生姜多糖的提取及抗氧化作用研究

孟憲偉 羅亮 孫源 趙志剛 王世會 張瑞 郭坤

摘要 采用超聲輔助提取法從生姜中提取多糖，采用單因素和正交試驗對生姜多糖提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生姜多糖最佳提取工藝為液料比1∶20，勻漿時間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲時間80 min為宜，超聲溫度80 ℃，超聲波功率為100 W，在該條件下多糖得率為12.56%?？寡趸钚詼y定結(jié)果表明，生姜多糖在5 mg/mL時對羥基自由基的清除能力可達到90.96%，且還原力最強。

關(guān)鍵詞 生姜多糖；提取；結(jié)構(gòu)表征；抗氧化作用

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）11-0149-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.032

Study on Extraction and Antioxidant Effect of Polysaccharide from Zingiber officinale Roscoe

MENG Xian-wei1，2， LUO Liang2， SUN Yuan1 et al

（1. Research Center of Pharmaceutical Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin， Heilongjiang 150076；2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Harbin， Heilongjiang 150070）

Abstract Ultrasonic assisted extraction method was used to extract polysaccharide from Zingiber officinale Roscoe. First， single factor and orthogonal test were used to optimize the extraction process of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide. The experimental results showed that the optimal extraction process of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide was as follows： liquid to material ratio 1∶20， homogenization time 5 min， homogenization temperature 70 ℃， ultrasonic time 80 min and ultrasonic temperature 80 ℃. Under the condition of ultrasonic power of 100 W， the yield of polysaccharide was 12.56%. Then， the antioxidant activity of the extracted Zingiber officinale Roscoe polysaccharide was determined. The experimental results showed that the hydroxyl radical scavenging ability of Zingiber officinale Roscoe polysaccharide reached 90.96% at 5 mg/mL， and the reducing power was the strongest.

Key words Zingiber officinale Roscoe polysaccharide;Extraction;Structural characterization;Antioxidation

基金項目 哈爾濱商業(yè)大學青年學術(shù)骨干支持計劃項目（2020CX10）；黑龍江省省屬高等學?；究蒲袠I(yè)務(wù)費科研項目（2023-KYYWF-1036）；黑龍江省博士后科研啟動金項目（BS0062）。

作者簡介 孟憲偉（1993—），女，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，研究方向：中藥提取分離及活性。*通信作者，助理研究員，博士，從事環(huán)境微生物學研究。

收稿日期 2023-06-20；修回日期 2023-08-02

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為多年生草本植物的新鮮根莖，作為傳統(tǒng)藥用和食用植物被人們廣泛熟知，也是屬于有價值的烹飪香料之一，具有廣泛的應(yīng)用前景。生姜包含多種化學成分，如黃酮、二苯基庚烷類化合物、姜黃素、姜辣素、姜精油、多糖等［1-2］。研究表明，生姜具有廣泛的生物活性，如抗氧化［3］、抗炎［4］、抗菌［5］、抗腫瘤［6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、降血脂血糖［8］、調(diào)節(jié)腸道菌群［9］等藥理活性。多糖作為生姜活性化學成分之一，具有較高的研究價值。生姜多糖可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，降低糖尿病小鼠的血糖［10］，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［11］，抑制癌細胞生長通過誘導(dǎo)其凋亡起到抗腫瘤作用［12-13］。生姜多糖還具有抗氧化［14-15］，免疫調(diào)節(jié)［16-17］，抗凝血［18］，抗疲勞［19］等生物活性功能。但目前關(guān)于生姜的研究大多集中在黃酮類［20-21］、姜辣素［22-23］、姜精油［24］等化學成分上，對從生姜中提取多糖的研究較少，限制了其進一步的開發(fā)應(yīng)用。筆者采用濕法勻漿協(xié)同超聲波提取生姜多糖，先將生姜進行濕法勻漿，采用超聲輔助提取法得到多糖，通過勻漿快速提取使有效成分溶出，再通過超聲提取時超聲波產(chǎn)生的振動作用使有效成分進一步釋放、擴散和溶解，可以縮短提取時間，增加提取效率。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交提取法得到最佳工藝，并測定其抗氧化活性作用，以期為生姜多糖的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生姜（市售）；實驗室水為蒸餾水；氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，以上均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲儀，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分光光度計，購自屹譜儀器制造（上海）有限公司；電子天平，購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；冷凍干燥機，購自北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；高速冷凍離心機，購自安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.3 生姜多糖提取工藝

清洗→切片→烘干→精密稱取干品→勻漿→超聲提取→離心→濃縮→醇沉→冷凍干燥→測定提取率。

1.4 單因素試驗

1.4.1 液料比對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察液料比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）時對生姜多糖得率的影響。

1.4.2 勻漿溫度對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察勻漿溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃時對生姜多糖得率的影響。

1.4.3 勻漿時間對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿溫度70 ℃，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察勻漿時間分別為 3、4、5、6、7 min時對生姜多糖得率的影響。

1.4.4 超聲時間對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，超聲溫度70 ℃，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察超聲時間分別為60、70、80、90、100 min時對生姜多糖得率的影響。

1.4.5 超聲溫度對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，超聲時間80 min，超聲功率設(shè)置在100 W條件下，考察超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時對生姜多糖得率的影響。

1.4.6 超聲功率對生姜多糖得率的影響。

取生姜干品3份，液料比1∶25，在勻漿溫度70 ℃下勻漿5 min，在超聲溫度70 ℃下超聲80 min條件下，考察超聲功率分別為60、70、80、90、100 W時對生姜多糖得率的影響。提取率下式計算：

多糖得率（%）=提取的多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.5 生姜多糖正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取顯著的影響因素，采用 L9（34）正交試驗，每組試驗平行3次，取生姜多糖提取率平均值進行極差分析（表1）。

1.6 生姜多糖純化

將上述所得多糖溶于水，加入1/3體積Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配），劇烈振蕩20 min，充分靜止，除去有機相及蛋白與有機溶劑產(chǎn)生的蛋白變性物質(zhì)，收集上層水相溶液，重復(fù)2～5次直至無蛋白析出。將脫蛋白后的溶液進行活性炭粉末脫色，3 500 Da透析袋進行透析，將得到的溶液加入4倍量無水乙醇4 ℃靜置24 h，離心（4 000 r/min）10 min，棄去上清液取沉淀，干燥得生姜多糖粉末。

1.7 生姜多糖含量測定

1.7.1 葡萄糖標準曲線繪制。

生姜多糖含量測定采用苯酚硫酸法，精密稱取葡萄糖干燥恒重，配制葡萄糖對照品溶液（0.1 mg/mL），分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，用蒸餾水補至2.0 mL，依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，充分渦旋混勻，冷卻至室溫。用2 mL蒸餾水代替對照品溶液，作空白對照，按上述方法操作。在490 nm波長處測定溶液的吸光度，縱坐標為吸光度，橫坐標為葡萄糖濃度（mg/mL），繪制標準曲線，得到回歸方程y=6.403 6x-0.042 0，R2=0.999 1。

1.7.2 生姜多糖含量計算。

按“1.7.1”中的方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線并計算供試液中葡萄糖的含量，按如下公式計算多糖含量：

D=（C×V×B）×0.9/M×100%

式中：C為測得吸光度對應(yīng)的濃度，mg/mL；

V為提取液體積，mL；

B為稀釋倍數(shù)；

0.9為葡萄糖換算成多糖正交系數(shù)；

M為原料質(zhì)量，mg。

1.8 生姜多糖體外抗氧化作用研究

1.8.1 羥自由基清除能力測定。

參照王振斌等［25］的方法并加以修改進行測定，吸取2.0 mL不同濃度生姜多糖溶液（1、2、3、4、5 mg/mL）依次加入FeSO4溶液（6 mmol/L）2.0 mL，水楊酸溶液（6 mmol/L）2.0 mL和過氧化氫溶液（6 mmol/L）2.0 mL，放置在37 ℃水浴鍋中30 min，在510 nm 處測定其吸光度（A1）。按上述同樣方法操作，用雙蒸水替代水楊酸溶液測定空白組吸光度（A0），用雙蒸水替代生姜多糖溶液測定空白對照組吸光度（A2）。按下列公式計算生姜多糖對羥自由基的清除率。

清除率%=［1－（A1-A2）/A0］×100%

1.8.2 還原力測定。

參照王振斌等［25］的方法并加以修改進行測定，吸取1.0 mL不同濃度生姜多糖溶液（1、2、3、4、5 mg/mL），依次加入2.5 mL pH為6.6的磷酸緩沖液（0.2 mol/L），1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，50 ℃水浴20 min后，加入10%三氯乙酸2.5 mL，離心（3 000 r/min）10 min。取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL，0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，室溫下放置10 min等待反應(yīng)，在700 nm處測定吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，GraphPad PrismV 9.0軟件繪圖。試驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜多糖單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對生姜多糖提取的影響。

從圖1可知，液料比在1∶15～1∶25時，多糖的提取率呈上升趨勢，在1∶25時，多糖的提取率達到11.75%，但隨著液料比繼續(xù)增大，多糖的提取率呈下降趨勢。

2.1.2 勻漿時間對生姜多糖提取的影響。

從圖2可知，隨著生姜勻漿時間延長，生姜多糖的提取率呈先增大后降低趨勢，勻漿時間5 min時，提取率可達到10.94%，但隨著勻漿時間繼續(xù)延長時，提取率降低，說明隨著勻漿時間的延長，多糖的溶出率增大，同時除多糖以外的物質(zhì)溶出，從而降低多糖提取率。

2.1.3 勻漿溫度對生姜多糖提取的影響。

由圖3可知，隨著勻漿溫度升高，生姜多糖提取率呈先增大后降低的趨勢，勻漿溫度在70 ℃時，提取率為11.29%，當勻漿溫度超過70 ℃時，多糖提取率也隨之降低。這說明溫度升高加快分子效應(yīng)，加劇生姜的細胞壁破壞，促使多糖釋放，但溫度過高破壞多糖的結(jié)構(gòu)，不利于多糖溶出，降低提取率。

2.1.4 超聲時間對生姜多糖提取的影響。

從圖4可知，在超聲時間為80 min時，多糖提取率最大，達12.22%，但隨著超聲時間的延長，提取率降低。這說明延長超聲時間，多糖可以更好地溶入提取溶劑中，促進多糖從生姜細胞壁中溶出，但是時間過長會促使多糖降解，降低提取率。

2.1.5 超聲溫度對生姜多糖提取的影響。

從圖5可知，超聲溫度升高，生姜多糖提取率逐漸增大，超聲溫度在80 ℃時，生姜多糖提取率為12.45%?？梢?，較高溫度有利于多糖濃度提高。

2.1.6 超聲功率對生姜多糖提取的影響。

從圖6可知，超聲功率增大時，多糖的提取率逐漸增大，在100 W時，多糖提取率達到11.25%。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2的正交試驗結(jié)果可知，超聲功率（D）對生姜多糖提取的影響最大，其次依次是液料比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）。提取工藝最佳組合為A1B3C1D1，各因素對生姜多糖提取率的影響表現(xiàn)為D>A>B>C。

2.3 驗證試驗

對生姜多糖的最佳提取工藝進行驗證，并根據(jù)實際試驗和儀器條件，得到最佳提取條件為料液比1∶20，勻漿時間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲時間80 min，超聲溫度80 ℃，超聲功率為100 W，稱取3份2 g生姜多糖粉末，在最優(yōu)工藝條件下試驗，測得生姜多糖平均含量為43.62%，說明該工藝組合較穩(wěn)定，可行性高。

2.4 生姜多糖體外抗氧化試驗結(jié)果

2.4.1 羥自由基清除能力。

由圖7可知，生姜多糖濃度在1～5 mg/mL，隨著多糖濃度增加，生姜多糖羥自由基清除能力逐漸增強，清除率從38.05%升高到90.96%，說明生姜多糖對羥自由基具有清除作用。但與VC相比，生姜多糖對羥自由基的清除能力仍有較大差距。

2.4.2 還原力。

從圖8可知，隨著生姜多糖濃度的升高，還原力逐漸升高，在5 mg/mL時，吸光度可達到2.155，但還原力仍弱于VC，VC在5 mg/mL時可達到2.565。

3 結(jié)論與討論

目前，生姜多糖的提取工藝主要有傳統(tǒng)水提法［26］、堿液提取法［27］、酶提取法［28］、超聲輔助提取法［29］、微波提取法［30］、超聲細胞研磨機提取［31］。該試驗在單因素和正交試驗提取生姜多糖工藝中，生姜多糖最佳提取工藝條件為液料比在1∶20，勻漿時間5 min，勻漿溫度70 ℃，超聲80 min，超聲溫度在80 ℃，超聲功率100 W，在該條件下生姜多糖得率為12.56%，生姜多糖含量為43.62%。相較于林敏等［32］采用超聲提取法和趙文竹等［33］采用傳統(tǒng)方法熱水提取法，將生姜多糖進行濕法打漿后超聲輔助提取，可以大大提高生姜多糖提取率，進一步優(yōu)化提取條件，有利于今后生姜多糖的應(yīng)用和發(fā)展。

機體一直與外界接觸，因輻射、紫外線、環(huán)境污染、化學藥物濫用和情緒問題等因素［34］，使機體內(nèi)存在過量的自由基，產(chǎn)生癌癥、糖尿病、衰老、老年癡呆癥、帕金森病以及炎癥等疾?。?5-38］。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，天然化合產(chǎn)物有很好的抗氧化，可去除過量自由基，具有廣泛的應(yīng)用前景。中藥多糖作為抗氧化劑，是目前的研究熱點之一，多糖具有天然、無毒副作用等優(yōu)點，有著較好的抗氧化作用［39-41］。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著生姜多糖濃度的增加，對羥自由基活性清除能力和還原力增強，生姜多糖具有較好的抗氧化作用。生姜多糖作為一種天然抗氧化劑，應(yīng)用于食品、水產(chǎn)動物飼料添加劑、保健品等方面，具有很好的開發(fā)價值。該研究為生姜多糖的后續(xù)研究提供理論依據(jù)，其結(jié)構(gòu)特征、化學成分、生物活性作用機制還需進一步研究。

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