CTRP2與主動脈夾層發(fā)生的相關(guān)性研究

李旭 王志維

【摘要】目的 檢測C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白2（CTRP2）在患者主動脈、小鼠主動脈以及小鼠主動脈血管平滑肌細胞中的表達水平，分析其與主動脈夾層（AD）發(fā)病之間的相關(guān)性。方法 利用GEO數(shù)據(jù)庫分析CTRP2在AD患者和非AD患者中的表達差異。選擇2021年6月—2022年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院的6例確診為急性Stanford A型AD患者的主動脈標(biāo)本作為夾層組，6例心臟移植患者的主動脈作為對照組，通過Western blot法檢測夾層組與對照組的CTRP2表達差異。將24只C57BL/6雄性3周齡野生型小鼠隨機分為對照組和夾層組，夾層組用含有0.25%β-氨基丙腈的飼料喂養(yǎng)4周，取主動脈組織用石蠟包埋，標(biāo)本切片后用免疫組織化學(xué)法檢測CTRP2表達差異。細胞實驗分為對照組和夾層組，分別用磷酸鹽緩沖溶液和不同濃度的血管緊張素Ⅱ處理小鼠主動脈血管平滑肌細胞后提取細胞，用Western blot法檢測CTRP2表達水平。結(jié)果 免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測結(jié)果顯示CTRP2在夾層組的患者主動脈、小鼠主動脈以及小鼠主動脈血管平滑肌細胞中的表達均顯著升高。結(jié)論 CTRP2蛋白表達水平在對照組和夾層組中的表達存在差異，與AD的發(fā)生具有相關(guān)性，有望成為治療AD的新靶點。

【關(guān)鍵詞】主動脈夾層；C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白2；治療靶點

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.05.020

The Correlation Between CTRP2 and Occurrence of Aortic Dissection

【Abstract】Objective To detect the expression level of C1q tumor necrosis factor-related protein 2 （CTRP2） in the aorta of patients，aorta of mouse and mouse aortic vascular smooth muscle cells，and to analyze its correlation with the pathogenesis of aortic dissection （AD）.Methods The GEO database analyzed the difference in expression of CTRP2 in patients with and without AD.The aortic specimens of patients diagnosed with acute Stanford type A AD in Renmin Hospital of Wuhan University from June 2021 to December 2022 were selected as the dissection group （n=6），and the aorta of heart transplant patients was used as the control group （n=6），and the difference in CTRP2 expression between the dissection group and the control group was detected by Western blot method.Twenty-four C57BL/6 male 3-week-old wild-type mice were randomly classified into control group and dissection group，and the dissection group was fed with feed containing 0.25% β-aminopropionitrile for 4 weeks.The aorta tissue was embedded with paraffin，and the specimens were sectioned and detected the difference in CTRP2 expression by immunohistochemistry.The cells were divided into control group and dissection group，and mouse aortic vascular smooth muscle cells were extracted after treating with PBS and different concentrations of angiotensin Ⅱ.The expression level of CTRP2 was detected by Western blot method.Results The results of immunohistochemistry and Western blot showed that the expression of CTRP2 in the aorta of patients，aorta of mouse and mouse aortic vascular smooth muscle cells in the dissected group were significantly increased.Conclusion There are differences in the expression level of CTRP2 protein in the control group and the dissection group，which is correlated with the occurrence of AD，and is expected to become a new therapeutic target for AD.

【Keywords】Aortic dissection；C1q tumor necrosis factor-related protein 2；Therapeutic target

主動脈夾層（aortic dissection，AD）是指血液通過主動脈內(nèi)膜的裂口進入主動脈壁，并沿著主動脈長軸方向向下延伸，使主動脈內(nèi)膜與中膜分離形成夾層，是一種致死率極高的心血管疾病。據(jù)統(tǒng)計，急性AD的發(fā)病率占急性主動脈綜合征的80%～90%，為2.65～3.50/10萬人年［1］。主動脈壁由動態(tài)變化的細胞群和細胞外基質(zhì)構(gòu)成，以適應(yīng)人體血流動力學(xué)變化，當(dāng)主動脈壁發(fā)生應(yīng)激和損傷時，會導(dǎo)致平滑肌細胞遷移和減少，細胞外基質(zhì)降解，炎癥發(fā)生，構(gòu)成AD發(fā)生的病理基礎(chǔ)［2］。截至目前，手術(shù)治療仍是AD患者唯一的治療方式，尚無有效的藥物治療，因此尋找具有針對性的治療靶點更為急迫。

通過利用GEO （Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫對AD患者主動脈數(shù)據(jù)集GSE57691分析發(fā)現(xiàn)，C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（C1q tumor necrosis factor-related protein，CTRP）2在AD患者主動脈中的表達顯著高于正常主動脈。CTRP是一類由脂肪組織分泌的激素，在結(jié)構(gòu)上與脂聯(lián)素極為相似。CTRP參與糖類、脂類代謝和血管擴張等生理病理過程［3］，與心血管疾病和代謝性疾病，如糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。有研究［6］顯示，CTRP2在冠狀動脈疾病患者中的表達明顯高于健康人，并且與疾病嚴重程度呈正相關(guān)，表明其可能是心血管疾病發(fā)生的危險因素。尚未有研究涉及CTRP2與AD之間的聯(lián)系，本研究主要通過檢測CTRP2在夾層組與對照組之間的表達差異，探討CTRP2與AD發(fā)生之間的相關(guān)性，為AD的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 CTRP2在AD患者主動脈中的表達分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）提取與AD相關(guān)的數(shù)據(jù)集GSE57691，通過GEO2R功能分析CTRP2在49例AD患者和10例非AD患者中的表達差異。

1.2 人體組織樣本

隨機選取2021年6月—2022年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院的6例確診為急性Stanford A型AD患者的主動脈標(biāo)本作為夾層組，6例心臟移植患者的主動脈標(biāo)本作為對照組。納入標(biāo)準：經(jīng)CT血管造影檢查確診為AD，且夾層的撕裂口位于升主動脈。排除標(biāo)準：（1）合并冠心病等其他血管疾病；（2）合并肝腎等重要臟器疾病。本方案經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準（審批號：20201107）。本試驗中所涉及的臨床標(biāo)本獲得了所有患者和捐贈者的同意，并簽署知情同意書。

1.3 實驗試劑

CTRP2抗體（Santa Cruz，美國）、

α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（塞維爾，中國） 、β-actin抗體（塞維爾，中國） 、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（三鷹，中國）、抗兔二抗（Cell Signaling Technology，美國）和抗鼠二抗（Cell Signaling Technology，美國）。

1.4 動物模型

24只3周齡野生型C57BL/6雄性小鼠均由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，飼養(yǎng)期間室溫控制在20～25 ℃，期間小鼠均可自由進食飲水。將小鼠采用數(shù)字表法隨機分入夾層組（n=12）和對照組（n=12）。夾層組小鼠用含有0.25%β-氨基丙腈的飼料喂養(yǎng)，對照組用正常的維持飼料喂養(yǎng)。期間觀察小鼠的生存情況，對于死亡的小鼠立即進行解剖，將發(fā)生夾層的局部主動脈組織用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后進行切片。造模時間達到4周后，將所有存活小鼠統(tǒng)一取材。動物實驗通過了武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物福利倫理審查（審批號：20201107）。

1.5 細胞模型

將小鼠主動脈血管平滑肌細胞（mouse aortic vascular smooth muscle cells，MOVAS）放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察到細胞密度為70%時，用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理細胞12 h后，將細胞分為4組進行處理：磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）（1 μmol·L-1），Ang Ⅱ（2 μmol·L-1）和Ang Ⅱ（4 μmol·L-1）。處理36 h后收集細胞提取蛋白。

1.6 Western blot檢測

將組織或細胞用PBS洗滌后，加入用蛋白酶抑制劑和放射免疫沉淀法裂解緩沖液按1：100配好的裂解液，在冰上裂解，液氮研磨儀研磨組織。在4 ℃和12 000 r/min的條件下離心20 min。將收集的上清液用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，剩余蛋白加入適量Loading Buffer （5×）加樣緩沖液。將蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳，然后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗（CTRP2，1：200）并在4 ℃孵育過夜。次日，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后加入相對應(yīng)的抗兔IgG或抗鼠IgG，室溫下孵育1 h。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后用化學(xué)發(fā)光儀（Bio-Rad，美國）對膜進行顯影，檢測CTRP2蛋白表達信號，并用Image J軟件對檢測結(jié)果進行半定量分析。

1.7 免疫熒光檢測

將切片在65 ℃的烘箱中烘烤2 h后，在二甲苯、無水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精和50%酒精中水化以溶解剩余石蠟，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌后用0.2%Triton溶液破膜15 min，然后在枸櫞酸緩沖溶液中進行微波煮沸進行修復(fù)。自然冷卻2 h后，滴加山羊血清封閉30 min，滴加一抗［CTRP2，1：50；

α-SMA，1：200］，4 ℃孵育過夜。室溫下復(fù)溫1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次后滴加二抗孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次。4，6-二脒基-2-苯基吲哚染核5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑后封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用TRIzol法提取各組細胞的信使RNA（messenger RNA，mRNA），并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）檢測CTRP2 mRNA的表達水平。CTRP2的上游引物為5-GACAGGCAACCGTGGAAAAC-3，下游引物為5-AGGGTCGTAGAAGAGGCCAT-3。α-SMA的上游引物為5-GGACGTACAACTGGTATTGTGC-3，下游引物為5-TCGGCAGTAGTCACTAAGGA-3。

GAPDH的上游引物為5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3，下游引物為5-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graghpad軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，至少取3次獨立實驗結(jié)果。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTRP2在人體主動脈組織中的生物信息學(xué)表達結(jié)果

通過對GEO數(shù)據(jù)庫相關(guān)數(shù)據(jù)集中49例AD患者和10例非AD患者的分析，結(jié)果顯示CTRP2在AD患者的主動脈中表達較非AD患者的主動脈中表達顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 CTRP2在人體主動脈組織中的表達

通過Western blot法檢測CTRP2在人體主動脈的表達水平，結(jié)果顯示CTRP2在夾層組的表達顯著高于對照組，通過Image J軟件對結(jié)果進行半定量分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 CTRP2在小鼠主動脈組織中的表達

通過免疫熒光染色反映CTRP2在小鼠主動脈的表達，結(jié)果顯示夾層組的小鼠主動脈中α-SMA熒光強度較對照組減弱（P＜0.05），表明夾層組MOVAS發(fā)生了從收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化。與此同時，夾層組CTRP2的熒光強度較對照組明顯增強，表明CTRP2在夾層組小鼠主動脈中表達較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 CTRP2在MOVAS中的表達

Western blot法檢測不同濃度AngⅡ處理下的CTRP2表達情況，結(jié)果顯示實驗組的CTRP2表達量均較對照組明顯增高，并且隨AngⅡ濃度升高而增高，見圖4。

2.5 CTRP2 mRNA在MOVAS中的表達

qRT-PCR法檢測CTRP2在MOVAS中mRNA的表達水平，結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組的CTRP2 mRNA表達水平增高（P＜0.01），并隨著AngⅡ濃度升高而增高。同時α-SMA在MOVAS中mRNA的表達水平隨著AngⅡ濃度升高而逐漸降低，表明AngⅡ可誘導(dǎo)MOVAS從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，見圖5。

3 討論

AD作為病死率極高的急性心血管疾病，其病因及發(fā)病機制至今仍未明確。平滑肌細胞是主動脈中層的重要組成部分，當(dāng)其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化、凋亡、遷移等，會導(dǎo)致主動脈中層退變，引發(fā)AD的發(fā)生。本文通過生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)CTRP2在夾層患者主動脈中的表達明顯升高，繼而通過人體主動脈標(biāo)本、動物模型以及細胞模型進行驗證，進一步證實CTRP2在夾層組的表達明顯高于對照組。因此推斷，CTRP2與AD的發(fā)生發(fā)展存在緊密的聯(lián)系。

CTRP在人體不同器官內(nèi)的分布具有特異性，如在心肌組織中CTRP9表達含量較多［7］，在骨骼肌中CTRP15分布最多［8］。截至目前，CTRP家族已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)15個成員，結(jié)構(gòu)上均具有4個共同結(jié)構(gòu)域，并且其中一個與脂聯(lián)素同源［9］。而脂聯(lián)素主要通過增強肌肉和肝臟的胰島素敏感性來控制全身能量代謝［10-11］，這讓最初針對CTRP的研究主要集中在代謝異常相關(guān)疾病，如CTRP2參與脂肪組織的分解和肝臟脂質(zhì)的代謝［12］，CTRP3在腺苷酸活化蛋白激酶信號通路下，可通過改善內(nèi)皮細胞功能來改善糖尿病微血管病變［13］。但越來越多的研究顯示CTRP家族與心血管疾病存在關(guān)聯(lián)，Lu等［14］在冠狀動脈疾病患者的血清、動脈內(nèi)膜切除標(biāo)本、主動脈粥樣硬化斑塊中的檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，冠狀動脈疾病患者的樣本中CTRP1的表達量顯著增高，并與疾病嚴重程度正相關(guān)。將小鼠CTRP1基因敲除后，小鼠的促動脈粥樣硬化作用明顯降低。

但目前CTRP2的具體生物學(xué)功能尚不明確，并且尚未有研究探討CTRP2與AD發(fā)病之間是否存在聯(lián)系。試驗數(shù)據(jù)表明人的體重指數(shù)與CTRP2的蛋白表達量呈正相關(guān)，肥胖人群的CTRP2表達會上調(diào)。當(dāng)敲除CTRP2后，小鼠脂肪組織中主要的脂溶酶在mRNA和蛋白水平上的表達增強，同時增強蛋白激酶A底物的磷酸化，促進甘油三酯等脂肪組織的分解［12］。這些結(jié)果表明CTRP2表達量增多會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。而脂質(zhì)代謝紊亂在AD中起著重要作用。研究［15］表明，氧化型低密度脂蛋白會誘導(dǎo)血管平滑肌細胞形成泡沫細胞樣表型，繼而通過激活核因子κB通路誘導(dǎo)細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，并通過活性氧和蛋白水解酶對血管壁造成損傷。所以研究推測CTRP2可能通過調(diào)控脂質(zhì)代謝的方式對血管平滑肌造成損傷，進而導(dǎo)致AD的發(fā)生。Li等［16］在實驗中發(fā)現(xiàn)，CTRP2可誘導(dǎo)心肌細胞腺苷酸活化蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化，增強心肌細胞對葡萄糖的攝取。因此，CTRP2在AD患者中的高表達可能與主動脈平滑肌細胞的葡萄糖攝取和能量代謝異常有關(guān)。

綜上所述，本研究表明了CTRP2與AD的相關(guān)性，但其在AD發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用尚不清楚，具體機制有待進一步研究。AD作為死亡率極高的心血管疾病，亟需新的早期診斷方法和治療手段，本研究旨在為AD提供新的研究方向和治療靶點。

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