共生菌蜜環(huán)菌的菌索特征，如粗細(xì)、分支和顏色等有關(guān)[28]，子實(shí)體的形成也與菌索的生長(zhǎng)密切相關(guān)[29]，好的蜜環(huán)菌菌種除與菌株本身的遺傳特性有關(guān)外，還依賴于培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基質(zhì)所提供的養(yǎng)分，只有在比較充足的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，生理功能才能正常完成，性狀才能得以穩(wěn)定的表達(dá)[30]。孫小衛(wèi)等[31]對(duì)野生和人工培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌索主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)菌索的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、多糖含量均高于野生菌索，認(rèn)為人工培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌索可代替野生菌索應(yīng)用在食品和醫(yī)藥保健品中。

國(guó)內(nèi)外對(duì)蜜環(huán)菌子實(shí)體生長(zhǎng)的研究表明，子實(shí)體形成對(duì)培養(yǎng)基有一定的要求，不同蜜環(huán)菌對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的適應(yīng)性不同，開(kāi)發(fā)挖掘適合不同蜜環(huán)菌生長(zhǎng)發(fā)育的基質(zhì)非常必要。不少學(xué)者對(duì)蜜環(huán)菌的栽培基質(zhì)進(jìn)行摸索[32-37]，成功馴化出了蜜環(huán)菌子實(shí)體。目前蜜環(huán)菌子實(shí)體已經(jīng)在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)成功，如麥芽汁培養(yǎng)基[23-24]和10%玉米面培養(yǎng)基[38]等。在本研究中，菌株DJ1在4種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)不同，在2號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況最優(yōu)，菌索粗壯，分布稠密，在4號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況較差。菌株DJ1最優(yōu)碳氮源分別為葡萄糖和麩皮，但當(dāng)?shù)春抗潭〞r(shí)，不同氮源種類（指本試驗(yàn)所用的4種氮源）與CK相比，對(duì)DJ1菌索生長(zhǎng)量與粗壯程度的影響均無(wú)顯著差異，因此在蜜環(huán)菌菌絲體生產(chǎn)實(shí)踐中尤其要重視碳源種類的篩選。

筆者首次在PDA+玉米面培養(yǎng)基上成功培育出蜜環(huán)菌子實(shí)體，除PDA培養(yǎng)基與添加10%玉米面培養(yǎng)基上未見(jiàn)子實(shí)體外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培養(yǎng)基均可培育出子實(shí)體。其中，不同玉米面含量的6種培養(yǎng)基菌索生長(zhǎng)量無(wú)顯著差異，但添加4%玉米面的PDA培養(yǎng)基菌索長(zhǎng)勢(shì)最好，且出菇時(shí)間最短，出菇效果最好。筆者推測(cè)添加一定量的玉米面不僅可以為蜜環(huán)菌菌絲的生長(zhǎng)提供較多且易于利用的營(yíng)養(yǎng)和能量，還可以促進(jìn)其從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換，形成子實(shí)體，該結(jié)論與于海龍等[39]和馬麗峰等[40]的研究結(jié)果一致。其次，筆者采用木屑與玉米面質(zhì)量比1∶1，麩皮質(zhì)量=蔗糖質(zhì)量=1/10的木屑質(zhì)量培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶中成功馴化出菌株DJ1子實(shí)體。

綜上所述，菌株DJ1屬于高盧蜜環(huán)菌Armillaria gallica。菌株DJ1最優(yōu)培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基+木屑100 g，麩皮5 g，pH=6，溫度23 ℃，在此條件下，菌絲潔白，菌索生長(zhǎng)良好。在PDA+玉米面培養(yǎng)基上成功培育出蜜環(huán)菌子實(shí)體，其中以添加4%玉米面的PDA培養(yǎng)基菌索長(zhǎng)勢(shì)最好，出菇時(shí)間最短，出菇效果最好。筆者優(yōu)化了菌株DJ1的培養(yǎng)條件，可為實(shí)現(xiàn)蜜環(huán)菌的快速培育提供參考。蜜環(huán)菌的藥用和食用部分多為子實(shí)體，筆者提供了蜜環(huán)菌出菇的兩種栽培培養(yǎng)基并探索了玉米面添加量與出菇率的關(guān)系，有望對(duì)蜜環(huán)菌的人工栽培及開(kāi)發(fā)利用提供指導(dǎo)與幫助。

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