芫根多糖的提取及其抗缺氧能力研究

摘要：為充分利用芫根資源，采用水提醇沉的方法提取芫根多糖，根據(jù)單因素試驗和正交試驗研究并優(yōu)化芫根多糖提取工藝，并初步探究芫根多糖對急性缺氧小鼠血清中生化指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，芫根多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20、提取溫度100 ℃、提取時間4 h和提取次數(shù)4次。對于低壓低氧環(huán)境中的小鼠，在給予芫根多糖干預(yù)后，小鼠血清中的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平有所改善，表明芫根多糖具有一定的抗高原缺氧的作用。該研究結(jié)果將有助于深入研究芫根多糖的生物活性，為其在醫(yī)學(xué)和保健食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)支持。

關(guān)鍵詞：高原缺氧；芫根多糖；抗氧化；生化指標(biāo)

中圖分類號：TS201.23

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0195-05

Study on Extraction and Anti-Hypoxia Ability of Polysaccharides

from Brassica rapa L.

WANG Fu-qing

（National and Local Joint Engineering Research Center for Deep Processing of Special Agricultural

and Animal Husbandry Products in Tibet Plateau， Lhasa 850600， China）

Abstract： In order to make full use of Brassica rapa L. resources， polysaccharides are extracted from Brassica rapa L. by water extraction and alcohol precipitation method. The extraction process of polysaccharides from Brassica rapa L. is studied and optimized by single factor test and orthogonal test， and the effects of polysaccharides from Brassica rapa L. on biochemical indexes in the serum of mice with acute hypoxia are explored preliminarily. The results show that the optimal extraction process of polysaccharides from Brassica rapa L. is solid-liquid ratio of 1∶20， extraction temperature of 100 ℃， extraction time of 4 h and extraction times of 4.For mice in low-pressure and low-oxygen environment， the levels of oxidative stress indexes in the serum of mice are improved after the intervention of polysaccharides from Brassica rapa L.， which indicates that polysaccharides from Brassica rapa L. have certain anti-hypoxia effect at high altitude. The research results will be helpful to study the bioactivity of polysaccharides from Brassica rapa L. in depth， and provide scientific support for their application in the fields of medicine and health food industry.

Key words： high altitude hypoxia; polysaccharides from Brassica rapa L.; antioxidation; biochemical indexes

收稿日期：2024-01-26

作者簡介：王福清（1963—），男，正高級工程師，碩士，研究方向：食品加工技術(shù)。

芫根（Brassica rapa L.），又稱蕪菁根、根頭菜、圓根、灰蘿卜等，是一種常見的蔬菜，屬于十字花科蕓苔亞科^[1]。目前芫根產(chǎn)地遍及我國青藏高原，被我國高原地區(qū)居民普遍種植，并用于緩解人和牲畜的高原反應(yīng)^[1-4]。芫根根部肥大，外形類似蘿卜，形狀多為圓錐形或長圓柱形，表面光滑，顏色有紅、白、紫等多種變異；含有多種礦物質(zhì)，如鉀、鈣、磷、鎂等，這些礦物質(zhì)對于維持骨骼健康、神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝等具有重要作用^[4-6]。芫根含有豐富的維生素，尤其是維生素C，有助于機體免疫系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)、皮膚健康以及抗氧化作用等^[4]。此外，芫根還富含膳食纖維，有助于促進腸道蠕動，維護消化系統(tǒng)的健康，調(diào)節(jié)血糖水平和降低膽固醇^[4-5]。在《甘露本草明鏡》、《新編藏醫(yī)學(xué)》中記載芫根具有增強免疫力、調(diào)理機體、抗疲勞、抗衰老和抗缺氧等功效^[6-7]。

芫根被廣泛應(yīng)用于食品加工中，這得益于芫根獨特的口感、味道和風(fēng)味^[8]。芫根具有一定的辛辣味道，因此常被用作調(diào)味品或調(diào)味醬來增添食物的辛辣度。此外，芫根也被用于制作泡菜，通過腌漬過程，芫根與其他蔬菜混合在一起，被加工成口感豐富的泡菜。目前，關(guān)于芫根的生物活性已展開了一系列的探究，其富含的活性物質(zhì)多糖已被證實具有抗氧化、抗缺氧、提高機體免疫力等保健或藥理功效^{[4-6，8-16]}。因此，通過提取和分離芫根多糖中的這些物質(zhì)，可以進一步鑒定和研究其對人體健康的潛在益處，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性^[4-6]。

研究表明，芫根多糖干預(yù)后能明顯提高缺氧小鼠血液中的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，且能顯著延長多種環(huán)境下缺氧小鼠的存活時間，表明芫根多糖具有一定的抗缺氧功效^[4-6]。此外，芫根多糖還具有較強的清除DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的能力，具有顯著的體內(nèi)外抗氧化活性^[10，17]。因此，通過研究芫根多糖的提取以及對芫根多糖抗缺氧功效的探究，可以深入了解其藥理學(xué)特性，為其在藥物開發(fā)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

自然晾曬的芫根塊：購于西藏拉薩市農(nóng)貿(mào)市場；石油醚、苯酚、95%乙醇和無水乙醇。

1.2 試驗儀器

HWS-24水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-VIS紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；TG16-WS離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BE-1200旋轉(zhuǎn)混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；4 ℃冰箱 唐山櫥加徳不銹鋼廚房設(shè)備有限公司；SI-0246渦旋振蕩器 北京銳志漢興科技有限公司；BIUGED電熱套 標(biāo)格達精密儀器（廣州）有限公司；SMO烘箱 寧波志圣烘箱有限公司；BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YQ-1019C超聲清洗儀 上海易凈超聲波儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芫根原料的預(yù)處理

將購買的芫根塊清洗干凈，去除表面泥漬，并置于烘箱內(nèi)進行低溫烘干，溫度設(shè)置為30 ℃左右。待芫根塊的重量穩(wěn)定后，進行磨粉處理，過50目篩得芫根細(xì)粉，裝袋備用。為后續(xù)多糖的精制、純化減少了障礙，進而得到純度更高、更優(yōu)質(zhì)的芫根多糖，本文對芫根粉進行脫脂處理，流程：稱取芫根粉1 kg→加入2倍的石油醚→回流脫脂處理2 h，重復(fù)2～3次。脫脂后，對芫根粉進行烘干直至石油醚完全揮發(fā)，待脫脂芫根粉恒重后，將其裝入干燥器皿中備用。

1.3.2 芫根多糖提取工藝

本研究采用水提醇沉法對芫根多糖進行提取和純化，具體工藝見圖1。

1.3.3 芫根多糖測定

采用苯酚-硫酸法對芫根多糖進行測定。葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考譚秀娟^[5]的方法。芫根樣品多糖含量的測定：先準(zhǔn)確稱取1.3.2中提取的芫根多糖1 mg，加入蒸餾水制成濃度為1 mg/mL，測定其吸光度值，代入葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。芫根多糖提取率公式如下：

芫根多糖提取率（%）=（芫根多糖含量（g）/芫根粉含量（g））×100%。

1.3.4 單因素試驗

控制提取溫度90 ℃、料液比例1∶20、提取時間4 h和提取次數(shù)3次，分別研究不同提取溫度40，60，80，100 ℃；不同料液比例1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；不同提取時間1，2，3，4，5 h和不同提取次數(shù)1，2，3，4，5次對芫根多糖含量的影響。

1.3.5 正交試驗

以提取溫度、料液比例、提取時間和提取次數(shù)為變量因子，并以芫根多糖含量作為指標(biāo)，進行正交試驗，見表1。

1.3.6 急性缺氧小鼠模型的建立和芫根多糖干預(yù)的方法

急性缺氧小鼠模型的建立參照譚秀娟^[5]的方法。建立小鼠模型后，隨機分為常壓常氧組、低壓低氧對照組、芫根多糖低、中、高3個劑量組，每組5只。根據(jù)文獻報道，本研究確定芫根高劑量組劑量為1 mg/g，中劑量組劑量為0.5 mg/g，低劑量組劑量為0.1 mg/g^[18-20]。在試驗前5 d，開始對芫根多糖干預(yù)組小鼠進行給藥，其他兩組以生理鹽水處理。進入模擬低壓低氧艙后，繼續(xù)對芫根多糖干預(yù)組小鼠給藥5 d，對低壓低氧對照組以生理鹽水干預(yù)。此外，常壓常氧組小鼠一直處于艙外飼養(yǎng)，其飼養(yǎng)條件與其余組一致。

1.3.7 小鼠血清樣品采集和血清中生化指標(biāo)的檢測

每天定時觀察并記錄小鼠的狀況。試驗結(jié)束后，對小鼠進行摘眼球取血，將收集的血液于室溫下靜置2 h，析出血清后于4 ℃、3 500 r/min離心15 min，收集上層清液，并參照南京建成生物工程研究所提供的相關(guān)測試盒方法對小鼠血清中氧化應(yīng)激（SOD、T-AOC、MDA、GSH-Px）、代謝（LD、LDH）、一氧化氮合酶（NOS）指標(biāo)水平進行立即測定。

2 結(jié)果和討論

2.1 芫根多糖提取工藝的研究

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)實驗所測結(jié)果計算對應(yīng)的回歸方程為Y=8.137 5X+0.042 25（R²=0.999，Y表示吸光度，X表示葡萄糖濃度）。

2.1.2 單因素試驗結(jié)果

各單因素對芫根多糖提取率的影響見圖3。

由圖3中a可知，芫根多糖提取率隨著溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)溫度為100 ℃時，芫根多糖提取率高達9%。

由圖3中b可知，隨著提取時間的延長，芫根多糖提取率不斷增加，但是當(dāng)提取時間超過4 h后，芫根多糖提取率出現(xiàn)下降趨勢。

由圖3中c可知，料液比例為1∶10時，芫根多糖提取率為5.5%，隨著料液比例的增加，芫根多糖提取率出現(xiàn)緩慢增加的趨勢，當(dāng)料液比例從1∶20逐漸增加至1∶50時，芫根多糖提取率僅增加了0.3%～0.5%。

由圖3中d可知，提取次數(shù)超過2次后，芫根多糖提取率的增幅逐漸趨于平穩(wěn)，當(dāng)提取次數(shù)為5次時，芫根多糖提取率高達7.4%。

在提取時間上，短時間的提取可能導(dǎo)致未能完全提取芫根中的多糖，而長時間的提取可能導(dǎo)致多糖的降解或損失。在料液比例和提取次數(shù)上，芫根多糖提取率分別在1∶20和提取2次后出現(xiàn)增幅趨于平緩的現(xiàn)象，表明一味地增加料液比例或過多增加提取次數(shù)并不能理想地提高芫根多糖的提取率。

2.1.3 正交試驗及結(jié)果分析

由表2可知，最佳提取工藝條件為A₂B₁C₁D₂，即提取溫度100 ℃、料液比例1∶20、提取時間4 h、提取次數(shù)4次。

由表3可知，提取溫度和提取次數(shù)在所考察的范圍內(nèi)對芫根多糖提取率的影響極顯著，而提取時間和料液比例在所考察的范圍內(nèi)對芫根多糖提取率的影響不顯著，按照最佳條件進行芫根多糖的提取，重復(fù)3次試驗，得到芫根多糖提取率最大為8.7%。

2.2 芫根多糖抗急性缺氧作用的研究

2.2.1 小鼠血清中LDH、NOS活性和LD含量的變化

由表4可知，與常壓常氧組比較，低壓低氧組小鼠的LDH活性和LD含量更高（P<0.05）。經(jīng)芫根多糖給藥干預(yù)后，高劑量組與中劑量組小鼠血清中這兩項指標(biāo)均顯著降低（P<0.05），而LDH在低劑量組中與低壓低氧組相比無明顯變化，LD含量僅稍微降低，無顯著差異。與常壓常氧組相比，缺氧刺激后小鼠血清中的NOS活性大幅度增強，且差異顯著（P<0.05）；在芫根多糖給藥干預(yù)后，小鼠血清中NOS活性有降低趨勢，隨著芫根多糖劑量的增加，NOS活性也逐漸降低，其效果在高、中劑量組中較顯著（P<0.05）。

2.2.2 小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化情況

本研究測定了不同組小鼠血清的抗氧化指標(biāo)SOD、GSH-Px、MDA及總抗氧化能力（T-AOC）。由表5可知，與常壓常氧組相比，SOD、GSH-Px和T-AOC在低壓低氧組中的活性均顯著降低（P<0.05），而作為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的MDA含量則顯著升高（P<0.05）。與低壓低氧組相比，GSH-Px隨著芫根總多糖干預(yù)量的增加，其活性增強（P<0.05）；T-AOC和SOD的活性在高、中劑量組中升高，差異顯著（P<0.05），而在低劑量組中出現(xiàn)了無統(tǒng)計學(xué)意義的變化；MDA含量在高劑量組中顯著降低（P<0.05），而在中、低劑量組中變化不顯著。

3 小結(jié)

目前對于芫根多糖的提取方法以熱水浸提法居多^{[1，3-5，10，17]}。不少學(xué)者針對不同地域、不同設(shè)備提出不同的芫根多糖提取工藝，如Wang等^[10]優(yōu)化的工藝條件為溫度93 ℃、提取時間4.3 h、液料比75∶1（mL/g）；楊永東^[17]得到最佳提取條件為溫度90 ℃、料液比1∶30、水浴浸提3次，并在每次提取2 h后，加入3%活性炭在60 ℃時進行脫色處理，吸附時間為40 min；趙文瑾^[4]提出的最佳工藝參數(shù)為超聲功率360 W、提取時間55 min、液料比43∶1（mL/g）、溫度60 ℃。由此可知，超聲波輔助或者添加活性炭等進行脫色處理能不同程度地提高多糖的品質(zhì)，但此類工藝需多次優(yōu)化，以達到適用于工廠設(shè)備化的工藝參數(shù)要求。

高原缺氧的環(huán)境會引起人體多種器官的損傷，包括呼吸困難、疲勞等癥狀。胡賢達等^[6]表明芫根水提取物具有一定的抗缺氧能力，經(jīng)芫根水提取物干預(yù)的小鼠在一定時間內(nèi)在密閉環(huán)境中的存活時間顯著延長。趙文瑾^[4]通過對芫根多糖進行提取、分離，獲得占芫根總糖含量78.4%～90.6%的4種多糖級分，即BRP-20、BRP-40、BRP-60 和BRP-80。體外抗氧化活性試驗結(jié)果表明，這4種芫根多糖均具有良好的體外抗氧化活性，其中以BRP-80的體外抗氧化活性最強，并且能夠顯著延長小鼠的游泳時長，存在劑量依賴效應(yīng)。總體而言，芫根多糖具有抗高原缺氧以及抗疲勞的作用^[4-6]。本文通過構(gòu)建小鼠急性缺氧模型以探究給予芫根多糖提取物后小鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)的變化，結(jié)果表明小鼠在低壓低氧環(huán)境中出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，因缺氧而產(chǎn)生大量的氧自由基，致使小鼠血清中SOD和GSH-Px活性降低，T-AOC活性也明顯降低，而MDA含量顯著升高。然而這些應(yīng)激反應(yīng)均在芫根多糖干預(yù)后得到明顯改善，并呈劑量依賴趨勢。

高原地區(qū)氧氣稀薄，機體的供氧不足會導(dǎo)致機體與需氧相關(guān)的功能代謝水平降低，這是高原疾病的主要因素之一^[21]。本研究通過優(yōu)化芫根多糖的提取工藝，并以此探究了芫根多糖對應(yīng)激缺氧環(huán)境中小鼠血清中生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明口服一定的芫根或芫根多糖產(chǎn)品能夠緩解高原反應(yīng)癥狀，這為芫根保健品或藥品的開發(fā)提供了一定的試驗依據(jù)。

參考文獻：

[1]CHEN Z， WUFUER R， JI J， et al. Structural characterization and immunostimulatory activity of polysaccharides from Brassica rapa L.[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2017，65（44）：9685-9692.

[2]CHU B， CHEN C， LI J， et al. Effects of Tibetan turnip （Brassica rapa L.） on promoting hypoxia-tolerance in healthy humans[J].Journal of Ethnopharmacology，2017，195：246-254.

[3]XIE Y， JIANG S， SU D， et al. Composition analysis and anti-hypoxia activity of polysaccharide from Brassica rapa L.[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（4）：528-533.

[4]趙文瑾.芫根多糖提取、分離及抗疲勞機理研究[D].無錫：江南大學(xué)，2021.

[5]譚秀娟.芫根總多糖提取及抗急性高原缺氧作用研究[D].成都：西南交通大學(xué)，2019.

[6]胡賢達，趙華龍，王彪，等.藏藥芫根提取物對小鼠抗缺氧能力的研究[J].中國生化藥物雜志，2016，36（1）：37-39.

[7]國家中醫(yī)藥管理局.中華本草·藏藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：400-416.

[8]王辭婉，王鋮，朱紅康，等.青海芫根提取物抗疲勞活性及其風(fēng)味飲料的研究[J].飲料工業(yè)，2022，25（2）：8-14.

[9]張旭，張華芳，劉陽，等.川西高原芫根化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].食品科技，2019，44（2）：104-110.

[10]WANG W， WANG X， YE H， et al. Optimization of extraction， characterization and antioxidant activity of polysaccharides from Brassica rapa L.[J].International Journal of Biological Macromolecules，2016，82：979-988.

[11]陳卓爾，古娜娜·對山別克，烏英，等.新疆蕪菁水提物抗腫瘤活性初步研究[J].西北藥學(xué)雜志，2016，31（3）：264-267.

[12]胡賢達，趙華龍，王彪，等.藏藥芫根提取物對小鼠抗缺氧能力的研究[J].中國生化藥物雜志，2016，36（1）：37-39.

[13]李張宇，萬波，王張，等.民族藥蔓菁對肺炎鏈球菌和流感病毒感染小鼠的保護作用[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17（3）：212-217.

[14]陳湘宏，文紹敦，吳萍，等.蕪菁不同提取物對糖尿病模型小鼠降血糖作用的研究[J].中國藥房，2013，24（7）：596-598.

[15]艾克拜爾江·阿巴斯，李冠，王靜.新疆蕪菁多糖降血糖作用的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（3）：471-479.

[16]劉暉.高原植物（芫根&青稞苗）質(zhì)量分析方法與初步活性的研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[17]楊永東.藏藥蔓菁多糖的制備、組分分析及抗急性低壓缺氧損傷作用的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[18]譚秀娟，李古兵，張淼，等.芫根總多糖對模擬高原缺氧小鼠的作用研究[J].華西藥學(xué)雜志，2020，35（2）：171-175.

[19]王張，張藝，周林，等.蔓菁抗疲勞作用的量效關(guān)系初步研究[J].中藥藥理與臨床，2012，28（5）：128-130.

[20]鄺婷婷，王宇，王張，等.藏藥蔓菁膏抗缺氧作用的量-效/毒關(guān)系及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國中藥雜志，2016，41（4）：597-602.

[21]趙明亮，王相陽，李欣欣，等.高原缺氧代謝組學(xué)研究進展[J].中草藥，2018，49（4）：948-954.