固相萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法快速篩查和分析生活飲用水中的56種抗生素

摘 要：目的：建立生活飲用中56種抗生素的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法：將生活飲用水通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上凈化，用C18柱梯度洗脫分離目標物，以乙腈和0.1%甲酸水為流動相，經(jīng)電噴霧離子源電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式串聯(lián)質(zhì)譜檢測。結(jié)果：56種抗生素的最低檢測濃度為0.1～2.0 μg·L-1，在其線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，3個濃度水平的加標回收率為63.3%～113.0%，相對標準偏差在3.1%～8.3%。結(jié)論：該方法前處理簡單、快速，適用于生活飲用水中多種抗生素的快速篩查和定量檢測。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取；生活飲用水；大容量采樣管

Rapid Screening and Determination of 56 Antibiotics in Drinking Water by Solid-Phase Extraction Combined with UPLC-MS/MS

CHEN Kun， ZHONG Gemei， WEI Rirong， HUANG Jiangping， LEI Ningsheng， LIAO Yanhua*

（Guangxi Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530028， China）

Abstract： Objective： To develop a method for determination of 56 antibiotics in drinking water by solid -phase

extraction and UPLC-MS/MS. Method： Drinking water is connected to the solid phase extraction column for purification through a large-capacity sampling tube， target object were separated on C18 with gradient elution using acetonitrile-0.10% formic acid as mobile phase and detected by MS/MS using positive electrospray ionization under the multiple reaction monitoring. Result： The minimum detection of 56 antibiotics was 0.1～2.0 μg·L-1. The correlation coefficients in its linear range are over 0.995. The recovery rates of the 3 concentration levels were 63.3%～113.0% with the relative standard deviations of 3.1%～8.3%. Conclusion： The method has simple and rapid pretreatment， and is suitable for rapid screening and quantitative detection of multiple antibiotics in drinking water.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; solid-phase extraction; drinking water; large-capacity sampling tube

近年來，有關(guān)新型污染物的話題再次走入公眾視野，它被稱為“新型污染物”或“新興污染物”，它一般是指由人類活動造成，在城市污水、地表水、飲用水中被頻繁檢測出，但因其生產(chǎn)使用歷史相對較短或發(fā)現(xiàn)危害較晚，尚無法律法規(guī)和標準予以規(guī)定或規(guī)定不完善的污染物。目前，國內(nèi)外廣泛關(guān)注的新型污染物主要包括國際公約管控的持久性有機污染物、內(nèi)分泌干擾物、抗生素等。為加強新型污染物治理，切實保障生態(tài)環(huán)境安全和公眾健康，國家在2022年出臺了一系列行動方案[1-3]?？股貫樾滦臀廴疚镏械囊活悾浔粡V泛用于農(nóng)業(yè)、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域的細菌感染治療[4-5]，主要通過藥企制藥廢水、醫(yī)院的醫(yī)療廢棄物不正當排放以及人體或動物和水產(chǎn)飼養(yǎng)用藥殘留排放進入水體和環(huán)境，從而產(chǎn)生污染。

現(xiàn)行的相關(guān)抗生素國家標準[6-7]分析方法主要是針對水產(chǎn)品和動物源性食品抗生素的檢測，新發(fā)布的GB/T 5750.8—2023[8]主要是針對生活飲用水中29種抗生素和10種降壓藥等個人護理用藥的檢測，國內(nèi)暫無環(huán)境類標準；美國EPA 1694[9]標準方法中已有利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)，采用同位素標識物為內(nèi)標物定量測定環(huán)境樣品中的藥物及個人護理用品，檢測對象包括7種沙星類抗菌藥，6種大環(huán)內(nèi)酯類和1種林可酰胺類抗生素。這些標準方法大多是針對化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的某一類抗生素的檢測[10-15]，

科研文獻[16-18]中雖有采用LC-MS/MS檢測水中多種抗生素的報道，但同時測定的抗生素種類和目標物數(shù)量涉及范圍和種類還不夠廣，且在多種抗生素的同時檢測過程中，鮮有文獻提及如何在復(fù)雜的譜圖中快速篩查出目標物。

水中抗生素含量低、干擾大，因此檢測時采用固相萃取前處理凈化分離和富集技術(shù)，將大體積水樣通過過柱的方式進行凈化富集，再結(jié)合具有高通量、高選擇性、高準確性及痕量分析能力的LC-MS/MS進行檢測。基于國內(nèi)近年來食品安全風險監(jiān)測物質(zhì)、國內(nèi)外文獻報道及管控目標物清單，本文建立了包括喹諾酮類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類在內(nèi)的生活飲用水中56種抗生素的固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）結(jié)合LC-MS/MS快速篩查和分析檢測方法，為生活飲用水中新型污染物的監(jiān)測提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑耗材

儀器：TM5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX 5500，新加坡）；氮吹儀（N-EVAP34美國路易公司）。

試劑耗材：HLB固相萃取小柱（6 mL/500 mg）、大容量采樣管（匹配6 mL SPE小柱，1/8in OD，1 mL，1支/包）、EDTA-2Na（分析純）、甲醇（色譜純，4 L/瓶）、乙腈（色譜純，4 L/瓶）、甲酸（色譜純，4 L/瓶）、標準品：25種磺胺類混標（LOT：2251860，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混標（LOT：2253998，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），12種硝基咪唑混標（LOT：2101538，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），15種喹諾酮類（LOT：2201585，100 mg·L-1，溶劑為甲醇）購自上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別吸取以上混標1.00 mL用甲醇定容至

10 mL容量瓶中，制備成10.0 mg·L-1混合儲備液，保存于-20 ℃冰箱中。根據(jù)標準曲線濃度范圍依次用初始流動相逐級稀釋成系列標準曲線溶液。

1.3 分析步驟

采集1 L水樣于預(yù)先現(xiàn)場添加6 mg抗壞血酸的1 L的玻璃瓶中，使用0.45 μm濾膜抽濾。用（1+1）鹽酸溶液或氨水調(diào)節(jié)水樣的pH值，使水樣的pH值為3.5±0.5，再加入0.5 g EDTA，搖勻溶解；后將水樣通過大容量采樣管連接到預(yù)先用6 mL甲醇（色譜純）和6 mL水活化的HLB柱上，調(diào)節(jié)流速為5～8 mL·min-1，讓水樣連續(xù)自動輸入；上樣結(jié)束后用10 mL水淋洗小柱，負壓抽干HLB小柱，用6 mL甲酸/甲醇（1∶1 000）混合溶液洗脫樣品，洗脫液靠重力收集到15 mL離心管中，上述洗脫液在≤40 ℃水浴溫度下氮吹至近干，用1.00 mL初始流動相復(fù)溶，充分混勻后過0.22 μm濾膜至進樣瓶上機測定。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm，100 ?，100 mm×2.1 mm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：3 μL；流動相及洗脫條件見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子方式；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度：600 ℃；GS1：55 psi；GS2：50 psi；氣簾氣：35 psi；噴霧電壓：5 500 V；碰撞氣：6 psi；校準方法：質(zhì)量軸自動調(diào)諧校準。其他條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 水樣pH值對回收率的影響

本文研究的化合物大多屬于酸堿兩性化合物，水樣pH值會影響其穩(wěn)定性和存在形態(tài)，如在酸性條件下以質(zhì)子狀態(tài)存在，在堿性條件下以游離分子狀態(tài)存在。在酸性條件下提取的文獻報道居多，因此本文比較了56種化合物在pH值為2、3、4、5、6條件下的回收率，硝基咪唑類結(jié)果回收率在75.3%～102.8%，表明硝基咪唑類化合物回收率良好，受水樣pH值影響較小。在接近中性條件下恩諾沙星、氧氟沙星、氟羅沙星回收率接近50%，水樣調(diào)節(jié)為酸性（pH值2～4）后，沙星類抗菌藥的回收率有了顯著提高，均達到75%以上。大環(huán)內(nèi)酯類化合物受pH值影響較大，pH值為3～4時回收率在65%～105%；pH值為2時，除紅霉素外，大多數(shù)組分回收率顯著下降，這可能與強酸性條件下糖苷鍵水解有關(guān)；部分組分在接近中性條件下回收率下降明顯，泰樂菌素、交沙霉素的回收率不到50%。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

由于56種抗生素大多都是含氮化合物，易于質(zhì)子化，在質(zhì)譜電噴霧電離模式下易形成[M+H]正離子，且有較強的響應(yīng)信號，通過針泵進樣優(yōu)化母離子及各碎片離子參數(shù)，結(jié)合實際樣品各離子對基線、雜質(zhì)干擾峰與響應(yīng)信號的色譜圖，優(yōu)化后各化合物的離子對信息如表2所示。

正離子模式下，乙腈-0.1%甲酸水流動相體系更有利提高各化合物組分離子化效率，使響應(yīng)信號更高，峰形更尖銳。通過優(yōu)化流動相的梯度洗脫條件，大多數(shù)有機化合物實現(xiàn)了基線分離，實現(xiàn)了對磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲異嘧啶，磺胺二甲異噁唑和磺胺二甲唑共4組磺胺類同分異構(gòu)體的基線分離；對于部分未達到基本分離的極性相近的化合物，質(zhì)譜檢測器的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式也能進行準確定性定量分析，不影響分析結(jié)果。本文通過3輪抽提離子對完成了分析化合物的定性篩查，圖1為10 ng·mL-1分析化合物的色譜圖。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

以水源水空白和末梢水空白為基質(zhì)，按上述方法測定，添加標準系列濃度的56種抗生素標準溶液復(fù)溶氮吹后殘渣，繪制基質(zhì)標準曲線，以之與溶劑（0.10%甲酸水∶乙腈=9∶1）配制的標準溶液響應(yīng)值比較，用標準曲線斜率的比值評價基質(zhì)效應(yīng)的高低。結(jié)果顯示，56種化合物的基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線斜率比值在0.81～1.15，說明基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響可以忽略，可避免每次實際樣品檢測至少要帶5個空白基質(zhì)樣品同時測定用以配制基質(zhì)曲線的麻煩，減少了檢驗工作量。

2.4 方法學(xué)評價

以空白水源水為基質(zhì)，加入一定量的標準溶液，在優(yōu)化的實驗條件下（pH值為3.5±0.5），以信噪比為10計算方法的最低檢測濃度（定量限）；根據(jù)化合物的最低檢測濃度，配制標準系列濃度上機測定，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)；根據(jù)各化合物的線性范圍，設(shè)置低（0.2～5.0 μg·L-1）、中（5.0～20 μg·L-1）、高（20～100 μg·L-1）3個加標水平，按上述方法測定樣品，每個加標水平重復(fù)測定6份樣品，計算回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，56種抗生素的最低檢測濃度為0.1～2.0 μg·L-1，r均大于0.995，線性良好，低、中、高3個濃度水平的加標回收率為63.3%～113.0%，相對標準偏差在3.1%～8.3%，滿足檢測要求。

2.5 實際樣品檢測

利用本研究建立的方法對南寧市的3份末梢水、3份水源水和3份出廠水進行檢測，檢出抗生素7種，陽性樣品6份，檢出的抗生素主要是大環(huán)內(nèi)酯和磺胺類抗生素，含量為0.2～5.8 μg·L-1，提示應(yīng)加強監(jiān)測。

3 結(jié)論

本研究建立的一種固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS快速測定方法能篩查生活飲用水中56種抗生素，涵蓋了喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等人獸兩用藥物，可以應(yīng)用于飲用水源抗生素污染調(diào)查和生活飲用水水質(zhì)監(jiān)測工作。

實驗室采用傳統(tǒng)的樣品過柱模式，工作不僅耗時費力還可能因為重復(fù)性勞動導(dǎo)致倦怠而發(fā)生操作失誤，影響結(jié)果準確性。本研究創(chuàng)新性地將樣品通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上，通過壓差導(dǎo)流實現(xiàn)凈化處理半自動化操作，操作人員能夠輕松實現(xiàn)批次處理樣品，給未配置多通道全自動固相萃取的實驗室提供了一種連續(xù)上樣的操作模式，以低實驗成本提高了工作效率。本研究不僅通過對流動相條件的優(yōu)化，達到對大部分目標化合物的基線分離，還創(chuàng)新性提出對56種抗生素的保留時間進行分類，通過3輪篩查，可以實現(xiàn)檢測數(shù)據(jù)的快速處理，大大提高實驗室批量數(shù)據(jù)處理能力的同時減少了失誤。

綜上，本文建立的固相萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法篩查生活飲用水中56種抗生素的方法，整個過程操作簡單，適應(yīng)了現(xiàn)階段環(huán)境監(jiān)測檢測高通量、操作時間短、定性定量準確等要求，值得在更多抗生素殘留的快速篩確證與定量檢測工作中推廣應(yīng)用。

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基金項目：廣西醫(yī)藥衛(wèi)生計劃課題（Z2015448）

作者簡介：陳琨（1982—），女，湖南邵陽人，碩士，副主任技師。研究方向：實驗室質(zhì)量管理與理化檢驗。

通信作者：廖艷華（1978—），女，廣西宜州人，碩士，副主任技師。研究方向：理化檢驗。E-mail：1907430702@qq.com。