橙足海參多肽的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

金丹莉 程逸潮 洪杏德 付晶晶 董秀萍 陳躍文

摘要：以橙足海參（Cucumaria frondosa）為原料，通過水解度、可溶性多肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）等理化指標(biāo)的分析，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，探究了復(fù)合酶酶解法制備海參多肽的最佳工藝參數(shù)。利用切向流超濾技術(shù)對海參酶解液進(jìn)行分離，考察了不同分子量段的海參多肽在體外消化前后的抗氧化活性。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為時(shí)間5.0 h、溫度50.0 ℃和pH值7.0，在此條件下測得ABTS自由基清除率為38.43%。當(dāng)分子量＜3 000 Da時(shí)，DPPH自由基清除率IC₅₀達(dá)到2.76 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀達(dá)到2.61 mg/mL，總還原力為0.31，F(xiàn)RAP為0.16μmol/mL Fe²⁺當(dāng)量。同時(shí)，體外消化結(jié)果顯示，海參多肽的ABTS自由基清除率上升，DPPH自由基清除率、總還原力和FRAP下降，但是仍具有較高的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海參多肽在消化前后均具有良好的抗氧化活性，為其功能性食品組分的添加和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：橙足海參多肽；復(fù)合酶酶解；響應(yīng)面分析；切向流超濾；體外消化；抗氧化能力

中圖分類號：TS254.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0022-09

Optimization of Preparation Process and Research on Antioxidant Activity of

Polypeptides from Cucumaria frondosa

JIN Dan-li^1，2， CHENG Yi-chao^1，2， HONG Xing-de³， FU Jing-jing^1，2，

DONG Xiu-ping^4，5， CHEN Yue-wen^{1，4，5*}

（1.School of Food Science and Biotechnology， Zhejiang Gongshang University， Hangzhou 310018，

China; 2.Donghai Food Research Institute （Taizhou）， Zhejiang Gongshang University， Taizhou

310018， China; 3.Qingdao Niucuisheng Biological Health Technology Co.， Ltd.， Qingdao

266071， China; 4.School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic

University， Dalian 116034， China; 5.National Engineering Technology

Research Center of Seafood， Dalian 116034， China）

Abstract： With Cucumaria frondosa as the raw material， the optimal process parameters for the preparation of Cucumaria frondosa polypeptides by enzymolysis of complex enzymes are determined through the analysis of degree of hydrolysis， the content of soluble polypeptides， DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical scavenging rate， total reducing power and ferric reducing antioxidant power （FRAP）， combined with single factor experiment and response surface experiment.The enzymatic hydrolysate of Cucumaria frondosa is separated by tangential flow ultrafiltration technique， and the antioxidant activity of Cucumaria frondosa polypeptides with different molecular weight segments before and after digestion in vitro are investigated. The results show that the optimal process parameters are time 5.0 h， temperature 50.0 ℃ and pH value 7.0. Under such conditions， the scavenging rate on ABTS free radical is 38.43%. When the molecular weight is less than 3 000 Da， DPPH free radical scavenging rate IC₅₀， ABTS free radical scavenging rate IC₅₀， total reducing power and FRAP is 2.76 mg/mL， 2.61 mg/mL， 0.31， 0.16μmol/mL Fe²⁺equivalent respectively. Meanwhile， the digestion in vitro results show that ABTS free radical scavenging rate of Cucumaria frondosa polypeptides increases， DPPH free radical scavenging rate， total reducing power and FRAP decrease， but they still have strong antioxidant activity. The experiment results show that Cucumaria frondosa polypeptides have good antioxidant activity before and after digestion， which has provided a theoretical basis for the addition and development of functional food components.

Key words： Cucumaria frondosa polypeptides; enzymolysis of complex enzymes; response surface analysis;

tangential flow ultrafiltration; digestion in vitro; antioxidant activity

收稿日期：2023-11-15

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ21C200004）；浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目（Y202352582）

作者簡介：金丹莉（1999—），女，碩士研究生，研究方向：食品加工技術(shù)與理論。

*通信作者：陳躍文（1985—），男，副教授，博士，研究方向：食品加工技術(shù)與理論。

采用蛋白酶將蛋白水解成小分子肽不但能夠提高生物活性的效用，而且能夠擁有更高的產(chǎn)業(yè)價(jià)值^[1]。然而，粗酶解產(chǎn)物是由生物活性肽和許多非生物活性水解化合物組成的復(fù)雜基質(zhì)，需要被有效分離才能充分發(fā)揮出生物活性作用^[2]。超濾分離技術(shù)在多肽綜合開發(fā)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用已成為熱點(diǎn)，例如，Leiva-Portilla等^[3]利用超濾（ultrafiltration，UF）截留出最具抗氧化性的部分（<3 000 Da），對獲得蝦加工廢棄物高潛力的肽組分具有積極貢獻(xiàn)。畢秋蕓^[4]研究發(fā)現(xiàn)通過UF分離裙帶菜多肽，低分子量段比高分子量段的抗氧化活性更強(qiáng)。關(guān)于超濾分離海參多肽的研究較少。此外，海參多肽具有抗氧化、抗炎和抗疲勞等生理活性，能夠應(yīng)用于面包和飲料等多種食品行業(yè)中。國內(nèi)已開始出現(xiàn)以肽為原料的產(chǎn)品，但是市場占有率仍然處在低位^[5]。肖盼盼等^[6]利用牡蠣肽、海參肽、鰻魚肽制備固體飲料，增強(qiáng)了小鼠的性功能和抗疲勞活性。肖彥春等^[7]將海參肽加入酸奶中，有效地提高了抗氧化能力。

本研究以低值橙足海參（Cucumaria frondosa）為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法對海參酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用切向流超濾技術(shù)分離海參多肽，以DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）為指標(biāo)，對其消化前后的抗氧化能力進(jìn)行初步研究，為海參多肽的分離、純化及其功能性食品的開發(fā)和利用提供了理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

橙足海參（Cucumaria frondosa）：由青島紐萃生生物健康科技有限公司提供。

1.2 試劑

中性蛋白酶（50 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt， ABTS）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）、牛血清蛋白、胃蛋白酶（≥3 000 U/mg，豬源）、胰蛋白酶（≥250 U/mg，豬胰腺）：美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Infinite E Plex多功能酶標(biāo)儀 帝肯（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；CM-14斬拌機(jī) 無錫市哈克遜工貿(mào)有限公司；HCJ-2E磁力攪拌水浴鍋 常州恩培儀器制造有限公司；Minimate切向流超濾系統(tǒng)及膜包 杭州九齡科技有限公司；Scientz-100FG/A冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 橙足海參的預(yù)處理

將橙足海參用流水解凍，去除頭、尾及內(nèi)臟部分，利用斬拌機(jī)切碎海參體壁，隨后冷凍干燥48 h，得到海參凍干體壁，貯藏于-20 ℃冰箱中待用。

1.4.2 海參多肽的制備

將海參凍干體壁按照1∶20（海參凍干體壁∶溶液）的比例溶解于蒸餾水中，同時(shí)加入蛋白酶（蛋白酶∶海參凍干體壁為3∶50），在一定的溫度、時(shí)間和pH值條件下進(jìn)行酶解。結(jié)束后，在100 ℃恒溫10 min進(jìn)行滅酶。

1.4.3 海參多肽的分離

在滅酶后的海參酶解液中加入無水乙醇至濃度為80%，過夜醇沉，抽濾，旋蒸。然后利用切向流超濾系統(tǒng)配合不同分子量的膜包（3 000 Da和5 000 Da）進(jìn)行分離，收集濾液并凍干，得到4種海參多肽組分，即未分離的海參多肽（SCP）、海參多肽分子量＜3 000 Da（SCP-Ⅰ）、海參多肽分子量在3 000～5 000 Da（SCP-Ⅱ）和海參多肽分子量＞5 000 Da（SCP-Ⅲ），保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.4.4 酶解工藝的優(yōu)化

1.4.4.1 蛋白酶及其復(fù)合比例的確定

以海參凍干體壁為原料，根據(jù)1.4.2步驟進(jìn)行酶解。固定酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為5 h和pH值為7，考察不同蛋白酶及其復(fù)合比例對海參酶解液的影響。設(shè)定木瓜蛋白酶為E1組，中性蛋白酶為E2組，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1為E3組，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為4∶1為E4組，中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為4∶5為E5組。收集上清液進(jìn)行水解度、可溶性多肽含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和FRAP的測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最終確定使用中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并以水解度和ABTS自由基清除率為測定指標(biāo)。

1.4.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察時(shí)間、溫度和pH值對水解度和ABTS自由基清除率的影響。每組稱取10 g海參凍干體壁、0.4 g中性蛋白酶和0.2 g木瓜蛋白酶，加入蒸餾水200 mL，在一定時(shí)間、溫度和pH值條件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)結(jié)束后在100 ℃恒溫10 min進(jìn)行滅酶。樣品以4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度和ABTS自由基清除率。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，改變單一因素的取值，其余因素固定不變。分別按照3個(gè)單因素進(jìn)行酶解：時(shí)間取3，4，5，6，7 h，其余條件不變；溫度取40，45，50，55，60 ℃，其余條件不變；pH值取5，6，7，8，9，其余條件不變。

1.4.4.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ABTS自由基清除率為制備海參多肽的響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇A時(shí)間（4，5，6 h）、B溫度（45，50，55 ℃）、C pH值（6，7，8）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。

1.4.5 體外抗氧化活性的測定

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

按照文獻(xiàn)[8]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取0.099 2 g DPPH，用無水乙醇定容至25 mL，作為儲備液，并于4 ℃下避光保存；量取2 mL儲備液用無水乙醇定容至100 mL，搖勻即為0.2 mmol/L DPPH工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取1 mL樣品溶液，加入2 mL DPPH工作液避光反應(yīng)30 min，以8 000 r/min離心5 min，取200μL溶液于96孔板中，在517 nm處測定吸光度A₁，同時(shí)測定1 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇溶液混合后的吸光度A₂，以及1 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A₃。DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算：

DPPH自由基清除率（%）=（1-A₁-A₂A₃）×100%。（1）

1.4.5.2 ABTS自由基清除能力的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法并稍作修改，將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按照1∶1混勻，避光反應(yīng)16 h，獲得儲備液。用蒸餾水稀釋儲備液，在734 nm處吸光度為0.70±0.02左右時(shí)獲得工作液。然后取1 mL樣品溶液，加入3 mL ABTS工作液，避光靜置30 min，以8 000 r/min離心5 min，取200μL溶液于96孔板中，在734 nm處測定吸光度A₁，同時(shí)測定1 mL樣品溶液與3 mL蒸餾水混合后的吸光度A₂，以及1 mL蒸餾水與3 mL ABTS工作液混合后的吸光度A₃。ABTS自由基清除率按公式（2）計(jì)算：

ABTS自由基清除率（%）=（1-A₁-A₂A₃）×100%。（2）

1.4.5.3 總還原力的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法并稍作修改，取1 mL樣品溶液，加入1 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值6.6）及1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，充分混合后，在50 ℃水浴孵育20 min。再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，在25 ℃孵育10 min，然后以8 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，再加入1 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min，取200μL反應(yīng)完后的溶液于96孔板中，在700 nm處測定吸光度。以等體積蒸餾水代替樣品作為空白對照。溶液的吸光度越高，總還原力越強(qiáng)，反之越弱。

1.4.5.4 FRAP的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法并稍作修改，醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L，pH值3.6）、TPTZ溶液（0.01 mol/L）和三氯化鐵溶液（0.02 mol/L），按照10∶1∶1混合，制備工作液。工作液需在37 ℃預(yù)熱20 min再使用。取24μL樣品或蒸餾水，加入180μL工作液，在37 ℃恒溫反應(yīng)10 min，于593 nm處測定吸光度。根據(jù)0.003 125～0.1μmol/mL的硫酸亞鐵溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。FRAP按公式（3）計(jì)算：

FRAP（μmol/mL）=C×N。（3）

式中：C表示樣品去掉空白后的吸光度代入回歸方程得到的Fe²⁺當(dāng)量（μmol/mL）；N表示稀釋倍數(shù)。

1.4.6 水解度的測定

參考文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改，采用甲醛滴定法測定水解度。取1 mL樣品（1 mg/mL），調(diào)節(jié)pH值為8.2，然后加入2 mL中性甲醛，利用氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）滴定至pH值為9.2，記錄所消耗的氫氧化鈉溶液的體積?？瞻讓φ帐敲附馇暗臉悠啡芤骸？偟扛鶕?jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定。水解度按公式（4）計(jì)算：

水解度（%）=C×（V₁-V₂）×0.014N×100%。（4）

式中：C表示氫氧化鈉溶液濃度（mol/L）；V₁表示酶解后所用的氫氧化鈉溶液的體積（mL）；V₂表示酶解前所用的氫氧化鈉溶液的體積（mL）;0.014表示氮的毫克當(dāng)量；N表示樣品底物中的總氮含量（g）。

1.4.7 可溶性多肽含量的測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改，分別稱取0.15 g硫酸銅與0.6 g酒石酸鉀鈉作為溶質(zhì)，同時(shí)量取50 mL蒸餾水和30 mL 10%的氫氧化鈉溶液為溶劑，充分混勻后，獲得雙縮脲試劑。取2.5 mL樣品溶液（10 mg/mL），加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10 min，以12 000 r/min離心5 min，然后取3 mL上述溶液到另一試管中，加入2 mL雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，取上清液于540 nm處測定吸光度。

1.4.8 體外消化

1.4.8.1 模擬體外胃腸消化

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改，將10 mL肽溶液（2 mg/mL）的pH值調(diào)節(jié)至2.0，然后加入4 000 U/mL胃蛋白酶，37 ℃恒溫?fù)u床以120 r/min的速度消化1 h。將混合物的pH值調(diào)節(jié)至7.0，加入200 U/mL胰蛋白酶，37 ℃恒溫?fù)u床以120 r/min的速度進(jìn)一步消化2 h。結(jié)束后，沸水浴15 min使酶失活。

1.4.8.2 多肽消化率的測定

根據(jù)1.4.7中的方法測定多肽含量，多肽消化率按公式（5）計(jì)算^[15]：

多肽消化率（%）=A₀-A₁A₀×100%。（5）

式中：A₀表示消化前多肽的含量（mg/mL）；A₁表示消化后多肽的含量（mg/mL）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差和顯著性分析，組間的多重比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Design-Expert 13對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖分析，利用OriginPro 2023b繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶及其復(fù)合比例的確定

利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶及其不同復(fù)合比例對海參進(jìn)行酶解。由圖1中A可知，與其他3組相比，E3組的水解度和可溶性多肽含量呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），分別為55.01%和3.15 mg/mL。此外，雙酶復(fù)合組比單酶組水解度高。由圖1中B可知，E3組的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率相對于其他組具有顯著性差異（P<0.05），分別達(dá)29.36%和38.54%。但總還原力（0.16）和FRAP（0.104μmol/mL）相對于其他組差異不顯著（P>0.05）。因此，選擇中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1復(fù)合酶解制備海參多肽。有研究報(bào)道稱蛋白酶具有底物特異性，且不同種類的蛋白酶對底物的酶切位點(diǎn)也有所不同，因此，酶解產(chǎn)物有時(shí)會進(jìn)行加和產(chǎn)生更多的多肽^[16]。徐陽等^[17]研究發(fā)現(xiàn)雙酶酶解大鯢蛋白的效果優(yōu)于單酶酶解，可能是因?yàn)椴煌鞍酌附M合能夠酶切到更多位點(diǎn)，促進(jìn)水解效率。Zhu等^[18]探究食用菌湯料副產(chǎn)物制備酶解液時(shí)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶水解產(chǎn)物的性質(zhì)優(yōu)于單一酶，DPPH自由基清除能力和總還原力較高。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖2中A可知，隨著溫度的上升，水解度和ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高值，分別為55.33%和38.13%。溫度對蛋白酶的酶活十分重要，溫度過低或過高都會影響酶活力，從而影響釋放肽的速率，而且溫度會影響蛋白酶和蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)，反應(yīng)速率會下降^[19]。由圖2中B可知，在酶解前期，底物濃度大且酶活力旺盛，水解度和ABTS自由基清除率持續(xù)上升，在5 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為55.73%和38.89%；酶解后期呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因?yàn)楹锌寡趸δ艿亩嚯脑俅伪凰?sup>[20]。由圖2中C可知，隨著pH值的上升，水解度和ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH值為7時(shí)達(dá)到最大值，分別為55.92%和38.05%。溶液的酸堿程度會影響蛋白酶和底物的離解狀態(tài)，在不恰當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，酶無法保持最佳活性，從而降低酶的水解效率，同時(shí)多肽本身結(jié)構(gòu)也容易被破壞^[21]。綜上所述，選擇溫度45～55 ℃、時(shí)間4～6 h、pH值6～8進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇A時(shí)間（4，5，6 h）、B溫度（45，50，55 ℃）、C pH值（6，7，8）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。以ABTS自由基清除率為響應(yīng)值，探究A（時(shí)間）、B（溫度）、C（pH值）對Y（ABTS自由基清除率）的影響。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

該模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型的F=121.06，P<0.001，說明模型極顯著；失擬項(xiàng)的F=1.32，P=0.383 6＞0.05，說明方程的擬合度高，具有較高的可信度；一次項(xiàng)中A、B、C，二次項(xiàng)A²、B²、C²的P值均小于0.05，說明時(shí)間、溫度、pH值3個(gè)因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都具有顯著影響。決定系數(shù)R²=0.993 6，說明模型能解釋99.36%響應(yīng)值Y的變化，修正系數(shù)R_Adj²=0.985 4，與決定系數(shù)相差不大，說明模型的擬合度良好，可用于分析和預(yù)測酶解工藝條件。根據(jù)F值的大小，可以判斷出各因素對ABTS自由基清除率的影響程度為A（時(shí)間）＞B（溫度）＞C（pH值）。

3D響應(yīng)面是回歸方程的圖形表示，其形狀為凸形時(shí)，響應(yīng)曲面圖能夠顯示最佳工藝條件^[22]。由圖3可知，隨著時(shí)間的延長和溫度的升高，ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；隨著時(shí)間的延長和pH值的升高，ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；隨著溫度和pH值的升高，ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。采用Design-Expert 13軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和優(yōu)化，最終確定最佳酶解工藝為時(shí)間5.106 h、溫度49.32 ℃、pH值7.249，在此條件下，ABTS自由基清除率預(yù)測值為38.649%?？紤]到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作，將海參酶解工藝條件修正為時(shí)間5.0 h、溫度50.0 ℃和pH值7.0。在此條件下，經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)，測得ABTS自由基清除率為38.43%，與回歸方程預(yù)測值的誤差小于1%，與理論值基本吻合，證明了響應(yīng)面分析法對海參酶解工藝條件的優(yōu)化是可行的。

2.4 分子量對海參多肽抗氧化活性的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用截留分子量為3 000 Da和5 000 Da的超濾膜對海參多肽進(jìn)行分離，通過DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和FRAP的變化，研究不同分子量段的海參多肽的抗氧化活性。

由圖4中A～D可知，SCP-Ⅰ組的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和FRAP均優(yōu)于其他3組（P<0.05），DPPH自由基清除率IC₅₀達(dá)到2.76 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀達(dá)到2.61 mg/mL，總還原力為0.31，F(xiàn)RAP為0.16μmol/mL Fe²⁺當(dāng)量，說明小分子量的海參多肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)說明切向流超濾能夠有效分離海參多肽，提高其抗氧化活性。Wang等^[22]研究發(fā)現(xiàn)太平洋鯡（Clupea pallasii）酶解物分子量低于3 500 Da時(shí)表現(xiàn)出最高的體外抗氧化活性和細(xì)胞抗氧化活性。Noman等^[23]利用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別水解中華鱘魚蛋白，發(fā)現(xiàn)<1 000 Da的水解產(chǎn)物的抗氧化活性最高，具體來說，DPPH自由基清除率IC₅₀分別為2.59，2.31 mg/mL，ABTS自由基清除率IC₅₀分別為1.54，1.36 mg/mL。與東海海參膠原蛋白酶解物的DPPH自由基清除率IC₅₀為24 mg/mL^[24]相比，經(jīng)過切向流超濾分離的海參多肽的DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。此外，不同分子量段的海參多肽呈現(xiàn)量效關(guān)系，這與Safari等^[25]的研究結(jié)果一致。

2.5 體外消化對海參多肽抗氧化活性的影響

生物活性肽要在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，必須經(jīng)過胃腸消化，這將會顯著影響肽的生物活性。在進(jìn)行體內(nèi)研究之前，體外模擬胃腸消化模型已成為快速且廣為接受的方法^[26]。將超濾分離前后的海參多肽進(jìn)行體外消化，見圖5 中A。SCP-Ⅰ組的消化率（51.90%）顯著低于其他3組（P<0.05），說明小于3 000 Da的海參多肽在胃腸消化過程中更加緩慢，這與Chen等^[27]的研究結(jié)果一致。短鏈肽通常在體內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性，因?yàn)樗鼈兲《荒茏鳛橄鞍酌傅牡孜?，從而增?qiáng)了對胃腸消化的抵抗力，并增加了穿過腸道屏障以引發(fā)其生物學(xué)功能的可能性^[28]。趙才冬等^[29]發(fā)現(xiàn)甲魚蛋蛋白水解物大分子多肽比小分子多肽更容易被降解為更短的肽，換句話說，短肽更能抵抗消化酶的水解，這是因?yàn)槎屉谋旧磔^短，含有消化酶的消化位點(diǎn)更少。

為了考察不同分子量段的海參多肽的抗氧化能力，測定了DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和FRAP，結(jié)果見圖5中B～E。

由圖5可知，SCP-Ⅰ組消化前后DPPH自由基清除率分別為20.57%和9.80%，ABTS自由基清除率分別為54.22%和60.55%，總還原力分別為0.25和0.19，F(xiàn)RAP分別為0.08μmol/mL Fe²⁺當(dāng)量和0.06μmol/mL Fe²⁺當(dāng)量。此外，在胃腸消化后，各組分均出現(xiàn)ABTS自由基清除率上升，DPPH自由基清除率、總還原力和FRAP下降的類似趨勢。另外，SCP-Ⅰ組雖然出現(xiàn)下降，但是仍比其余3組表現(xiàn)出較高的抗氧化水平。Bai等^[30]研究發(fā)現(xiàn)牛皮膠原多肽分子量越大，越容易被消化成小肽，DPPH自由基清除能力在腸道消化后期顯著下降。曹振海等^[31]的研究結(jié)果表明經(jīng)過胃腸消化后抗氧化活性下降，可能是因?yàn)橐鹊鞍酌笇⒕哂锌寡趸钚缘氖杷园被釓碾逆溨嗅尫懦鰜怼?/p>

3 結(jié)論

本研究以橙足海參（Cucumaria frondosa）為原料，采用中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1的復(fù)合比例進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)共同確定了最佳酶解工藝參數(shù)為時(shí)間5.0 h、溫度50.0 ℃和pH值7.0，在此條件下，測得ABTS自由基清除率為38.43%。不同分子量段的海參多肽及其體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性結(jié)果表明，當(dāng)分子量＜3 000 Da時(shí)，海參多肽的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、總還原力和FRAP均大于其他3組，且具有較好的耐胃腸消化能力，能夠保持良好的抗氧化能力。此外，結(jié)果顯示切向流超濾技術(shù)能夠有效地分離海參多肽，增強(qiáng)抗氧化活性。本研究為海參多肽在食品領(lǐng)域的添加、利用和開發(fā)提供了思路和理論支持。

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