ELISA方法測(cè)定重組人表皮生長(zhǎng)因子滴眼液中rhEGF含量

摘 要 目的：建立重組人表皮生長(zhǎng)因子（rhEGF）滴眼液中rhEGF含量的檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法：應(yīng)用商品化試劑盒Quantikine ELISA，采用酶聯(lián)免疫定量測(cè)定技術(shù)（ELISA）測(cè)定樣品中的rhEGF含量。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為20～200 pg/mL；中間精密度所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為14.98%（n=9）。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率分別為94.08%、100.46%、104.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為11.03%、9.85%、8.75%（n=3），重復(fù)檢測(cè)10次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.58%。結(jié)論：該研究建立的ELISA方法專屬性強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均良好，適用于重組人表皮生長(zhǎng)因子滴眼液中rhEGF含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 重組人表皮生長(zhǎng)因子 ELISA 滴眼液

中圖分類號(hào)：R927.2； R988.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）05-0077-04

引用本文 張軍， 李玉柱， 樊婷婷. ELISA方法測(cè)定重組人表皮生長(zhǎng)因子滴眼液中rhEGF含量[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（5）： 77-80.

Determination of recombinant human epidermal growth factor （ rhEGF） content in rhEGF eye drops by ELISA

ZHANG Jun1， LI Yuzhu2， FAN Tingting1，2

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of rhEGF content in rhEGF （ recombinant human epidermal growth factor） eye drops and perform method validation. Methods： The content of rhEGF in eye drops was determined using a commercial kit Quantikine by enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. Results： The linear range of the standard curve was 20-200 pg/mL. The relative standard deviation （RSD） of intermediate precision was 14.98% （n=9）. The average recoveries of low， medium， and high concentrations of samples were 94.08%， 100.46% and 104.89% with RSD 11.03%， 9.85%， 8.75% （n=3）， respectively. The RSD for 10 replicates was 5.58%. Conclusion： The ELISA method established in this study has a good specificity， precision， accuracy and stability， and is suitable for the determination of the content of rhEGF in rhEGF eye drops.

KEY WORDS rhEGF； ELISA； eye drop

重組人表皮生長(zhǎng)因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）是由53個(gè)氨基酸組成的活性多肽，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，能促進(jìn)各種表皮組織生長(zhǎng)，應(yīng)用廣泛。在醫(yī)學(xué)上用于燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷及角膜損傷等的治療。添加至美容護(hù)膚品中可達(dá)到美白、抗皺、延緩衰老等作用。目前，國(guó)內(nèi)市售的rhEGF及其衍生物劑型，包括溶液劑、凍干粉、凝膠劑、滴眼液等，均為外用制劑[1-2]。

目前制劑中rhEGF含量的檢測(cè)方法為中國(guó)藥典2020版三部收錄的rhEGF生物活性測(cè)定方法中的3T3細(xì)胞增殖法[3-4]。生物學(xué)活性檢測(cè)是評(píng)價(jià)生物技術(shù)藥物有效性的重要手段，在rhEGF相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制中至關(guān)重要。但是該方法具有明顯的缺點(diǎn)：涉及有毒試劑、信噪比較低、且采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法而使實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，結(jié)果重復(fù)性也較差。因此，有必要開發(fā)檢測(cè)快速、準(zhǔn)確度高的新方法。而類似于雙抗體夾心的方法[5-7]，能快速檢測(cè)樣品中的rhEGF含量，且檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度較高，對(duì)rhEGF的快速檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)作用。

本研究參考中國(guó)藥典2020年版[4]通則179及《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》[8]的相關(guān)內(nèi)容，采用酶聯(lián)免疫定量測(cè)定技術(shù)（雙抗體夾心ELISA法），測(cè)定rhEGF滴眼液中rhEGF的含量，驗(yàn)證了方法的線性、專屬性、準(zhǔn)確度和精密度、穩(wěn)定性等，并對(duì)3批rhEGF滴眼液進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料和方法

1.1 儀器

ELx800酶標(biāo)儀（BioTek公司）；恒溫恒濕箱（上海博訊公司）；移液器（Gilson公司）。

1.2 藥品與試劑

Quantikine ELISA試劑盒（RD公司產(chǎn)品，包含RD6N稀釋液、96孔板、酶標(biāo)二抗、底物顯色液等）；rhEGF滴眼液供試品（上海昊海生物科技股份有限公司研發(fā)部自制，批號(hào)160308）；rhEGF原液（1.386 mg/mL，批號(hào)150618，內(nèi)部標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)品）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1）rhEGF滴眼液空白溶液 由磷酸氫二鈉0.048%、磷酸二氫鈉0.025%、氯化鈉0.85%、玻璃酸鈉0.1%、注射用水組成。

2）供試品溶液 取3管rhEGF原液各1 mL，分別加入276.2、137.6、68.3 mL rhEGF滴眼液空白溶液，稀釋至rhEGF濃度分別為5、10、20 μg/mL，得供試品，保存于2～8 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 取rhEGF原液，用rhEGF滴眼液空白溶液稀釋至濃度為10 μg/mL得標(biāo)準(zhǔn)品母液A。然后用RD6N稀釋液系列稀釋至200、133.3、88.9、59.2、39.5、26.3 pg/mL作為的rhEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

4）待檢樣品預(yù)處理 質(zhì)控品、供試品溶液及rhEGF滴眼液樣品等需先用RD6N稀釋液稀釋至約100 pg/mL后方可加入96孔板檢測(cè)。

1.3.2 rhEGF含量測(cè)定

參考試劑盒說明書[9]。

1.3.3 計(jì)算

采用線性回歸計(jì)算法，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD450/OD570值作為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，并計(jì)算其線性R2。按公式：供試品中rhEGF含量（μg/mL）=計(jì)算值（pg/mL）×稀釋倍數(shù)/1 000 000計(jì)算，式中：計(jì)算值為測(cè)得的稀釋樣品OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的濃度。

2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.1 專屬性

取不含有rhEGF活性成分的0 μg/mL的滴眼液空白溶液與20 μg/mL的rhEGF滴眼液測(cè)定供試品的rhEGF含量。結(jié)果顯示，含有rhEGF的滴眼液樣品濃度為18.829 μg/mL，而未添加rhEGF滴眼液的基質(zhì)濃度為0，說明該方法專屬性良好。

2.2 線性

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中rhEGF的含量，每個(gè)濃度測(cè)定3次，每次每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，測(cè)定值求平均值后計(jì)算供試品的含量。結(jié)果顯示，樣品濃度在26.3～200.0 pg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性，將吸光度OD450/OD570值進(jìn)行線性擬合，得到一條線性標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.007 4x+0.085 9，其擬合度R2>0.996 5，說明其該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好。

2.3 中間精密度

取含量為10 μg/mL的rhEGF供試品溶液，在不同日期由2位試驗(yàn)人員共測(cè)定3次，重復(fù)3次。結(jié)果顯示，3次測(cè)定的平均值都在（10±2）μg/mL范圍內(nèi)波動(dòng)，中間精密度所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為14.98%（n=9，表1），表明中間精密度符合《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》的要求。

2.4 準(zhǔn)確度

取含量為5、10、20 μg/mL的rhEGF供試品，每個(gè)濃度供試品在不同日期測(cè)定3次，每個(gè)稀釋度的供試品和標(biāo)準(zhǔn)品都做2個(gè)重復(fù)。結(jié)果顯示，50%、100%、200%濃度水平的供試品回收率均在100%±15%范圍以內(nèi)，平均回收率在100%±6%以內(nèi)（表2），符合《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》的要求，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 重復(fù)性

取含量為10 μg/mL的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液做2個(gè)重復(fù)，結(jié)果顯示均符合《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》中的要求（表3）。

2.6 耐用性

時(shí)間的影響考察：根據(jù)試劑盒說明書操作，向96孔板中加入待測(cè)樣品后室溫孵育2 h，加入酶標(biāo)二抗后再次室溫孵育2 h，加入底物顯色液后室溫孵育20 min?？紤]到因加樣量導(dǎo)致每孔的孵育時(shí)間差異，以及孵育溫度差異是否會(huì)影響到該方法的檢測(cè)結(jié)果，因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。

孵育時(shí)間的影響：在加入樣品及酶標(biāo)二抗時(shí)的孵育時(shí)間設(shè)為120 min上下浮動(dòng)30 min，底物顯色時(shí)間為20 min上下浮動(dòng)3 min，即試驗(yàn)時(shí)間分別為：90→90→17 min；120→120→20 min；150→150→23 min。

孵育溫度的影響考察：置于22、25、28 ℃恒溫箱中反應(yīng)。

結(jié)果顯示，在此檢測(cè)方法規(guī)定的孵育時(shí)間、顯色時(shí)間及溫度在一定范圍內(nèi)浮動(dòng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小，回收率均符合《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》的要求（表4、5），結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，表明該檢測(cè)方法可靠，耐用性良好。

2.7 rhEGF滴眼液樣品檢測(cè)

采用該方法分別檢測(cè)3批濃度為10 μg/mL的rhEGF滴眼液中rhEGF的含量，結(jié)果顯示測(cè)定的含量在標(biāo)示值的85%～115%（表6），表明該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中rhEGF含量。

3 討論

本研究建立的測(cè)定方法可在6～8 h內(nèi)完成測(cè)定，達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。經(jīng)專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、耐用性的驗(yàn)證，rhEGF含量的測(cè)定方法均符合《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》的要求。經(jīng)驗(yàn)證，本研究建立的方法適合rhEGF含量測(cè)定，并為類似生長(zhǎng)因子類制品的含量檢測(cè)方法提供了研究方向。

采用ELISA檢測(cè)藥品中rhEGF的含量的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)更快速，相比于細(xì)胞增殖法檢測(cè)時(shí)間縮短了6 d以上。細(xì)胞增殖法測(cè)定的結(jié)果范圍達(dá)到標(biāo)示值的70%～200%，而本方法準(zhǔn)確度達(dá)到85%～115%之內(nèi)，本方法的準(zhǔn)確度更高。采用ELISA的方法相對(duì)于3T3細(xì)胞增殖法，在快速檢測(cè)的效率，以及精準(zhǔn)檢測(cè)的準(zhǔn)確度上都具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其檢測(cè)受溫度及時(shí)間的干擾較小。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥品中含有黏性物質(zhì)如玻璃酸鈉、殼聚糖等成分時(shí)，可能干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，今后需要進(jìn)一步優(yōu)化，或可將藥品進(jìn)行預(yù)處理后采用本方法進(jìn)行更為準(zhǔn)確的測(cè)定。

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