蘿卜硫素對放射性心肌損傷的防護作用

王鶴儒 鄭慶霜 夏彬鳳 崔明月 尹霞

摘要 目的： 探索蘿卜硫素（SFN）對放射性心肌損傷的潛在防護作用及機制。 方法： 將8周齡雄性ICR小鼠隨機分為 對照組、電離輻射組（IR組）、IR＋SFN組，每組5只。IR組及IR＋SFN組均于心臟定位后使用深部X射線治療機對小鼠進行心臟照射（225 kV/13.33 mA 高能X線，射線予以3 mm鋁及1.85 mm銅過濾，直徑為1 cm的圓形的輻射場，劑量率為1 Gy/min，總劑量為2 000 cGy/20 Gy），未照射部位使用1 cm厚的鉛板遮擋。IR＋SFN組小鼠接受照射24 h后予以皮下注射SFN（0.5 mg/kg），每周5 d。4周后采用超聲心動圖測定心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)［左心室內(nèi)徑（LVID）］及功能指標(biāo)［左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）］、心肌纖維化指標(biāo)［天狼星紅染色、結(jié)締組織生長因子（CTGF）］、心肌脂質(zhì)過氧化指標(biāo)［丙二醛（MDA）］、心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)［裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase.3）］。蘇木精.伊紅（HE）染色觀察心肌結(jié)構(gòu)，測定心肌組織中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）表達。 結(jié)果： 給藥結(jié)束后，與對照組比較，IR組與IR＋SFN組小鼠LVID增大，LVEF、LVFS下降，心肌組織CTGF、Cleaved ?Caspase.3表達及MDA含量升高（ P ＜0.05）， 心肌組織存在明顯的病理損傷，其中IR組上述指標(biāo)變化更顯著。與IR組比較，IR＋SFN組LVID縮小，LVEF、LVFS提高，心肌組織中CTGF、Cleaved Caspase.3表達及MDA含量均下降（ P ＜0.05），病理損傷減輕。與對照組比較，IR組及 IR＋SFN組Nrf2表達升高（ P ＜ 0.05），其中IR＋SFN組更顯著。 結(jié)論： 輻射可引起小鼠心肌損傷、心臟結(jié)構(gòu)改變及心功能減低，SFN可抑制輻射造成的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激，從而減輕心肌組織損傷，改善心功能，對心肌有一定的保護作用，該作用可能與Nrf2表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 ?放射性心肌損傷；蘿卜硫素；心臟功能；心臟結(jié)構(gòu)；心功能；小鼠；實驗研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.011

放射在較多腫瘤的治療中具有明確的作用，在此過程中部分病人心臟不可避免地受到了照射 ?［1］ 。由電離輻射（ion.irradiation，IR）導(dǎo)致的心臟損傷稱為放射 性心臟損傷，臨床表現(xiàn)為心包疾病、心臟血管病變、傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病、心肌疾病、心臟瓣膜疾病等，這些心血管相關(guān)疾病統(tǒng)稱為放療導(dǎo)致的心臟疾?。╮adiation.induced heart disease，RIHD） ?［2］ 。多項研究表明，放療可使各類心臟疾病及心血管事件的發(fā)生風(fēng)險升高，心臟接受的輻射劑量被認(rèn)為是不良心血管事件和全因死亡風(fēng)險的影響因素。RIHD有臨床表現(xiàn)前可有10年以上的潛伏期，相關(guān)癥狀表現(xiàn)時心臟已出現(xiàn)不可逆損傷 ?［3.4］ 。放療技術(shù)的改進及方案的優(yōu)化是RIHD的一級預(yù)防，不能使心臟受照射劑量完全降為零，因此，必須接受放療的病人早期預(yù)防及后期治療極為重要 ?［5.7］ 。目前，尚無成熟的藥物預(yù)防或治療放射性心肌損傷，因此，亟需探討放射性心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展機制， 研發(fā)新型藥物以預(yù)防和減輕放療給心臟帶來的損傷。

心肌暴露于輻射后，水輻解可產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）。機體內(nèi)源性抗氧化能力不足以清除過量的ROS和RNS時導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而引起心肌損傷。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是RIHD的主要發(fā)病機制之一，抑制氧化應(yīng)激可能是減輕放射性心臟損傷的有效方法 ?［8］ 。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）是一種抗氧化劑，其抑制氧化應(yīng)激不僅依賴于某一抗氧化酶，而是通過激活抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子——核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2.related factor 2，Nrf2）啟動內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)抵抗氧化損傷，有效預(yù)防或抑制各種因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激相關(guān)心臟損傷，現(xiàn)已廣泛用于氧化應(yīng)激相關(guān)心血管疾病的基礎(chǔ)研究 ?［9.10］ 。尚無證據(jù)表明SFN是否能減輕放射性損傷。本研究旨在探討SFN是否通過激活Nrf2減輕放射性心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

8周齡雄性ICR小鼠，體質(zhì)量約28 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.1.2 實驗試劑及器材

SFN（源葉生物，中國），Nrf2抗體（CST，美國），結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF） 抗體（Abcam，美國），裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase.3）抗體（CST，美國），丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒（萬類生物，中國），內(nèi)參抗體β.actin（wanleibio，中國），天狼 星紅染液（Solarbio，中國），X射線治療機（A84XOV XSZ.220/20， 康嘉儀器設(shè)備有限公司，中國），超聲心動儀（SONOS 5500，Philips，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 放射性心臟損傷模型及SFN治療模型的構(gòu)建

將ICR小鼠隨機分為對照組、IR組、IR＋SFN組，每組5只。IR組及IR＋SFN組均于心臟定位后使用深部X射線治療機對小鼠進行心臟照射（225 kV/13.33 mA高能X線，射線予以3 mm鋁及1.85 mm銅過濾，直徑為1 cm的圓形輻射場，劑量率為1 Gy/min，總劑量為2 000 cGy/20 Gy），未照射部位使用1 cm厚的鉛板遮擋；IR＋SFN組小鼠于次日皮下注射SFN（0.5 mg/kg），每周5 d，持續(xù)給藥4周。對照組使用相同方法處理，照射劑量為0 Gy。上述動物模型構(gòu)建已獲得吉林大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，遵循國家有關(guān)實驗動物保護與使用準(zhǔn)則。

1.2.2 心臟功能評價

第4周時，將小鼠麻醉后剔除胸部毛發(fā)，采用Philips SONOS 5500高效超聲系統(tǒng)監(jiān)測心臟功能。仰臥位固定小鼠，利用30 MHz高頻探頭，經(jīng)胸骨旁長軸切面記錄M型超聲心動圖像，測量心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)［左心室內(nèi)徑（LVID）］及功能指標(biāo)［左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）］。

1.2.3 蘇木精.伊紅（HE）染色

處死小鼠后，將部分心臟固定于10%甲醛中；經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋后制作為3 μm厚的石蠟切片，切片經(jīng)純乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明；最后使用樹膠及蓋玻片固封、晾干。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 天狼星紅染色

將上述石蠟切片滴加天狼星紅飽和苦味酸水溶液進行染色。水洗、脫水后浸于二甲苯中使其透明；用中性樹膠將切片固封、涼干。使用光學(xué)顯微鏡進行觀察及拍照；采用Image J圖像分析軟件計算膠原面積占整個心肌面積的百分比。

1.2.5 蛋白免疫印記法

裂解樣本得到蛋白質(zhì)抽提物，定量蛋白后將蛋白通過十二烷基硫酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）分離后轉(zhuǎn)EP到聚偏乙烯膜（PVDF）上，用10%的脫脂奶粉溶液封閉1 h后，分別使用抗Nrf2、Cleaved Caspase.3及CTGF和內(nèi)參β.actin抗體4 ℃孵育過夜，置于二抗于室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，圖像處理分析軟件（Image J）對各組小鼠心肌Nrf2和β.actin蛋白進行定量分析。

1.2.6 MDA含量檢測

將1.2.5步驟中得到的濃度相同的蛋白稀釋液試劑按照說明書加入干凈的試管中混勻，使用保鮮膜扎緊試管口，用針頭刺一小孔，95 ℃沸水浴40 min。冷卻后離心，取上清液測試吸光度（532 nm處，1 cm光徑，測試前用蒸餾水調(diào)零），確定MDA的表達（具體步驟按說明書進行）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，采用方差分析；蛋白條帶的灰度值采用Image J軟件進行分析。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SFN可抑制IR所致的心臟結(jié)構(gòu)和功能改變

給藥第4周，與對照組比較，IR組收縮期及舒張期LVID增加，LVEF、LVFS降低（ P ＜0.05）；與IR組比較，IR＋SFN組小鼠LVID減小，LVEF、LVFS增加（ P ＜0.05）。詳見圖1。

2.2 SFN可抑制IR導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)紊亂

對照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、橫紋清晰，細(xì)胞間質(zhì)未見血管擴張及炎性細(xì)胞浸潤；IR組可見心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞外纖維成分增多，炎性細(xì)胞浸潤；IR＋SFN組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤程度有所減輕。詳見圖2。

2.3 SFN可抑制IR導(dǎo)致的心肌纖維化

天狼星紅染色顯示：與對照組比較，IR組小鼠心肌組織血管周圍及心肌間質(zhì)可見膠原纖維沉積；與IR組小鼠比較，IR＋SFN組心肌膠原組織沉積減輕。詳見圖3A、3B。與對照組比較，IR組心肌組織心肌纖維化特異性指標(biāo)CTGF表達增高；與IR組比較，IR＋SFN組CTGF表達下調(diào)（ P ＜0.05）。詳見圖3C、3D。

2.4 SFN可抑制心肌細(xì)胞凋亡

與對照組比較，IR組Cleaved Caspase.3表達上調(diào)（ P ＜0.05）；與IR組比較，IR＋SFN組心肌組織Cleaved Caspase.3表達下降（ P ＜0.05）。詳見圖4。表明SFN干預(yù)可抑制IR引起的心肌細(xì)胞凋亡。

2.5 SFN可抑制IR導(dǎo)致的心肌脂質(zhì)過氧化

與對照組比較，IR組心 肌組織MDA含量增加（ P ＜ 0.05）；與IR組比較，IR＋SFN組心肌組織MDA含量降低（ P ＜0.05）。詳見圖5。表明SFN可抑制IR引起的心肌脂質(zhì)過氧化。

2.6 SFN使心肌組織內(nèi)Nrf2表達升高

與對照組比較，IR組Nrf2表達增加（ P ＜0.05）；與IR 組比較，IR＋SFN組Nrf2進一步提高（ P ＜0.05）。 詳見圖6。

3 討 論

抗氧化劑是抵抗ROS損害的第一道防線，分為內(nèi)源性抗氧化劑和外源性抗氧化劑，可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞免受氧化損傷。外源性抗氧化劑由體外補充，內(nèi)源性抗氧化劑多為酶抗氧化劑，由機體自行產(chǎn)生，因此，酶抗氧化劑的表達可被較多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控 ?［11］ 。目前，針對RIHD防護劑的研究多集中于外源性抗氧化劑，雖然多數(shù)研究結(jié)果表明外源性抗氧化劑可減輕RIHD，因作用短暫及潛在的副作用使其未廣泛應(yīng)用于臨床 ?［12.14］ 。因此，調(diào)動內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)以維持機體的抗氧化能力，減輕放射性心臟損傷可能是一種有效的治療方法。

SFN是一種異硫氰酸酯類化合物，多從十字花科蔬菜中提取，是一種強效的Nrf2激活劑。Nrf2被SFN激活的經(jīng)典方式是其Keap1 BTB區(qū)第151位半胱氨酸殘基被SFN氧化修飾，使其與Nrf2解偶聯(lián)，故穩(wěn)定游離態(tài)的Nrf2在心肌細(xì)胞中上調(diào) ?［9］ 。多項研究表明，SFN可預(yù)防或抑制多種因素引起的氧化應(yīng)激相關(guān)心臟損傷，廣泛用于氧化應(yīng)激相關(guān)心血管疾病的基礎(chǔ)研究 ?［15.16］ 。因此，SFN可能是一種強大有效的RIHD防護劑，對心臟的保護性作用亦可能與Nrf2的激活密切相關(guān)。

基于上述假設(shè)，本研究予以小鼠接受IR及SFN干預(yù)，并從分子、細(xì)胞、器官進行了相關(guān)分析。MDA含量是評估心肌脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，與IR組比較，IR＋SFN組小鼠心肌細(xì)胞MDA表達降低，表明SFN的干預(yù)可抑制心肌脂質(zhì)過氧化，降低氧化應(yīng)激水平。其次，IR導(dǎo)致的氧化應(yīng)激條件下心肌中過量ROS引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能障礙，這是IR誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的主要機制 ?［17.19］ 。

Caspase家族的關(guān)鍵核心酶Caspase.3是心肌細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，IR＋SNF組較IR組小鼠心肌組織內(nèi)Cleaved Caspase.3表達明顯下調(diào)，提示SFN可抑制IR引起的心肌細(xì)胞凋亡。ROS可上調(diào)CTGF表達，增加膠原的合成，促進心肌纖維化 ?［12］ 。本研究結(jié)果顯示，IR＋SFN組心肌CTGF表達較IR組下調(diào)，天狼星紅染色結(jié)果亦表明SFN干預(yù)后小鼠心肌膠原纖維沉積程度減輕，說明SFN可抑制IR引起的心肌纖維化。本研究應(yīng)用超聲心動圖檢查證實了SFN的干預(yù)可減輕心臟結(jié)構(gòu)改變，心功能降低?？梢?，SFN對IR引起的心肌損傷有明確的保護作用，并減輕由此引起的心功能下降。本研究同時測定了各組小鼠心肌組織Nrf2表達，IR組較對照組Nrf2表達上調(diào)；接受SFN干預(yù)的小鼠心肌組織Nrf2表達較IR組進一步上調(diào)。認(rèn)為小鼠接受IR暴露后Nrf2表達上調(diào)可能是由于心肌組織為抵抗氧化應(yīng)激代償性升高；在上述基礎(chǔ)上，SFN干預(yù)將激活Nrf2，增強了心肌抗氧化能力，從而抑制IR引起的氧化應(yīng)激，減輕心肌損傷。

綜上所述，SFN對放射性心肌損傷有明確的保護性作用。該作用可能與上調(diào)心肌組織Nrf2的表達有關(guān)。SFN在體內(nèi)心臟模型中展現(xiàn)出來的保護作用使 其成為RIHD持續(xù)、有效、無毒的保護策略提供了 依據(jù)。

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（收稿日期：2023.02.07）

（本文編輯 薛妮）