RPA技術(shù)在金葡菌檢測中的研究進展

摘 要：金黃色葡萄球菌可以在人體內(nèi)外寄生或污染食物，導致皮膚潰爛、免疫力下降和食物中毒等一系列癥狀，對人體健康構(gòu)成危害。重組酶聚合酶擴增技術(shù)具有反應溫度低、反應速率快和特異性高的特點，在不需要精密儀器的情況下能夠更準確、高效、快速地檢測出金黃色葡萄球菌。本文主要通過綜述重組酶聚合酶擴增技術(shù)在金葡菌檢測中的國內(nèi)外現(xiàn)狀以及其反應機理、引物設(shè)計方法等內(nèi)容，探討了其中的意義和存在的問題，并展望了該領(lǐng)域未來的發(fā)展前景，旨在為公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域提供可行的解決方案。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；重組酶聚合酶擴增技術(shù)；等溫擴增技術(shù)；引物

Research Progress of RPA Amplification Technique in Detection of Staphylococcus aureus

ZHOU Yuxuan， WU Xuemei， SONG Shaozheng*

（School of Health and Nursing， Wuxi Taihu University， Wuxi 214000， China）

Abstract： Staphylococcus aureus can parasite or contaminate food inside and outside the human body， resulting in a series of symptoms such as skin ulceration， decreased immunity and food poisoning， posing a hazard to human health. Recombinase polymerase amplification technology has the characteristics of low reaction temperature， fast reaction rate and high specificity， and can detect Staphylococcus aureus more accurately， efficiently and quickly without the need of precision instruments. Therefore， this paper mainly reviewed the current situation of RPA amplification technology in Staphylococcus aureus detection at home and abroad， the reaction mechanism of recombinase polymerase amplification， primer design methods and other contents， discussed the significance and existing problems， and looked forward to the future development prospects of this field， aiming to provide feasible solutions for public health and food safety.

Keywords： Staphylococcus aureus; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification technique; primer

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）也稱“金葡菌”，是一種常見的食源性致病微生物，在自然界中廣泛存在。它主要寄生于人體的皮膚、鼻腔、咽喉、胃腸、癰和化膿瘡口中，可引起一系列血液感染和化膿性疾病，對食品和醫(yī)療領(lǐng)域造成嚴重影響[1]。但抗生素的濫用，導致多重耐藥性SA大量出現(xiàn)[2]，因此快速有效地檢測和監(jiān)測SA的存在變得至關(guān)重要。PIEPENBURG等[3]于2006年首次提出重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù)。RPA是一種新型的恒溫擴增技術(shù)，在25～43 ℃下反應，且反應速度較快，僅需5～15 min[4]。該技術(shù)不需要精密儀器，適用于現(xiàn)場快速檢測[5]，因此在相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者中備受關(guān)注。本文通過總結(jié)RPA技術(shù)在金葡菌檢測中的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、引物設(shè)計、探針設(shè)計等內(nèi)容，并展望了RPA技術(shù)在未來的發(fā)展前景，旨在為公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域提供參考。

1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1.1 發(fā)文量統(tǒng)計

2006年，Piepenburg首次提出RPA技術(shù)，至今一直是學者們研究的熱點。但目前利用RPA技術(shù)進行SA檢測的研究仍相對較少。通過PubMed和知網(wǎng)兩個數(shù)據(jù)庫進行關(guān)鍵詞檢索，時間范圍限定為2006—2023年，分別輸入“Recombinase Polymerase Amplification; Staphylococcus aureus”“重組酶聚合酶擴增技術(shù)；金黃色葡萄球菌”，發(fā)現(xiàn)RPA技術(shù)應用于SA快速檢測的發(fā)文量目前較少，兩個數(shù)據(jù)庫合計發(fā)文量僅11篇，且主要集中在RPA技術(shù)應用于醫(yī)學檢驗、微生物檢驗等領(lǐng)域的籠統(tǒng)概括，缺少具體的綜述。

1.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)研究人員開始探索利用RPA技術(shù)進行SA的快速檢測。以往的研究表明，RPA技術(shù)在SA檢測中具有很高的特異性和靈敏度。例如，徐健皓等[6]基于exo-RPA技術(shù)原理，針對SA設(shè)計了多套RPA引物和含有修飾熒光基團和淬滅基團的RPA熒光探針，并構(gòu)建了SA-exo-RPA檢測體系，增強了SA的檢測率，證明了RPA技術(shù)在SA檢測中的潛力。此外，研究人員還聯(lián)合使用RPA技術(shù)與其他檢測方法，如王雨[7]通過將RPA與橫向流動試紙條相結(jié)合來檢測SA，在研究中發(fā)現(xiàn)可以使敏感度達

20 CFU·mL-1，顯著提高了準確性。高建欣等[8]則是通過將RPA與乳膠微球試紙條相結(jié)合，檢測限為

1.2 CFU·mL-1。這些研究結(jié)果顯示出該方法對SA極為敏感，通過與其他檢測技術(shù)的結(jié)合，RPA技術(shù)可以對SA進行更加高效、準確的檢測。

綜上，國內(nèi)利用RPA技術(shù)進行SA的檢測已取得一定的進展，先前的研究也為該技術(shù)的優(yōu)化改進提供了技術(shù)支持。但目前仍然面臨著一些挑戰(zhàn)和限制，如細菌樣品中的抑制物和假陽性的干擾、靈敏度和穩(wěn)定度可進一步提高等。因此，未來還需不斷優(yōu)化RPA技術(shù)的條件和方法。

1.3 國外研究現(xiàn)狀

外科醫(yī)生亞歷山大·奧格斯頓于1880年給一名位于蘇格蘭阿伯丁的潰瘍患者進行治療時首次發(fā)現(xiàn)金葡菌[9]。自此，國外對SA的研究正式開始。近年來，RPA技術(shù)作為一種新興的核酸擴增方法，不少外國學者進行研究，MUNAWAR[10]的研究表明，RPA技術(shù)具有靈敏性高、恒溫擴增、適用性廣泛等優(yōu)點，能夠在短時間內(nèi)檢測到寡菌量級的菌液，也證明了RPA技術(shù)在SA檢測中的巨大潛力。但由于RPA技術(shù)引物和探針目前還存在一定的技術(shù)壁壘，因此外國學者主要對RPA技術(shù)與其他檢測方法聯(lián)合應用進行了探索。如將RPA技術(shù)與PCR、聚合物絮凝沉降等技術(shù)相結(jié)合以進一步提高SA檢測準確性和可靠性。TRAN等[11]將RPA技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合使用，創(chuàng)新出了一種基于重組酶聚合酶擴增方法的等溫PCR檢測方法，提高了SA檢測靈敏度，縮短了檢測所需的時間。

綜上所述，RPA技術(shù)在與其他技術(shù)聯(lián)用后可以進一步提高檢測結(jié)果的準確性和可靠性，對于檢測SA有獨特優(yōu)勢。未來的研究可以進一步優(yōu)化RPA反應條件，并探索其在實驗室以及野外環(huán)境中的應用潛力，推動SA檢測技術(shù)發(fā)展不斷向前邁進。

2 方法與技術(shù)

2.1 RPA的引物、探針設(shè)計

為了獲得高效、特異性和穩(wěn)定的RPA反應，研究者們進行了多方面的優(yōu)化。①引物的設(shè)計對于擴增效果至關(guān)重要。RPA技術(shù)的引物設(shè)計要求通常比較嚴格，引物的長短對擴增結(jié)果起著決定性作用。過短會影響重組率，減慢擴增速度，降低靈敏度；過長會增加產(chǎn)生其他二級結(jié)構(gòu)的可能性，都在一定程度上影響了核酸擴增產(chǎn)量。因此RPA反應引物的推薦長度為30～35個核苷酸[12]。此外，對引物GC堿基的含量應控制在40%～60%，且連續(xù)的GC堿基不能超過4個[13]，在引物設(shè)計中需注意二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。②探針的優(yōu)化也是關(guān)鍵因素。與一般Taq Man探針相比，RPA探針具有更高的設(shè)計要求。RPA反應目標片段長度應少于

500 bp，最佳擴增長度以100～200 bp為宜。如四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）位點的5’端正?？刂圃?/p>

30 bp，3’端正?？刂圃?5 bp。間隔越大導致基底值越高，信噪比越低，因此熒光團與猝滅團通常標記在胸腺嘧啶上，且兩者的間距控制在1～5 bp，一般用THF取代1個核苷酸。C3-間隔通常被探針的3’端用來阻斷基團進行修飾封閉。

2.2 RPA檢測SA的原理

①RPA技術(shù)主要基于重組酶和DNA聚合酶的協(xié)同作用，使其在無須進行溫度變化的環(huán)境下高效擴增DNA。因此，在檢測SA時，首先識別并結(jié)合到雙鏈DNA的特定序列上，其中的DNA聚合酶在單鏈結(jié)合蛋白的保護下，沿著單鏈模板進行快速且高效的DNA合成。整個過程無須復雜的溫度變化，可在23～45 ℃中穩(wěn)定擴增，且只需15～20 min即可完成目標擴增[14]，節(jié)省了時間和成本。②進行RPA檢測之前需要進行SA的DNA提取。目前常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、鹽法和DNA提取試劑盒，其中最主要的是DNA提取試劑盒，其具有簡便高效的特點，并且利用其特殊的試劑盒體系和離心柱技術(shù)可以快速地提取高質(zhì)量的DNA。

3 結(jié)語

RPA技術(shù)具有高靈敏性、特異性和廣泛的適用性等優(yōu)點，操作簡單易行，為基層醫(yī)療組織和資源匱乏地區(qū)快速有效的檢測病原菌，提供了可能[15]。但在目前的研究中RPA技術(shù)仍存在樣本前置處理煩瑣、菌液的假陽性干擾大等問題。①在檢測SA的研究進展中需要繼續(xù)優(yōu)化和改進RPA反應體系，以提高其擴增效率和特異性，并減少阻抗物質(zhì)對反應的干擾?？赏ㄟ^優(yōu)化擴增反應體系的組分濃度和反應條件；還可以通過引入新的輔助酶或輔助因子來提高反應效率和特異性。②加強RPA與其他新興技術(shù)的結(jié)合。如CRISPR，可以減少非特異性擴增和背景干擾，提高對SA檢測的準確性與可靠性。綜上所述，利用RPA技術(shù)進行SA檢測已經(jīng)取得了顯著的研究進展，利用RPA技術(shù)進行SA檢測具有重要的臨床應用前景，在診斷和治療SA感染方面具有重要意義。

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基金項目：江蘇省高校自然科學基金（20KJB360007）；江蘇省高?！扒嗨{工程”優(yōu)秀青年骨干教師項目（蘇教師函〔2021〕11號）。

作者簡介：周宇萱（2002—），女，安徽馬鞍山人，本科。研究方向：生物醫(yī)學。

通信作者：宋紹征（1984—），男，江蘇宿遷人，博士，副教授。研究方向：生物醫(yī)藥。E-mail：ssz0610@163.com。