探究高血糖與胰島素干預(yù)對(duì)大鼠腦損傷的影響

康旭暉 史占華

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生健康科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：wsjkkj038）

作者簡(jiǎn)介：康旭暉，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向：顱腦損傷合并糖尿病的診療。

通信作者：史占華，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：顱腦損傷合并糖尿病的診療。E-mail：793361405@qq.com

【摘要】目的 通過大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討高血糖與腦損傷的關(guān)聯(lián)性及對(duì)后胰島素干預(yù)腦損傷的影響。方法 選取45只健康大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、糖尿病組、胰島素恢復(fù)組，各15只。對(duì)后兩組進(jìn)行相應(yīng)的建模比較3組大鼠血糖、體質(zhì)量、學(xué)習(xí)記憶功能、海馬區(qū)病理結(jié)果、海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)后，糖尿病組和胰島素恢復(fù)組大鼠血糖濃度均高于對(duì)照組，且糖尿病組高于胰島素恢復(fù)組（均P<0.05）。實(shí)驗(yàn)后，糖尿病組大鼠平均體質(zhì)量降低，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組大鼠平均體質(zhì)量均增加，且胰島素恢復(fù)組低于對(duì)照組（均P<0.05）。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，3組大鼠逃避潛伏期具有交互效應(yīng)、時(shí)間差異、組間差異（F時(shí)間=91.23，P時(shí)間<0.05；F組間=6.89，P組間<0.05；F交互效應(yīng)=6.89，P交互效應(yīng)<0.05）。3組大鼠逃避潛伏期均縮短，且糖尿病組和胰島素恢復(fù)組均長(zhǎng)于對(duì)照組，糖尿病組長(zhǎng)于胰島素恢復(fù)組（均P<0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組大鼠穿臺(tái)次數(shù)少于胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組（均P<0.05）。糖尿病組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、深染，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組未見明顯異常；糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列相對(duì)疏松，部分神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組未見明顯異常；糖尿病組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞呈活化態(tài)，胰島素恢復(fù)組大鼠和對(duì)照組呈靜息態(tài)。結(jié)論 高血糖可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及平均體質(zhì)量下降，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化。經(jīng)胰島素干預(yù)后可將糖尿病大鼠血糖控制在正常范圍，減輕腦組織損傷，但其對(duì)腦組織的保護(hù)具有一定限度，但糖代謝對(duì) DM 腦損傷的確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】高血糖；胰島素；腦損傷；腦損傷轉(zhuǎn)歸

【中圖分類號(hào)】R295 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.08.00.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.08.003

糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）是由內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致的代謝性疾病，屬于全身性疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)的高血糖狀態(tài)，嚴(yán)重影響患者身體健康、威脅生命安全[1]。DM引發(fā)的腦損傷主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，包括智力、反應(yīng)速度、注意力、學(xué)習(xí)記憶和執(zhí)行能力等功能下降，嚴(yán)重影響患者日常生活和生存質(zhì)量[2]。胰島素具有調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)攝入、調(diào)節(jié)急性代謝效應(yīng)、監(jiān)測(cè)能量?jī)?chǔ)存的作用，主要來源為胰島β細(xì)胞，也可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的海馬體、額葉、下丘腦等部位的神經(jīng)元中少量合成。胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)體、胰島素受體和胰島素下游信號(hào)分子分布在大腦的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，大量的胰島素受體存在于內(nèi)側(cè)顳葉、海馬區(qū)和前額皮質(zhì)，這些區(qū)域與認(rèn)知功能密切相關(guān)[3]?；诖?，本研究觀察血糖濃度升高和血糖調(diào)控后大鼠腦組織的生理改變，分析高血糖與大鼠腦損傷的關(guān)聯(lián)性及胰島素干預(yù)后腦損傷的轉(zhuǎn)歸，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和建模 選取45只健康大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、糖尿病組、胰島素恢復(fù)組，各15只。本研究采用1型糖尿病（T1DM）動(dòng)物模型，研究過程遵循國(guó)際通行的動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。對(duì)照組大鼠注射檸檬酸鹽緩沖液[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字2291837，規(guī)格：100 mL]2 mL/kg，提供正常食物和10%蔗糖溶液，于實(shí)驗(yàn)第2天將蔗糖溶液換成飲用水并保持不變。其余兩組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，規(guī)格：100 mg/支），65 mg/kg，注射后第7天進(jìn)行血糖檢測(cè)，大鼠空腹血糖值≥16.7 mmol/L為高血糖建模成功。于高血糖模型制作完成后第2天，胰島素恢復(fù)組大鼠每天上午8時(shí)、下午4時(shí)皮下注射低精蛋白鋅胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20060845，規(guī)格：3 mL∶300單位）2～3 單位，保持空腹血糖 <10 mmol/L，對(duì)照組、糖尿病組大鼠同時(shí)注射等量生理鹽水。3組大鼠每天均正常飼養(yǎng)，持續(xù)飼養(yǎng)12周。

1.2 觀察指標(biāo) ⑴血糖濃度。血糖檢測(cè)前12 h禁食，檢測(cè)時(shí)用75%乙醇溶液擦拭大鼠尾部，用采血針于大鼠尾尖部位采血，第2滴血流出時(shí)滴入血糖儀試紙中讀取血糖儀顯示的數(shù)值并記錄。⑵平均體質(zhì)量。每周使用電子天平測(cè)量3組大鼠體質(zhì)量，本組大鼠平均體質(zhì)量=本組大鼠體質(zhì)量之和/15。⑶學(xué)習(xí)記憶功能。于飼養(yǎng)結(jié)束后第1，2，3d，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，實(shí)驗(yàn)方案由定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分組成。定位航行實(shí)驗(yàn)：先將泳池分為4個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)大鼠面朝泳池內(nèi)壁，將之分別由4個(gè)象限依次放入泳池并開始視頻追蹤，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為120 s，記錄實(shí)驗(yàn)大鼠找到水下平臺(tái)所需時(shí)間，2次/d。若實(shí)驗(yàn)大鼠在120 s內(nèi)未找到水下平臺(tái)，則將逃避潛伏期記為120 s，并將實(shí)驗(yàn)大鼠人工引導(dǎo)至水下平臺(tái)休息10 s，取兩次實(shí)驗(yàn)的平均值并記錄為逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：開始時(shí)去掉水下平臺(tái)，將實(shí)驗(yàn)大鼠面朝池壁放入水迷宮內(nèi)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間60 s，記錄大鼠在60 s內(nèi)穿過平臺(tái)標(biāo)記位置的次數(shù)，取兩次穿過次數(shù)的平均值。⑷海馬區(qū)病理學(xué)變化。3組各取1只實(shí)驗(yàn)大鼠，進(jìn)行麻醉后從心臟灌注生理鹽水，取全腦置于甲醛中固定24 h。將固定好的腦組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE染色）。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并采集分析。⑸海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。3組各取1只實(shí)驗(yàn)大鼠，組織樣品取材、固定方法同⑷，制作封片后使用掃描共聚焦顯微鏡觀察組織切片，并記錄海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間多時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩組間比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，不符合同質(zhì)性檢驗(yàn)的采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血糖濃度比較 實(shí)驗(yàn)后，糖尿病組和胰島素恢復(fù)組大鼠血糖濃度均高于對(duì)照組，且糖尿病組高于胰島素恢復(fù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見圖1。

2.2 3組大鼠平均體質(zhì)量比較 實(shí)驗(yàn)后，糖尿病組大鼠平均體質(zhì)量降低，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組平均體質(zhì)量均增加，且胰島素恢復(fù)組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見圖2。

2.3 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化情況比較 在定位航行實(shí)驗(yàn)中，3組大鼠逃避潛伏期具有時(shí)間差異、組間差異、交互效應(yīng)（F時(shí)間=91.23，P時(shí)間＜0.05；F組間=6.89，P組間＜0.05；F交互效應(yīng)=6.89，P交互效應(yīng)＜0.05）。3組大鼠逃避潛伏期均縮短，且糖尿病組和胰島素恢復(fù)組均長(zhǎng)于對(duì)照組，糖尿病組長(zhǎng)于胰島素恢復(fù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。糖尿病組大鼠穿臺(tái)次數(shù)為（2.38±1.41）次，胰島素恢復(fù)組為（3.63±1.78）次，對(duì)照組為（5.07±1.77）次，糖尿病組穿臺(tái)次數(shù)介于胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組，胰島素恢復(fù)組少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表1。

2.4 3組大鼠海馬病理學(xué)變化 糖尿病組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、深染；胰島素恢復(fù)組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元均質(zhì)紅染，細(xì)胞核較清晰；對(duì)照組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元均質(zhì)紅染，細(xì)胞核清晰可見，未見明顯異常，見圖3。糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列相對(duì)疏松，部分神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，但并未見神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)深染、細(xì)胞核固縮等情況出現(xiàn)；胰島素恢復(fù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列恢復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)未見異常；對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元均質(zhì)紅染排列緊密，細(xì)胞核清晰可見，未見明顯異常，見圖4。

2.5 3組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況 糖尿病組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞呈明顯的阿米巴狀，細(xì)胞的體積明顯增大，小膠質(zhì)細(xì)胞突觸變短、變粗乃至巨噬細(xì)胞樣，呈明顯的活化態(tài)；胰島素恢復(fù)組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞凸起顯著變長(zhǎng)，胞體變小，細(xì)胞由活化態(tài)恢復(fù)為靜息態(tài)；對(duì)照組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞胞體相對(duì)較小，突觸長(zhǎng)且并未出現(xiàn)顯著的回縮現(xiàn)象，形態(tài)呈靜息態(tài)，見圖5。

3 討論

本研究通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素破壞大鼠胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素釋放不足，引起持續(xù)性血糖濃度升高，使大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、體質(zhì)量減輕的癥狀。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)后，糖尿病組和胰島素恢復(fù)組大鼠血糖濃度均高于對(duì)照組，且糖尿病組高于胰島素恢復(fù)組，糖尿病組大鼠平均體質(zhì)量降低，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組平均體質(zhì)量均增加，且胰島素恢復(fù)組低于對(duì)照組。這提示糖尿病可對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量產(chǎn)生明顯的影響，在進(jìn)行血糖轉(zhuǎn)歸后大鼠體質(zhì)量恢復(fù)。由高血糖引起的腦損傷主要表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知能力障礙、邏輯能力混亂，在動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中主要表現(xiàn)為Morris水迷宮的逃避潛伏期或轉(zhuǎn)移潛伏期延長(zhǎng)，游泳距離延長(zhǎng)。海馬區(qū)是哺乳動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶的重要結(jié)構(gòu)功能區(qū)，也是神經(jīng)可塑性的主要腦區(qū)。本研究結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組和胰島素恢復(fù)組大鼠逃避潛伏期均長(zhǎng)于對(duì)照組，且糖尿病組長(zhǎng)于胰島素恢復(fù)組；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組大鼠穿臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組和胰島素恢復(fù)組。這提示糖尿病可降低實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且在血糖調(diào)控后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)，糖尿病發(fā)病可能是實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷的關(guān)鍵因素，這與Erukainure等[4]研究結(jié)果一致。分析原因?yàn)椋X組織所消耗的能量主要來源于葡萄糖代謝，糖代謝受損可導(dǎo)致血糖穩(wěn)態(tài)失調(diào)，嚴(yán)重影響機(jī)體認(rèn)知功能[5]。有研究表明，DM腦損傷患者常表現(xiàn)出空腹血糖受損、慢性持續(xù)性高血糖癥、大腦雙側(cè)海馬區(qū)細(xì)胞損傷并萎縮、認(rèn)知功能障礙等癥狀[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、深染，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組大鼠未見明顯異常；糖尿病組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列相對(duì)疏松，部分神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組大鼠未見明顯異常。這提示高血糖可導(dǎo)致海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。分析原因?yàn)?，高血糖引起的腦損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)變化、腦組織修復(fù)過程受損等綜合過程[8]。其中，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的毒性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致血腦屏障和大腦微脈管系統(tǒng)出現(xiàn)滲透性破壞，進(jìn)一步損害神經(jīng)細(xì)胞，是DM 患者腦部出現(xiàn)神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞變性和凋亡及進(jìn)行性認(rèn)知減退的主要原因[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞呈明顯的活化態(tài)，胰島素恢復(fù)組和對(duì)照組大鼠呈靜息態(tài)。這提示血糖濃度升高可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而在胰島素干預(yù)后形態(tài)異常的神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元形態(tài)逐漸趨于正常。分析原因?yàn)?，小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞，在受到刺激時(shí)活性增強(qiáng)，并通過分泌和釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等維持神經(jīng)元的正常功能[11]。海馬區(qū)高血糖狀態(tài)造成腦細(xì)胞損傷、凋亡，進(jìn)而激發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞活化[12]。當(dāng)胰島素調(diào)控血糖濃度趨于正常后，受損腦細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)、功能，小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度降低，呈靜息態(tài)。

綜上所述，高血糖可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及平均體質(zhì)量下降，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化。經(jīng)胰島素干預(yù)后可將糖尿病大鼠血糖控制在正常范圍，減輕腦組織損傷，但其對(duì)腦組織的保護(hù)具有一定限度，但糖代謝對(duì) DM 腦損傷的確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]董雯， 劉美琴， 倫永志， 等. 糖脂代謝參與糖尿病腦損傷的研究進(jìn)展[J]. 邵陽學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 17（5）： 103-108.

[2]SCHMIDT A M.Highlighting diabetes mellitus： The epidemic continues[J].Arteriosclerosis， Thrombosis， and Vascular Biology， 2018， 38（1）： el-e8．

[3]胥智超，李潤(rùn)芝，米東華，中樞胰島素抵抗與腦血管病的關(guān)系[J].中國(guó)卒中雜志，2022，17（11）：1276-1282.

[4]ERUKAINURE O L， IJOMONE O M， OYEBODE O A， et al.Hyperglycemia-induced oxidative brain injury：Therapeutic effects of Cola nitida infusion against redox imbalance，cerebellar neuronal insults，and upregulated Nrf2 expression in type 2 diabetic rats[J].Food And Chemical Toxicology， 2019， 127：206-217.

[5]LI Y， TENG D，SHI X，et al.Prevalence of diabetes recorded in mainland China using 2018 diagnostic criteria from the American Diabetes Association： National cross sectional study[J]. The British Medical Journal， 2020， 369：m997.

[6]ALSHARIF A A， WEI L， MA T，et al.Prevalence and incidence of dementia in people with diabetesMmellitus[J].Journal of Alzheimers Disease，2020，75（2）：607-615.

[7]YU J H， HAN K， PARK S，et al.Incidence and risk factors for dementia in type 2 diabetes mellitus：A nationwide population-based study in Korea[J].Diabetes Metabolism Journal， 2020， 44（1）： 113-124.

[8]王琳， 趙婭東. 伴糖尿病或應(yīng)激性高血糖的重癥顱腦外傷患者炎癥因子與胰島素組分的相關(guān)性[J].醫(yī)學(xué)臨床研究， 2023， 40（11）： 1747-1750.

[9]HAMED S A.Brain injury with diabetes mellitus： evidence， mechanisms and treatment implications[J]. Expert Review of Clinical Pharmacology， 2017， 10（4）：409-428.

[10]PINTI M V， FINK G K，HATHAWAY Q A， et al.Mitochondrial dysfunction in type 2 diabetes mellitus：an organ-based analysis[J].American Journal of Physiology.Endocrinology and Metabolism， 2019， 316（2）： E268-E285.

[11]王冬雪， 蔣玟依， 林萍， 等.rhFGF21調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥促進(jìn)2型糖尿病小鼠缺血性腦卒中后神經(jīng)功能的修復(fù)[J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2023， 37（7）：503.

[12]GUO X Y， SHI Y， DU P，et al.HMGB/TLR4 promotes apoptosis and reduces autophagy of hippocampal neurons in diabetes combined with OSA in diabetes combined with OSA[J].Life sciences， 2019， 239： 117020．