嵌合抗原受體T細(xì)胞治療在心肌纖維化中的研究進(jìn)展

李好 鄭琦 楊琳 李雙秀 孫林

【摘要】嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞治療是目前細(xì)胞免疫治療中最熱門的研究領(lǐng)域，在腫瘤治療中有著輝煌的成就。隨著研究的深入，CAR-T細(xì)胞治療在非腫瘤疾病中也有著重大的突破。CAR-T細(xì)胞作為過繼性T細(xì)胞的一種，結(jié)合了抗體的抗原結(jié)合特性和T細(xì)胞的效應(yīng)功能，能靶向消除特定的細(xì)胞。對于尚無有效治療措施的心肌纖維化，CAR-T細(xì)胞治療可能是一個新的治療思路與方向?，F(xiàn)就目前CAR-T細(xì)胞治療在心肌纖維化中的研究進(jìn)展做一綜述。

【關(guān)鍵詞】嵌合抗原受體T細(xì)胞治療；細(xì)胞免疫治療；心肌纖維化

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.05.015

Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy in Myocardial Fibrosis

【Abstract】Chimeric antigen receptor T（CAR-T） cell therapy is currently the hottest research field in cellular immunotherapy，and has made brilliant achievements in tumor treatment.With the deepening of research，CAR-T cell therapy has also made a major breakthrough in non-tumor diseases.CAR-T cells，a type of adoptive T cell，combine the antigen-binding properties of antibodies with the effector function of T cells to target the elimination of specific cells.For myocardial fibrosis which there is no effective treatment，CAR-T cell therapy may be a new treatment idea and direction.This article reviews the current research progress of CAR-T cell therapy in myocardial fibrosis.

【Keywords】Chimeric antigen receptor T cell therapy;Cellular immunotherapy;Myocardial fibrosis

近年來，細(xì)胞治療作為一種安全有效的治療手段，在臨床治療中的作用越來越突出。細(xì)胞治療領(lǐng)域的范圍仍在不斷擴大，使用其他免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞治療的新技術(shù)仍在研究中，而目前最火熱的細(xì)胞治療是嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞治療。CAR-T細(xì)胞在腫瘤治療，尤其是血液腫瘤治療中療效顯著，成為發(fā)展最迅速的腫瘤免疫療法。自2017年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)Kymriah上市以來，截至2023年1月，共有7款CAR-T 細(xì)胞治療藥物獲得批準(zhǔn)［1］。然而 CAR-T細(xì)胞治療遠(yuǎn)不止于腫瘤治療，在心血管疾病中也有新的研究進(jìn)展。

1 CAR-T細(xì)胞治療概述

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）分子是一種采用抗體識別區(qū)替換T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）胞外識別區(qū)的抗體-TCR嵌合分子，其不再依賴主要組織相容性復(fù)合體的限制性識別，并通過TCR-CD3復(fù)合體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，產(chǎn)生強有力的T細(xì)胞活化效應(yīng)。CAR-T細(xì)胞直接與靶細(xì)胞表面的特異性抗原相結(jié)合而被激活，CD3ζ鏈上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域磷酸化后引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這個過程類似于TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］，激活的T細(xì)胞通過釋放穿孔素、顆粒酶B等直接殺傷靶細(xì)胞，同時還通過釋放細(xì)胞因子募集內(nèi)源性免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞，從而達(dá)到治療目的。

CAR分子結(jié)構(gòu)通常由胞外抗原結(jié)合域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、T細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域以及一個或多個胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域組成。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可將CAR分子分為5代。第1代CAR分子由胞外抗原識別區(qū)即單鏈可變片段、融合跨膜區(qū)和TCR的CD3ζ鏈信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)組成，由于缺乏共刺激因子，第1代CAR-T細(xì)胞顯示出低增殖性，限制了其應(yīng)用。第2代CAR分子添加了CD28或4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域，位于跨膜區(qū)和CD3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域之間［3］。美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的6款CAR-T產(chǎn)品均為第2代CAR-T細(xì)胞［4］。第3代CAR分子包含兩個共刺激分子，最常見的是同時添加了CD28和4-1BB兩個共刺激結(jié)構(gòu)域，這一代CAR-T細(xì)胞增強了細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表現(xiàn)出更好的增殖能力、殺傷活性和持久性，但可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用和更快的T細(xì)胞耗竭［2］。在第2代CAR分子的基礎(chǔ)上添加共表達(dá)的細(xì)胞因子，比如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2，這意味著第4代CAR-T細(xì)胞的誕生，這代CAR-T細(xì)胞的活化可促進(jìn)所需細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，重塑免疫微環(huán)境，實現(xiàn)多功能治療［5］。第5代CAR-T細(xì)胞同樣基于第2代，添加了激活其他信號通路的共刺激結(jié)構(gòu)域，比如插入了IL-2受體鏈，通過激活酪氨酸蛋白激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子途徑促進(jìn)細(xì)胞因子的信號傳遞［6］。此外，還有許多新策略應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療，例如雙靶CAR-T細(xì)胞［7］、CAR-T細(xì)胞聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑［8］及可循環(huán)CAR［9］等，這些新型的策略為CAR-T細(xì)胞治療提供了新思路。

CAR-T技術(shù)的發(fā)展歷程已有30余年，已在血液腫瘤治療中取得了輝煌成績。在實體瘤治療中也有研究［10］證明CAR-T細(xì)胞治療的有效性及安全性。而在非腫瘤適應(yīng)證中（如感染性疾?。?1］、自身免疫性疾?。?2］、移植排斥［13］和衰老［14］等），CAR-T細(xì)胞治療也展開了初步的探討研究。

2 CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化

有數(shù)據(jù)［15］顯示，心血管疾病是中國居民的首位死因。而心肌纖維化是多種心血管疾病（如心肌梗死、高血壓、心肌炎和主動脈狹窄等）發(fā)展至一定階段的共同病理改變，能導(dǎo)致諸多不良后果［16］，也是引起終末期心力衰竭的關(guān)鍵因素。抑制心肌纖維化可改善心血管疾病患者的預(yù)后，但目前針對心肌纖維化的臨床干預(yù)和治療十分有限［17］。

心肌纖維化是缺血、缺氧、炎癥等損傷性因素造成的心臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過量沉積為特征的一種病理過程［18］。成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞是心肌纖維化的中心事件，肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和沉積ECM蛋白，為受損的心臟提供局部機械支持［19］，但 ECM的過度積聚也使心臟失去正常功能。由于肌成纖維細(xì)胞在心肌纖維化中的核心作用，許多研究將抑制肌成纖維細(xì)胞的功能作為心肌纖維化的治療方向［20-21］。

CAR-T細(xì)胞是一種特異T細(xì)胞，其靶向性、殺傷活性和持久性均優(yōu)于機體自然產(chǎn)生的T細(xì)胞，利用CAR-T細(xì)胞特異性地消除肌成纖維細(xì)胞有望成為一種治療心肌纖維化的新方法。為研究CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)是否可靶向肌成纖維細(xì)胞，2019年美國賓夕法尼亞大學(xué)的 Aghajanian等［22］構(gòu)建了心臟成纖維細(xì)胞上表達(dá)人工抗原卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的小鼠，并使用靶向OVA肽的CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的OVA小鼠，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠的心肌纖維化顯著減少。該研究表明CAR-T細(xì)胞可靶向肌成纖維細(xì)胞，可能是一種治療心肌纖維化的有效方法，但還需進(jìn)一步探索CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的最佳靶標(biāo)。

鑒于成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）的表達(dá)是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的重要特征，F(xiàn)AP靶向的CAR-T細(xì)胞已被改造用于治療各種實體瘤，如間皮瘤、肺癌和胰腺癌［23］，且具有一定的療效，說明FAP可作為一個CAR-T細(xì)胞識別的有效靶點。Aghajanian等［22］通過RNA序列數(shù)據(jù)庫，分析心臟病患者左心室組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FAP在衰竭的肥厚型心肌病和擴張型心肌病樣本中的表達(dá)顯著上調(diào)。且發(fā)生纖維化的心臟中肌成纖維細(xì)胞高表達(dá)FAP，因此可設(shè)計一種靶向FAP的CAR-T細(xì)胞特異性消除肌成纖維細(xì)胞，延緩心肌纖維化的進(jìn)程。Aghajanian等［22］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外將小鼠脾臟分離的T淋巴細(xì)胞改造為FAP CAR-T細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到心肌纖維化小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移治療組中小鼠心肌纖維化顯著減少，心臟功能得到改善，且無明顯的毒副作用。在此基礎(chǔ)上，2022年美國賓夕法尼亞大學(xué)的Rurik等［24］通過脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）技術(shù)實現(xiàn)體內(nèi)改造T淋巴細(xì)胞，LNP經(jīng)血液循環(huán)可定向至T淋巴細(xì)胞表面并被胞吞至細(xì)胞內(nèi)，LNP包裹的CAR-mRNAs在胞質(zhì)中逃逸、翻譯及表達(dá)，最終在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生功能化的FAP CAR-T細(xì)胞。不同于慢病毒遞送CAR基因，LNP遞送的CAR-mRNAs未整合到T淋巴細(xì)胞基因組中，而是在胞質(zhì)中翻譯產(chǎn)生CAR分子并表達(dá)至T淋巴細(xì)胞表面。這些CAR分子在T細(xì)胞分裂過程中自然缺失，在改善心肌纖維化的同時也規(guī)避了過度抑制纖維化的問題?；谝陨涎芯浚瑹o論是在體外產(chǎn)生FAP CAR-T細(xì)胞再轉(zhuǎn)移至小鼠體內(nèi)，還是直接在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生FAP CAR-T細(xì)胞都能有效抑制心肌纖維化，改善心臟功能，但這種CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的方法仍處于試驗階段，未來需更多的研究證實其有效性和安全性。此外，CAR-T細(xì)胞治療是否能用于治療其他心血管疾?。ㄈ缧募〔　⑿穆墒С＜皠用}粥樣硬化等）也需進(jìn)一步的分析與探索。

3 CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化面臨的挑戰(zhàn)及對策

3.1 影響CAR-T細(xì)胞治療有效性的相關(guān)因素

CAR分子的結(jié)構(gòu)對T淋巴細(xì)胞的增殖能力及作用時間至關(guān)重要。而CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力及作用時間是影響其治療效果的重要因素。目前具有CD28或4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的第2代CAR-T細(xì)胞是最常用的CAR分子結(jié)構(gòu)。CD28共刺激分子會誘導(dǎo)出一種生命周期短但細(xì)胞殺傷活性較高且分泌大量IL-2等細(xì)胞因子的T細(xì)胞類型。對應(yīng)的，設(shè)計有4-1BB共刺激分子的CAR-T細(xì)胞，雖然其細(xì)胞因子分泌水平較低，但其在體內(nèi)的擴增和持續(xù)性更強。目前在有關(guān)CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的研究中，所使用的均是CD28共刺激分子［22，24］，4-1BB二代CAR-T細(xì)胞靶向消除肌成纖維細(xì)胞的效能如何尚未可知。

CAR-T細(xì)胞耗竭影響其治療的有效性。當(dāng)CAR-T細(xì)胞耗竭時將失去效應(yīng)功能和自我更新能力，影響治療效果。在感染性疾病和腫瘤環(huán)境中存在許多促進(jìn)耗竭的因素，如炎癥、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所衍生的細(xì)胞因子、代謝壓力和持續(xù)性抗原刺激等，調(diào)控這些因素可緩解耗竭，提升CAR-T細(xì)胞的療效［25］。然而在CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化方面暫無T細(xì)胞耗竭的相關(guān)研究，受損和發(fā)生纖維化的心臟中存在的促耗竭因素以及調(diào)控措施需進(jìn)一步探索研究。不同靶點的CAR-T細(xì)胞作用時間有所差異，這與其生長半衰期的長短有重要關(guān)系。在一項使用FAP CAR-T細(xì)胞抗小鼠多種皮下移植瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP CAR-T細(xì)胞的生長半衰期很短［26］，治療心肌纖維化時二次注射FAP CAR-T細(xì)胞可延長其作用時間，治療第8周時仍可有效抑制纖維化［22］。因此，對于半衰期較短的CAR-T細(xì)胞可通過重復(fù)治療的手段達(dá)到持久治療的目的。

抗原逃逸及產(chǎn)生抗性將嚴(yán)重降低CAR-T細(xì)胞的治療效果。在CAR-T細(xì)胞治療中，腫瘤細(xì)胞上的靶抗原可能發(fā)生丟失，CAR-T細(xì)胞將無法有效識別和清除腫瘤細(xì)胞，稱為抗原逃逸。也有一些腫瘤細(xì)胞通過降低抗原密度、抗原編碼基因突變、譜系轉(zhuǎn)換［27］等逃避CAR-T細(xì)胞的攻擊，進(jìn)而影響療效，使腫瘤患者不能獲得長期緩解。針對這些導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)生抗性的問題，發(fā)現(xiàn)新的靶抗原十分重要。有研究［28］表明，不同亞群的成纖維細(xì)胞可能以細(xì)胞特異性的方式對不同的損傷模型作出反應(yīng)。例如，在心肌梗死等缺血性損傷中，心外膜來源的成纖維細(xì)胞可能在驅(qū)動左心室前壁區(qū)域性嚴(yán)重纖維化中發(fā)揮重要作用。而壓力超負(fù)荷后容易發(fā)生嚴(yán)重纖維化的區(qū)域，心內(nèi)膜來源的成纖維細(xì)胞比心外膜來源的成纖維細(xì)胞增殖更明顯。成纖維細(xì)胞的遺傳清除可明顯減少其增殖，減輕心肌纖維化的嚴(yán)重程度，并減緩心臟功能下降的進(jìn)程。因此，尋找不同亞群成纖維細(xì)胞表面的特異性表達(dá)抗原，設(shè)計更具特異性的CAR分子，可實現(xiàn)針對不同病因下心肌纖維化的CAR-T細(xì)胞治療，增強其治療的有效性。

3.2 CAR-T細(xì)胞治療的安全性

細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T細(xì)胞治療時最常見的不良反應(yīng)，是由于淋巴細(xì)胞活化導(dǎo)致的大量細(xì)胞因子（如IL-6、γ干擾素等）釋放而引起的全身炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致血管擴張性休克、毛細(xì)血管滲漏等，進(jìn)而導(dǎo)致器官受損，最終危及生命［29］。臨床上常用托珠單抗，阻斷IL-6受體及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而緩解CRS。而CAR分子的結(jié)構(gòu)與CRS的發(fā)生有重要的聯(lián)系，如CD28共刺激結(jié)構(gòu)域較4-1BB更易引發(fā)CRS，設(shè)計細(xì)胞因子釋放較低的CAR分子，將是解決CRS最有潛力的方法。在CAR分子中引入IL-6短發(fā)夾RNA序列，可產(chǎn)生IL-6敲低的CAR-T細(xì)胞，從而減少了IL-6的釋放和CRS的發(fā)生，且不影響其治療效果［30］。在CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的臨床前研究中，尚無對CAR分子的特殊設(shè)計，且在治療中并無CRS產(chǎn)生［22］，這奠定了CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的安全基礎(chǔ)，但設(shè)計安全性更高的CAR分子對其向臨床研究及應(yīng)用轉(zhuǎn)換十分重要。

脫靶效應(yīng)是指CAR-T細(xì)胞在攻擊靶細(xì)胞時，誤傷了同樣表達(dá)靶抗原的正常組織細(xì)胞，從而引起正常組織損傷，是CAR-T細(xì)胞治療最主要的副作用來源之一。肌成纖維細(xì)胞表面的FAP已被作為CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化的靶點，但FAP在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中同樣高表達(dá)，因此，通過CAR-T細(xì)胞系統(tǒng)性清除FAP表達(dá)陽性的細(xì)胞可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血、骨量減少及惡病質(zhì)狀態(tài)［31］?；诖?，尋找更有效、更安全的靶點是CAR-T細(xì)胞治療心肌纖維化實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)換的重要前提。

雖然通過CAR-T細(xì)胞可消除肌成纖維細(xì)胞，減輕心肌纖維化，但肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的ECM對損傷部位的修復(fù)十分重要，纖維化不足會導(dǎo)致受損部位失去正常的機械支撐，在心臟中可能會發(fā)生心室擴張，甚至破裂的情況，在皮膚等其他器官中可能會導(dǎo)致愈合不良。因此在達(dá)到療效的同時也要避免過度地消除肌成纖維細(xì)胞。具有可控性的CAR-T治療策略是一個值得研究和發(fā)展的方向。通過在CAR分子中加入一個“開關(guān)”，可精確地調(diào)控治療的部位、持續(xù)的時間和強度［32］。其中，基于小分子的“開關(guān)”已成功應(yīng)用于多項CAR分子設(shè)計［33］?；诋惲蚯杷釤晒馑?葉酸的“開關(guān)”，可通過時空和劑量依賴性的方式充當(dāng)CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的擬免疫突觸，將CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_啟”狀態(tài)。利用雷帕霉素誘導(dǎo)FKBP12和FRB結(jié)合域的組裝可控制CAR-T細(xì)胞的激活。rimiducid可誘導(dǎo)胱天蛋白酶-9二聚化并促進(jìn)過度活化的CAR-T細(xì)胞凋亡。因此，小分子有望通過人為地在“開”和“關(guān)”狀態(tài)之間切換，賦予CAR-T細(xì)胞功能靈活性。其次，使用非病毒技術(shù)可實現(xiàn)T細(xì)胞中CAR的瞬時表達(dá)，確保了CAR-T細(xì)胞治療的有限持久性。目前較為常見的非病毒技術(shù)包括轉(zhuǎn)座子和mRNA載體技術(shù)等［34］。2022年，賓夕法尼亞大學(xué)團隊利用LNP作為FAP CAR-mRNAs的載體在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了瞬時表達(dá)CAR分子的T細(xì)胞，避免了過度抑制纖維化的問題［24］。

4 總結(jié)與展望

CAR-T細(xì)胞治療作為現(xiàn)階段最值得研究和發(fā)展的細(xì)胞免疫療法已在血液腫瘤的治療中發(fā)揮出了顯著的療效，并且在治療實體瘤及非腫瘤疾病中也有重大突破，而CAR-T細(xì)胞在心肌纖維化的治療中也有著巨大的潛力。雖然目前多數(shù)CAR-T細(xì)胞治療尚處于實驗室研究或臨床前試驗階段，而且在心肌纖維化中的研究尚少，但隨著mRNA載體、電穿孔、基因編輯和細(xì)胞制造等技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善，有望設(shè)計出兼顧高效性和安全性、更適用于心肌纖維化治療及能更加精準(zhǔn)調(diào)控的CAR-T細(xì)胞，為治療心肌纖維化提供新的研究思路和方向。

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