基于TLR4/NF-κB炎性軸探討針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠運(yùn)動(dòng)能力的改善作用*

趙玉偉，劉志昂，車文生，孫曉東

鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的退行性疾病，可引發(fā)膝關(guān)節(jié)疼痛、骨性膨大、晨僵等癥狀，為慢性致殘首要因素[1]。KOA治療包括保守治療、手術(shù)治療，其中保守治療以藥物、物理療法為主，相對(duì)于藥物、手術(shù)治療，人們更易接受物理治療。近年來，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練已逐漸成為康復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)常用手段，對(duì)緩解KOA癥狀有一定作用[2-3]；其中感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)調(diào)運(yùn)動(dòng)期間結(jié)合觸覺、聽覺、視覺、肌肉張力等感覺刺激，可調(diào)節(jié)肢體運(yùn)動(dòng)能力、整體協(xié)調(diào)性[4]。但部分KOA患者單純行感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療恢復(fù)慢，整體療效欠佳。中醫(yī)治療KOA多以外治法為主，其中針灸可促進(jìn)軟骨炎性物質(zhì)吸收，改善軟骨代謝水平，抑制炎性細(xì)胞因子水平，緩解關(guān)節(jié)軟骨病變[5]。近年來，針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療KOA的研究較多見，且臨床療效良好，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(Nuclear Factor κB，NF-κB)炎性信號(hào)通路是一種典型的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)信號(hào)。此炎性軸激活可導(dǎo)致機(jī)體成骨細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖、分化，影響膝關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨增殖、炎性狀態(tài)，在KOA發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用[6]。故本研究基于TLR4/NF-κB 炎性軸探討針灸與感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合對(duì)KOA模型大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響，為KOA治療及預(yù)后評(píng)估提供新思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物50只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0050)，8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，每日光照及黑暗時(shí)間各12 h，溫度19～26 ℃，相對(duì)濕度40%。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：JZHPLA2019042002。

1.2 試劑戊巴比妥鈉(美國(guó)Epitomics公司，批號(hào)：150214)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：190522、190307)；Trizol法試劑盒(上海一基生物有限公司，貨號(hào)：YIJI10254655)；兔抗大鼠TLR4、NF-κB一抗及山羊抗兔二抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：190106、180517、180326)；BCA蛋白試劑盒(湖北武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：180527)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上?？评噭┯邢薰?，批號(hào)：190214)。

1.3 儀器紫外可見分光光計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)：TU-1810)；光學(xué)顯微鏡(北京汗盟紫星儀器儀表有限公司，型號(hào)：MoticBA210)；實(shí)時(shí)熒光定量分析(Real-time fluorescence quantitative analysis，RT-PCR)系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Applied Biosystems 7500)；無菌針灸針(固始公元醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：0.3 mm×25.0 mm)；艾柱(規(guī)格：長(zhǎng)度15 mm，直徑12 mm，上海泰成科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：AJ-L1)。

2 方法

2.1 模型制備及分組50只大鼠中隨機(jī)取10只作為空白對(duì)照組，另40只大鼠采用向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉的方法建立KOA大鼠模型[7]：用6.0%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射大鼠進(jìn)行麻醉，自髕腱外側(cè)身大鼠右膝關(guān)節(jié)腔注入磺乙酸鈉(20 g·L-1)，每隔3 d注射1次，連續(xù)注射3次。完成注射后，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)4周，完成造模。然后行病理組織檢查，出現(xiàn)以下任3項(xiàng)或3項(xiàng)以上，即為造模成功：①大體觀時(shí)關(guān)節(jié)軟骨透明度較差，色澤灰暗；②大體觀時(shí)關(guān)節(jié)內(nèi)組織腫脹、充血或缺損；③鏡下觀時(shí)HE染色顯示軟骨基質(zhì)染色變淺；④鏡下觀時(shí)存在軟骨細(xì)胞增生。40只大鼠建模成功36只，成功率90.00%。36只大鼠經(jīng)隨機(jī)體質(zhì)量排序法分為模型組、感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組，每組各9只。

2.2 藥物干預(yù)建模2周后開始治療。感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組：建立感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠訓(xùn)練跑臺(tái)，包括平面式跑道、左右擺動(dòng)式跑道、前后擺動(dòng)式跑道。各跑道跑帶上粘貼不同摩擦系數(shù)材料，包括砂布、軟毛，以供感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練需要。訓(xùn)練在上午800-1200進(jìn)行，依次選擇平面式跑道、左右擺動(dòng)式跑道、前后擺動(dòng)式跑道。訓(xùn)練時(shí)在跑道上粘貼砂布、軟毛兩種材料，按照Bedford等[8]研究選擇中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，速度18 m·min-1，跑臺(tái)坡度0°。各跑道分別運(yùn)動(dòng) 10 min，共30 min，每天1次，每周5 d，持續(xù)3周。運(yùn)動(dòng)期間，采用小木棒驅(qū)趕、聲音刺激等方式，促使大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，且整個(gè)運(yùn)動(dòng)期間無電刺激。針灸組：每日下午1400進(jìn)行，大鼠保持仰臥位，固定在解剖板上，以厚度適當(dāng)?shù)募啿級(jí)|在膝關(guān)節(jié)下，保持膝關(guān)節(jié)彎曲45°。按照鐘秀會(huì)版《動(dòng)物針灸學(xué)》[9]選擇穴位，包括內(nèi)膝眼穴、外膝眼穴、足三里穴。右手持無菌針灸針，垂直刺入，針柄處放置艾柱，點(diǎn)燃，每次 20 min，每天1次，持續(xù)3周。針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組每日上午進(jìn)行感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，下午進(jìn)行針灸，方法和時(shí)間同上，每天1次，持續(xù)3周?？瞻讓?duì)照組、模型組不給予任何處理。

2.3 大鼠運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)分別在各組大鼠治療3周后檢測(cè)患側(cè)肢體步態(tài)評(píng)分、后爪爪壓，以評(píng)估運(yùn)動(dòng)能力。步態(tài)評(píng)分[10]：測(cè)試環(huán)境為3 m×3 m空曠場(chǎng)地，引導(dǎo)大鼠自由活動(dòng)5 min，對(duì)其行走步態(tài)進(jìn)行觀察。步態(tài)正常，計(jì)0分；存在輕度跛行，受試肢體稍彎曲，計(jì)1分；存在中度跛行，受試肢體剛接觸地面，計(jì)2分；存在重度跛行，受試肢體離開地面，其余三足著地行走，計(jì)3分。后爪爪壓評(píng)分[11]：測(cè)試環(huán)境為25 cm×25 cm×20 cm透明玻璃室，將一鏡子置于玻璃室下面，呈45°，引導(dǎo)大鼠自由活動(dòng)5 min，經(jīng)鏡子觀察其足部，評(píng)估右后爪爪壓。兩后爪下壓力相等，計(jì)0分；腳掌壓力稍下降，爪子完全接觸地板，腳趾未張開，計(jì)1分；足底壓力降低，足部稍彎曲，輕觸地面，計(jì)2分；足部壓力嚴(yán)重下降，足部抬起，計(jì)3分。

2.4 取材及處理完成運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試后24 h，每組大鼠中隨機(jī)取4只，以6.0%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，斷頭處死，取右膝關(guān)節(jié)軟骨組織，以40 ng·L-1多聚甲醛固定，以備檢測(cè)軟骨組織病理學(xué)及關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評(píng)分。另在每組剩余大鼠中隨機(jī)取4只，以6.0%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭處死，取右膝關(guān)節(jié)軟骨組織，分為3份，均置于液氮保存。

2.5 軟骨組織病理學(xué)檢測(cè)取40 ng·L-1多聚甲醛固定軟骨組織，乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，切片，厚度4 μm。行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，經(jīng)脫蠟、染核、分化、返藍(lán)、染色、脫水、封片，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、基質(zhì)等改變進(jìn)行觀察。

2.6 關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評(píng)分按照1.2.5各組軟骨組織病理檢查結(jié)果，采用Mankin′s評(píng)分進(jìn)行分級(jí)[12]：軟骨正常，表層平整、光滑，HE染色均勻，計(jì)1分；軟骨輕度損傷，表層稍欠平整，HE染色存在失染，計(jì)2～6分；軟骨中度損傷，表層不平整，存在裂隙，深度達(dá)中層、深層，HE染色不均勻，計(jì)7～10分；軟骨重度損傷，表面厚度變薄，裂隙深度達(dá)軟骨下骨，HE染色全層存在明顯失染，計(jì)11～14分。

2.7 ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平取1份液氮保存關(guān)節(jié)軟骨組織，以1 g10 mL比例添加無菌PBS液。冰上超聲粉碎，震蕩。4 ℃，12 000 r·min-1，離心20 min，離心半徑10 cm，取上清液。按照試劑盒使用說明書對(duì)各組樣品IL-1β、TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)孔內(nèi)置入標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋樣品，密封，輕搖，37 ℃孵育 60 min。各孔洗滌，干燥，重復(fù)操作5次，AB顯色液滴入，避光。37 ℃孵育10 min。完成顯色后，終止液加入，反應(yīng)時(shí)間為5 min，然后讀取吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，創(chuàng)建濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照吸光度值獲得樣本濃度。

2.8 RT-PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量取1份液氮保存關(guān)節(jié)軟骨組織，添加4倍預(yù)冷生理鹽水，制備成20%勻漿?？俁NA采用Trizol法提取，檢測(cè)各樣本RNA濃度(g·L-1)，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃,15 min；85 ℃,5 s，4 ℃終止。以1 μL cDNA作為模板，擴(kuò)增TLR4、NF-κB，引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s；60 ℃變性30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。9 ℃變性 15 s；60 ℃變性60 s；95 ℃變性15 s。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算TLR4mRNA、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(2-△△CT)。

表1 RT-PCR引物序列

2.9 Western blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量取1份液氮保存關(guān)節(jié)軟骨組織，按照1 g10 L比例加入蛋白提取試劑，勻漿器研磨，超聲波粉碎制備勻漿。4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液。蛋白濃度以BCA法檢測(cè)，分別以30 μL樣本加入各孔，按照目的蛋白相對(duì)分子量，實(shí)施十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜。室溫封閉，共1 h。加TLR4(11 000)、NF-κB(1500)、β-actin(12 000)一抗，4 ℃孵育，過夜。次日，洗滌后加入山羊抗兔二抗IgG室溫下孵育1 h，洗膜。根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書，進(jìn)行凝膠成像儀下顯影、成像。經(jīng)Image J軟件(MAC版本)，測(cè)量條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠步態(tài)評(píng)分、爪壓評(píng)分比較與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠步態(tài)評(píng)分、爪壓評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠步態(tài)評(píng)分、爪壓評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠步態(tài)評(píng)分、爪壓評(píng)分比較 分)

3.2 大鼠軟骨組織病理學(xué)變化空白對(duì)照組大鼠軟骨基質(zhì)呈粉紅色，著色均勻，軟骨組織結(jié)構(gòu)正常，淺表層、移行層、輻射層、鈣化層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞排列整齊，潮線完整；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)層次模糊，軟骨細(xì)胞排列散亂且數(shù)目少，潮線斷裂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)尚清晰，軟骨細(xì)胞排列尚整齊且數(shù)目稍增多，潮線趨于完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組改善最顯著。見圖1。

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組；D：針灸組；E：針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組

3.3 各組大鼠Mankin′s評(píng)分比較與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠Mankin′s評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠Mankin′s評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠Mankin′s評(píng)分比較 分)

3.4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平比較與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平比較

3.5 大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量比較與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3.6 關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注：A：關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)；B：關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

4 討論

人體膝關(guān)節(jié)為承重關(guān)節(jié)之一，會(huì)因年齡增大、日常生活中活動(dòng)量大等，出現(xiàn)KOA，引發(fā)膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬甚至畸形，嚴(yán)重影響患者活動(dòng)，目前臨床上尚無特效或治愈方法[13]。西醫(yī)治療多見藥物止痛、氨基葡萄糖促膝關(guān)節(jié)軟骨增殖、物理治療、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)等，但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用可引發(fā)相關(guān)不良反應(yīng)；手術(shù)創(chuàng)傷大，部分患者為老年人，對(duì)手術(shù)不耐受，術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，并發(fā)癥多。而物理治療更易被人們接受，其中運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練被證實(shí)為KOA有效治療方法之一[14]?？祻?fù)訓(xùn)練中正常感官集成，在恢復(fù)平衡、改善運(yùn)動(dòng)能力中發(fā)揮重要作用[15]。感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅具有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練功能，還能加強(qiáng)感覺訓(xùn)練，以改善動(dòng)態(tài)平衡反應(yīng)，逐漸成為KOA常用康復(fù)手段之一[16-17]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，KOA屬于“骨弊”“痹癥”“膝弊”等范疇，病因病機(jī)為脾胃虛弱，氣血不足，肝腎陰虛，風(fēng)寒濕火入侵，或跌打損傷，致經(jīng)絡(luò)不通，關(guān)節(jié)不利，不通則痛，治療關(guān)鍵為調(diào)理脾胃，補(bǔ)腎益氣，溫經(jīng)通絡(luò)[18]。針灸為中醫(yī)傳統(tǒng)治療手段之一，具有針刺、艾灸雙重特點(diǎn)，艾灸溫?zé)嶙饔每山?jīng)針體向深部傳導(dǎo)，發(fā)揮活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)等功效。研究發(fā)現(xiàn)，針灸在緩解骨關(guān)節(jié)疾病炎性損傷中有積極作用，但具體機(jī)制不明[19-20]。目前，中西醫(yī)結(jié)合逐漸成為KOA治療趨勢(shì)，相關(guān)臨床實(shí)踐證實(shí)針灸與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)用有一定價(jià)值，但尚未明確其作用機(jī)制[21]。本研究就該問題進(jìn)行分析，重點(diǎn)探討針灸與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)用對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用。

本研究在KOA大鼠針灸治療時(shí)選用內(nèi)膝眼穴、外膝眼穴、足三里穴，以疏通局部經(jīng)絡(luò)，促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡恢復(fù)。內(nèi)膝眼穴是骨痹治療經(jīng)驗(yàn)用穴，而外膝眼穴為輔助血海行氣穴位，兩者聯(lián)用能對(duì)局部氣血進(jìn)行調(diào)整，且可通經(jīng)活絡(luò)；足三里穴為足陽明經(jīng)合穴，經(jīng)針灸可發(fā)揮調(diào)暢氣血、調(diào)理脾胃、通經(jīng)活絡(luò)等作用。另外，《素問·痹論》中提出：“痛者，寒氣多也”，說明寒氣侵蝕參與了疼痛的發(fā)生。而針灸可溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛，故多被應(yīng)用于治療KOA。經(jīng)由對(duì)上述穴位進(jìn)行針灸，可起到消腫、消炎、止痛、改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度等作用。本研究所用感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練選擇中等強(qiáng)度，可加快血液循環(huán)、新陳代謝，促進(jìn)炎癥吸收，且能促使關(guān)節(jié)滑液進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨，改善關(guān)節(jié)軟骨營(yíng)養(yǎng)、代謝活動(dòng)，以保持關(guān)節(jié)活動(dòng)能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組步態(tài)評(píng)分、爪壓評(píng)分均較模型組低，三組間呈下降趨勢(shì)，這說明三種方法對(duì)KOA大鼠運(yùn)動(dòng)能力均有一定改善作用，而針灸感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合治療時(shí)作用更顯著。病理觀察顯示，與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有所改善，其中針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組改善最顯著，且感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評(píng)分較模型組低。上述結(jié)果提示，針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療不僅可改善KOA大鼠運(yùn)動(dòng)能力，還可減輕關(guān)節(jié)軟骨病理?yè)p傷改變，修復(fù)軟骨損傷。

本研究還分析了針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療改善KOA大鼠運(yùn)動(dòng)能力的機(jī)制。目前認(rèn)為，KOA發(fā)生、發(fā)展中炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用，KOA軟骨細(xì)胞異?？纱龠M(jìn)分泌TNF-α等細(xì)胞炎癥因子，這些因子被大量釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，可影響基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)代謝平衡，抑制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，促使軟骨細(xì)胞凋亡速度加快[22-23]。另外，TNF-α可經(jīng)由對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生刺激，促進(jìn)合成分泌前列腺素E2，引發(fā)軟骨損傷，其水平提升還可導(dǎo)致其他炎性因子如IL-6水平升高，加速破壞膝關(guān)節(jié)軟骨[24-25]。本研究治療后，與模型組比較，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組關(guān)節(jié)軟骨IL-6、TNF-α水平均降低，其中針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組下降最顯著，這說明三種治療方法均具有一定效果，但針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)炎癥反應(yīng)控制效果更理想，可減緩軟骨細(xì)胞凋亡，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷。TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路是一種典型的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)信號(hào)，其中TLR4活化能促使NF-κB表達(dá)量增加，誘發(fā)下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，導(dǎo)致出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，使得IL-6、TNF-α 等炎癥因子水平異常升高[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，KOA發(fā)生、發(fā)展中，TLR4/NF-κB炎性信號(hào)軸激活發(fā)揮重要作用[29]。還有研究檢測(cè)了KOA手術(shù)患者關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)負(fù)重區(qū)軟骨內(nèi)TLR4mRNA、NF-κBmRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，認(rèn)為TLR4/NF-κB炎性軸介導(dǎo)的自身免疫炎癥反應(yīng)，可能在KOA發(fā)病機(jī)制中有一定作用[30]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4mRNA、NF-κBmRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，這說明KOA大鼠存在TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路激活，這是導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。而給予治療后，感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、針灸組、針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠關(guān)節(jié)軟骨TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均較模型組下降，其中針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組下降最顯著，說明針灸與感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可更好抑制TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)，這可能是聯(lián)合治療時(shí)大鼠運(yùn)動(dòng)能力改善的機(jī)制之一。因此，可通過針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療后KOA。本研究結(jié)果顯示，針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)3周，較各單一方法應(yīng)用能更好提升KOA大鼠運(yùn)動(dòng)能力，改善關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)，降低IL-6、TNF-α水平，機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB 炎癥軸有關(guān)。

綜上所述，聯(lián)用針灸、感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療可改善KOA大鼠運(yùn)動(dòng)能力，可能與抑制TLR4/NF-κB炎性軸表達(dá)有關(guān)。這為針灸聯(lián)合感覺運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療KOA提供了更為客觀、系統(tǒng)的理論依據(jù)，也為后期針灸聯(lián)合運(yùn)動(dòng)療法治療KOA奠定基礎(chǔ)。