李園雜草管理方式對(duì)土壤細(xì)菌群落和生態(tài)功能的影響

摘 要：【目的】分析不同雜草管理方式對(duì)位于國(guó)家重點(diǎn)生態(tài)功能縣的李園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的影響，為李園土壤健康管理提供參考?！痉椒ā恳宰匀簧荨⑷斯ど?、除草劑除草的李園和鄰近天然槲櫟次生林土壤為研究對(duì)象，提取土壤細(xì)菌DNA，對(duì)其ITS 基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用高通量測(cè)序和功能預(yù)測(cè)的方法研究細(xì)菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能?！窘Y(jié)果】不同處理OTU 數(shù)量為2 012 ～ 3 522，細(xì)菌種類33 門、108 綱、242 目、383 科、667 屬。綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門為主要門類，在各處理中4 個(gè)門的總豐度達(dá)到80%以上。多樣性分析顯示，天然林Ace 和Chao 指數(shù)顯著低于李園的3 個(gè)處理。群落組成和差異分析顯示，天然林土壤酸桿菌優(yōu)勢(shì)比較大，病害細(xì)菌少，并有少量的有益細(xì)菌蛭弧菌；李園的鞘脂單胞菌相關(guān)病害的風(fēng)險(xiǎn)大，生草可在一定程度上提高芽孢桿菌等有益細(xì)菌的豐度，尤其自然生草比較明顯。人工生草還有利于提高李園細(xì)菌的多樣性，尤其是芽單胞菌的富集比較明顯。使用除草劑的李園則主要富集了綠彎菌門的種類，而降低了苔蘚桿菌的豐度。功能預(yù)測(cè)分析顯示，土壤細(xì)菌新陳代謝最活躍，主要包括碳水化合物代謝和氨基酸代謝等，涉及化能異養(yǎng)、纖維素分解、固氮作用等功能。與其他處理比較，人工生草李園土壤硝酸還原功能較強(qiáng)、天然林土壤的木質(zhì)素分解功能較強(qiáng)、除草劑處理的李園土壤甲基營(yíng)養(yǎng)功能較強(qiáng)。【結(jié)論】天然林Ace 和Chao 指數(shù)顯著低于李園，表現(xiàn)為土壤酸桿菌優(yōu)勢(shì)明顯。不同雜草管理方式對(duì)李園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響較大，生草有利于李園有益細(xì)菌群落的建立。

關(guān)鍵詞：果園；雜草管理；土壤健康；細(xì)菌多樣性；群落結(jié)構(gòu)；生態(tài)功能

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）01—0304—13

土壤細(xì)菌與土壤肥力、土壤健康等方面密切相關(guān)，也是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，可直接或間接地影響經(jīng)濟(jì)林木的產(chǎn)量、品質(zhì)等指標(biāo)，甚至影響到產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。李是貴州栽培面積最大的水果，也是管理相對(duì)較耐粗放的水果。貴州種植的李品種多樣，包括近年在省內(nèi)外都較有名氣的蜂糖李、紫云冰脆李、沿河空心李、九阡李、四月李等地方特色品種。紫云冰脆李主要產(chǎn)于滇黔桂喀斯特石漠化片區(qū)的國(guó)家重點(diǎn)生態(tài)功能縣—貴州省安順市紫云苗族布依族自治縣（以下簡(jiǎn)稱紫云縣）的火花鎮(zhèn)及周邊地區(qū)，并于2020 年申報(bào)獲得國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記證書。紫云冰脆李是紫云縣李產(chǎn)區(qū)農(nóng)民收入的重要來源，同時(shí)也是當(dāng)?shù)胤N植年限較長(zhǎng)的重要水果之一，常分布于天然次生林的邊緣，構(gòu)成了縣域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。因此，紫云冰脆李在紫云縣域內(nèi)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。研究不同雜草管理方式對(duì)土壤細(xì)菌群落構(gòu)成和細(xì)菌功能的影響，對(duì)進(jìn)一步提高土壤質(zhì)量和生產(chǎn)管理水平具有重要意義。

自然生態(tài)系統(tǒng)中影響土壤細(xì)菌種類分布的主要因素包括土壤pH 值、植被、水分、溫度等[1]。湖南、云南的森林土壤分析顯示，酸桿菌門是森林土壤的主要細(xì)菌門類[2-3]。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)直接影響到土壤的健康水平，果園生草被認(rèn)為是一種先進(jìn)的果園土壤管理方式，果園生態(tài)系統(tǒng)作為人工生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要類型，除了受自然因素影響外，果樹品種和地面草本植物構(gòu)成的群落結(jié)構(gòu)、投入的肥料和農(nóng)藥，以及耕作管理方式等擾動(dòng)因子都是影響土壤細(xì)菌的因素[4-6]。果園生草調(diào)節(jié)了土壤pH 值、肥力、濕度、溫度、光照，同時(shí)草的根系分泌物、根系與微生物的共生關(guān)系等都會(huì)影響土壤環(huán)境，進(jìn)而影響不同細(xì)菌群落的發(fā)展方向和功能發(fā)揮[7-9]。使用除草劑除草是雜草管理的一種簡(jiǎn)便方法，但是除草劑容易使果園土壤板結(jié)并影響土壤pH 值及相關(guān)酶的活性，最終導(dǎo)致土壤放線菌門、酸桿菌門等微生物相對(duì)豐度下降和藍(lán)細(xì)菌門相對(duì)豐度上升[10]。

地面的草本植物是果園生態(tài)系統(tǒng)的一部分，雜草管理方式直接影響生產(chǎn)管理成本、果園生態(tài)環(huán)境，目前鮮見不同雜草管理方式對(duì)李園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能影響的報(bào)道。本研究以除草劑除草的李園、人工生草栽培的李園、自然生草栽培的李園土壤為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序測(cè)定土壤細(xì)菌ITS 基因，分析不同處理模式對(duì)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性和生態(tài)功能等方面的影響，以期為紫云冰脆李園土壤肥力提升和土壤健康評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，明確不同耕作模式下冰脆李果園土壤細(xì)菌群落的差異，為冰脆李土壤精準(zhǔn)管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紫云冰脆李園和其鄰近的天然次生林土壤樣品。試驗(yàn)地塊分布于貴州省紫云縣火花鎮(zhèn)，東經(jīng)105°55′-106°29′，北緯25°21′-26°03′，平均海拔1 150 m，平均氣溫15.3 ℃，年無霜期288 d，年平均日照時(shí)數(shù)1 455 h，年平均降水量1 337 mm，相對(duì)濕度平均79%，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)型氣候。冰脆李樹齡6 a，天然林為緊鄰李園2 m 左右的槲櫟Quercus aliena 天然次生林。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤樣品分別設(shè)4 種處理，包括3 種耕作方式的李園，即AGO：人工生草果園（草種為光葉紫花苕）；NGO：自然生草果園，HO：使用除草劑果園，以及SF：槲櫟為優(yōu)勢(shì)樹種的天然次生林。

不同處理李園沿同一個(gè)天然林山腳邊緣呈弧形分布，李園之間間隔5 ～ 6 m，并且不同處理之間有排水溝作為間隔。每處理3 次重復(fù)。生草和除草處理均連續(xù)進(jìn)行2 a，處理之前套種油菜等作物；天然林為緊鄰李園樹冠外圍2 m 左右的天然槲櫟次生林。

1.2.2 樣品采集與制備

隨機(jī)在每個(gè)處理的樹林中隨機(jī)選取3 棵樹，其中天然林取自3 個(gè)處理李園同側(cè)近山頂?shù)? 棵樹（距山頂約15 m、距李園約45 m），距樹干1.5 m處取5 ～ 25 cm 深的土壤攤在硫酸紙上，去掉肉眼可見的石塊、粗根系等雜質(zhì)，充分混勻，取40 g左右裝入標(biāo)記好的離心管，再裝入盛有冰袋的冷藏樣品箱內(nèi)。取樣過程中使用的牙簽、硫酸紙等用具均經(jīng)過滅菌處理且不重復(fù)使用。樣品運(yùn)回室內(nèi)放入-80 ℃冰箱暫時(shí)保存，待下一步檢測(cè)。

1.2.3 土壤DNA 提取與測(cè)序

采用土壤DNA 提取試劑盒（FastDNA?Spin Kit for Soil） 提取土壤細(xì)菌DNA， 并對(duì)DNA 提取質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，即用NanoDrop2000 檢測(cè)OD260/OD280 比值在1.7 ～ 1.9 之間， 在1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰。取10 ng 的細(xì)菌DNA 作為基因擴(kuò)增的模板，采用正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：5×FastPfu Buffer 緩沖液4 μL，2.5 mM 的dNTPs2 μL，上下游引物（5 μM） 各0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNAPolymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL， 補(bǔ)ddH2O 至20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、30個(gè)循環(huán)，72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，10 ℃保存直至反應(yīng)結(jié)束。16S 基因測(cè)序送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用UPARSE 軟件（http：//drive5.com/uparse/）對(duì)97% 相似性的非重復(fù)序列（ 不含單序列）OTU（ 可操作分類單元，operational taxonomic unit）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。用單因素方差分析群落組成差異。使用PICRUSt2 軟件分析細(xì)菌的功能和代謝途徑[11]，進(jìn)一步使用FAPROTAX（Functional Annotation ofProkaryotic Taxa）軟件分析氮代謝相關(guān)功能[12]。使用LefSe（Linear Discriminant Analysis Effect Size）軟件分析細(xì)菌的富集和差異種類（https：//huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）。采用mothur 軟件（http：//www.mothur.org/wiki/Calculators） 計(jì)算Alpha、Chao1、Shannon 等多樣性指數(shù)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤細(xì)菌序列及OTU 分析

對(duì)不同耕作模式的土壤進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果如表1 所示。4 個(gè)樣本共有232 020 條原始序列數(shù)，177 305 條有效序列數(shù)，序列長(zhǎng)度范圍在220 ～ 510 bp 之間，最小長(zhǎng)度在220 ～ 265 bp 之間，最大長(zhǎng)度在490 ～ 510 bp 之間，平均序列長(zhǎng)度在412 bp。

由圖1 可知，不同樣品測(cè)得OUT 總數(shù)量為4 968 個(gè)，分屬于33 門、108 綱、242 目、383 科、667 屬。人工生草處理（AGO）的OTU 明顯要多于自然生草（NGO）、除草劑除（HO）以及天然林（SF）處理，各個(gè)樣品OTU 數(shù)大小順序?yàn)椋篈GO ＞ NGO ＞ HO ＞ SF，AGO 的OTU 數(shù)達(dá)3 522 個(gè)，SF 處理 OTU 最少為2 012 個(gè)、數(shù)量不及AGO 的2/3。4 個(gè)處理共有的OTU 數(shù)目為1 025 個(gè)，獨(dú)有的OTU 數(shù)目為AGO 的994、SF 的369、HO 的230 和NGO 的195 個(gè)，HO、SF 和AGO 共有的OTU 數(shù)78 個(gè)，HO、SF 和NGO 共有的OTU 數(shù)128 個(gè)，HO、AGO 和NGO 共有的OTU 數(shù)660 個(gè)，SF、AGO 和NGO 共有的OTU數(shù)115 個(gè)。除HO、AGO 和NGO 共有的OTU 較多外，其他幾個(gè)處理共有的物種均較少。由此可知，AGO 處理細(xì)菌種類最多，其次為NGO 和HO，SF處理細(xì)菌種類數(shù)最少。各自都有特有的一些細(xì)菌種類，尤其以AGO 處理較為明顯。

2.2 不同處理樣本稀釋曲線與Alpha 多樣性分析

2.2.1 樣本稀釋曲線

香濃（Shannon）指數(shù)代表物種多樣性的大小，同時(shí)又是檢測(cè)測(cè)序量是否足夠的一個(gè)依據(jù)，本試驗(yàn)在OTU 水平上繪制了香濃指數(shù)曲線，如圖2。從香濃指數(shù)稀釋曲線可知，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，曲線逐漸趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠。

2.2.2 Alpha 多樣性分析

由表2 可看出，4 個(gè)處理的土壤細(xì)菌被測(cè)出的物種覆蓋率都在98.8% 以上，說明被檢出概率達(dá)98.8% 以上，能反映樣本的細(xì)菌群落狀況。本試驗(yàn)檢測(cè)4 個(gè)處理樣本土壤細(xì)菌香農(nóng)（Shannon）、辛普森（Simpson）、Ace 和Chao 指數(shù)存在一定的差異（P ＜ 0.05）。其中香農(nóng)指數(shù)從大到小依次為：AGO ＞ HO ＞ NGO ＞ SF；辛普森指數(shù)從大到小順序則與香農(nóng)相反為：SF ＞ NGO ＞ HO ＞AGO；Ace 和Chao 指數(shù)大小順序相同，均為：AGO ＞ NGO ＞ HO ＞ SF。SF 的Ace 和Chao 指數(shù)顯著小于其他處理。上述結(jié)果說明，人工生草的細(xì)菌多樣性、均勻性和豐度最高，天然林Ace和Chao 指數(shù)最小，表明其細(xì)菌優(yōu)勢(shì)度最高，但其細(xì)菌種類多樣性則最低。

2.3 不同處理土壤細(xì)菌群落組成及差異種類分析

2.3.1 門水平的組成及差異

根據(jù)樣品間物種組成以及相對(duì)豐度大小繪制細(xì)菌門水平的分類柱狀圖，不同顏色代表不同的物種，高度代表該物種所占該樣品的相對(duì)豐度比例，物種豐度大于1% 的細(xì)菌門水平分類組成見圖3A?？梢钥闯?，幾個(gè)處理在門類組成上沒有差別，但是豐度比例上差異較大。豐度較大門類有綠彎菌門Chloroflexi、放線菌門Actinobacteriota、變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteriota、扁平菌門Planctomycetota、疣微菌門Verrucomicrobiota、黏球菌門Myxococcota、芽單胞菌門Gemmatimonadota、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidota、WPS-2、RCP2-54。AGO豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（29.39 %），酸桿菌門（19.74%）、放線菌門（19.16 %）、綠彎菌門（13.30 %），其他菌門豐度均小于5%；NGO 優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門（28.41 %），綠彎菌門（27.14 %）、變形菌門（20.80%）、酸桿菌門（10.80%），其他菌門豐度均小于5%。HO 優(yōu)勢(shì)菌門為綠彎菌門（42.95%），放線菌門（24.71%）、變形菌門（11.26%）、酸桿菌門（9.57%），其他菌門豐度比例均小于5 %。SF 優(yōu)勢(shì)菌門為酸桿菌門（ 33.02%），變形菌門（25.52 %）、放線菌門（ 16.62%）、綠彎菌門（11.88 %），其他菌門豐度均小于5%。綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門構(gòu)成了不同處理的主要種類，4 個(gè)門的總豐度在各個(gè)處理中都達(dá)到80% 以上。綠彎菌門在HO 處理中豐度顯著高于其他處理，而變形菌門顯著低于其他處理；SF 處理中的酸桿菌門、蛭弧菌門Bdellovibrionota、RCP2-54 豐度顯著高于其他處理；AGO 處理中的芽單胞菌門、德潘菌門Dependentiae 豐度顯著高于其他處理；酸桿菌門在SF 處理豐度比例高于其他處理。可見，不處理在門水平上具有各自的特點(diǎn)，即天然林的酸桿菌門豐度高，除草劑處理的綠彎菌門豐度高和變形菌門豐度低，人工生草處理的芽單胞菌門和德潘菌門豐度高，自然生草處理各個(gè)門類豐度介于其他處理之間（圖3B）。

2.3.2 綱水平的組成及差異

在綱水平上， 將豐度2% 以下合并入其他種類中， 如圖4A 所示，α - 變形菌綱Alphaproteobacteria、纖線桿菌綱Ktedonobacteria、酸桿菌綱Acidobacteriae、放線菌綱Actinobacteria、嗜熱油菌綱Thermoleophilia、γ‐ 變形菌綱Gammaproteobacteria 構(gòu)成主要種類， 占比到60% 以上。纖線桿菌綱在HO 中豐度達(dá)到34.02%， 酸桿菌綱在SF 中豐度達(dá)到32.60%。在HO 中α - 變形菌綱、γ ‐ 變形菌綱顯著低于其他處理， 酸微菌綱Acidimicrobiia 顯著低于AGO 處理，纖線桿菌綱（屬于綠彎菌門）顯著高于其他處理；綠彎菌綱Chloroflexia 在HO 中顯著高于SF，NGO 和AGO 介于兩者之間。而γ ‐ 變形菌綱Gammaproteobacteria、芽單胞菌綱Gemmatimonadetes、Babeliae、衣原體綱Chlamydiae 在AGO 中顯著高于其他處理。值得注意的是，蛭弧菌綱Bdellovibrionia 雖然在SF 和AGO 中豐度不足0.2%，但顯著高于其余2 個(gè)處理（圖4B）。可見，纖線桿菌綱和酸桿菌綱分別在HO 和SF 占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)。

2.3.3 目水平的組成及差異

在目水平上，如圖5A 所示，其他種類豐度明顯增高（將豐度3% 以下合并入其他種類），最少28.42% 以上（SF 處理）， 最高43.98%（AGO 處理）。同時(shí)，出現(xiàn)了未知或少見的種類，如Subgroup_2、norank_c_AD3 等。纖線桿菌目Ktedonobacterales、弗蘭克氏菌目Frankiales、根瘤菌目Rhizobiaoles、酸桿菌目Acidobacteriales、Elsterales、土壤紅桿菌目Solirubrobacterales 等構(gòu)成了主要種類，占比達(dá)到40% 以上。HO 中的纖線桿菌目豐度顯著高于其他處理，SF 和AGO 中的則較低。AGO 中的伯克氏菌目Burkholderiales、芽單胞菌目Gemmatimonadales、噬幾丁質(zhì)菌目Chitinophagales、黃單胞菌目Xanthomonadales顯著高于其他處理。HO 中的苔蘚桿菌目Bryobacterales 顯著低于其他處理。AGO 和NGO中的芽孢桿菌目（Bacillales）顯著高于其他2 個(gè)處理。酸桿菌綱的Subgroup_2 在SF 中顯著高于其他處理（圖5B）。

2.3.4 科水平的組成及差異

在科水平上，如圖6A 所示，將豐度3% 以下合并入其他種類后，其豐度最高已經(jīng)達(dá)到55.36%（AGO）。纖線桿菌科Ktedonobacteraceae、酸熱菌科Acidothermaceae、norank_o__Subgroup_2、黃色桿菌科Xanthobacteraceae、norank_o_Elsterales、norank_o_Acidobacteriales、紅色桿菌科Solirubrobacteraceae 為各個(gè)處理的主要種類， 占比30% 以上， 其中纖線桿菌科在HO 中最高、AGO 中最低， 差異顯著；norank_o_Subgroup_2 在SF 中顯著高于其他處理； 紅色桿菌科Solirubrobacteraceae 在HO 和NGO 中顯著高于SF 和AGO。此外，芽單胞菌科Gemmatimonadaceae、norank_o_Vicinamibacterales、SC-I-84、67-14 在AGO 中著高于其他處理，芽孢桿菌科Bacillaceae 在NGO 和AGO 中顯著高于HO 和SF。SF 中鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae 顯著低于其他處理。HO 中苔蘚桿菌科Bryobacteraceae 顯著低于其他3 個(gè)處理（圖6B）。

2.3.5 屬水平的組成及差異

在屬水平上，如圖7A 所示，將豐度3% 以下合并入其他（other）種類后，其豐度最高已經(jīng)達(dá)到59.91%（AGO），最低也達(dá)到41.60%（SF）。酸熱菌屬Acidothermus、固定桿菌屬Conexibacter、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium 等及眾多未能歸屬到屬水平的種類構(gòu)成土壤細(xì)菌的主要種類。說明在屬水平上，低豐度種類眾多、無法歸并到屬的種類繁多。norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_norank_o_Elsterales、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_RCP2-54 在SF 中顯著高于其他處理；固定桿菌屬Conexibacter、FCPS473、norank_f_norank_o_norank_c_TK10 在NGO 和HO 顯著高于另外2 個(gè)處理。HO 中苔蘚桿菌屬Bryobacter 顯著低于其他處理，norank_f_JG30-KF-CM45、1921-3顯著高于其他處理；芽孢桿菌屬Bacillus 在AGO和NGO 顯著高于另外2 個(gè)處理（圖7B）?？梢?，果園生草有利于芽孢桿菌屬等有益細(xì)菌群的建立。

2.4 不同處理土壤細(xì)菌富集類群分析

通過LefSe 細(xì)菌富集類群分析，LDA 閾值為3.5 時(shí)，除了能夠展現(xiàn)出高豐度類群外，還能更多展現(xiàn)一些低豐度類群在不同處理中富集，總共獲得72 個(gè)細(xì)菌富集類群（圖8）。在AGO 中，主要包括芽單胞菌門到芽單胞菌屬Gemmatimonas，還有維氏細(xì)菌門Vicinamibacteria 及其下屬分類的菌群、擬桿菌門Bacteroidota、babeliae 綱、babeliaes目、芽孢桿菌目，以及γ ‐變形菌綱、伯克氏菌目、Coxiellales 目、亞硝化單胞菌科Nitrosomonadaceae等29 個(gè)富集群。NGO 主要包括芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus、消化鏈球菌科Peptostreptococcaceae、未分類的小單孢菌科Micromonosporaceae 等6 個(gè)富集群。SF 主要包括酸桿菌綱下的Subgroup2、Elsteales 目及其下屬分類菌群、拜葉林克氏菌科beijerinckiaceae、RCP2-54 等15 個(gè)富集群。HO 主要包括綠彎菌綱、熱微菌目Thermomicrobiales、假諾卡氏菌科Pseudonocardiaceae、移桿菌屬M(fèi)otilibacter、JG30-KF-CM66、B12-WMSP1、TK10 等26 個(gè)富集群，這些多屬于綠彎菌門的下屬分類菌群。

2.5 不同處理土壤細(xì)菌功能分析

2.5.1 不同層級(jí)功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt 細(xì)菌功能分析顯示（圖9），一級(jí)功能層主要包括新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理等6 個(gè)方面，其中新陳代謝豐度最高、功能最活躍。二級(jí)功能層主要包括全局概覽通路、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、膜運(yùn)輸、類脂化合物代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝等46 種功能，其中概覽通路、碳水化合物代謝和氨基酸代謝等豐度較高、功能較活躍。無論一級(jí)功能層，還是二級(jí)功能層，不同處理之間并沒有明顯的差異，也就預(yù)示著不同處理對(duì)這功能的影響比較有限。

2.5.2 FAPROTAX 氮代謝相關(guān)功能預(yù)測(cè)分析

FAPROTAX 氮代謝相關(guān)功能分析顯示，主要功能包括了化能異養(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)、化能自養(yǎng)、光合營(yíng)養(yǎng)、有氧光能自養(yǎng)等細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)方式，以及固氮作用、硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化、氧化亞氮反硝化、亞硝酸鹽呼吸、硝酸鹽呼吸氮呼吸、尿素分解等與氮代謝相關(guān)的功能，此外，還包括纖維素分解、木質(zhì)素分解、芳香烴降解、芳香族化合物降解、脂肪族非甲烷烴降解等39 種功能（圖10A）?；墚愷B(yǎng)、有氧化能異養(yǎng)、纖維素分解、固氮作用等功能在所有處理中都比較旺盛，但處理之間差異不明顯，只有硝酸還原（nitrate_reduction）在SF 中顯著低于生草處理（人工和自然），與HO 差異不明顯（圖10B）。木質(zhì)素分解（ligninolysis）在SF 中比例最高、HO 中最低（圖10C），兩者差異顯著（P ＜ 0.05），另外2 個(gè)處理介于二者之間，甲基營(yíng)養(yǎng)（methylotrophy）則剛好相反（圖10D）。人工生草處理除了硝酸還原功能差異顯著外，反硝化作用、硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化等功能上也稍強(qiáng)于其他處理，只是差異不明顯?？梢姡斯ど萏幚硐跛徇€原功能強(qiáng)、氮代謝相對(duì)較旺盛；天然林木質(zhì)素分解功能強(qiáng)、木質(zhì)素分解對(duì)較旺盛；除草劑處理甲基營(yíng)養(yǎng)功能強(qiáng)、甲基營(yíng)養(yǎng)利用相對(duì)較旺盛。

3 討 論

3.1 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和種類結(jié)構(gòu)的影響

土壤細(xì)菌種類豐富，大約2% 的少數(shù)主要種類廣布于全球各種類型土壤中，但其豐度高達(dá)41%[1]。紫云縣李園及其鄰近天然次生林檢測(cè)到33 門、108 綱、242 目、383 科、667 屬， 但是主要以綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門為主，各處理中4 個(gè)門的總豐度達(dá)到80% 以上，在油茶林中這4 個(gè)門也表現(xiàn)出近似的特點(diǎn)[14]。天然林OUT 雖然數(shù)量最少，不到人工生草處理的2/3，但優(yōu)勢(shì)度最高，主要體現(xiàn)酸桿菌上，豐度高并富集形成優(yōu)勢(shì)菌群。酸桿菌是土壤中廣泛存在的細(xì)菌門類，尤其是天然森林系統(tǒng)中豐度比較高，但天然林轉(zhuǎn)換為耕地后豐度會(huì)明顯下降[15]。李園耕作可能是酸桿菌豐度降低的重要影響因素，尤其是使用除草劑的果園[10]。此外，天然林中，鞘脂單胞菌Sphingomonadaceae 豐度顯著低于其他處理，鞘脂單胞菌被認(rèn)為與枯萎病發(fā)生密切相關(guān)的病原菌[16]，預(yù)示李園耕作活動(dòng)增加了枯萎病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。李園使用除草劑增加了綠彎菌門而降低了變形菌門、酸桿菌門的豐度，綠彎菌門是因其特有的光合色素（BChl a 和BChl c） 而確立的較新細(xì)菌門，其中的纖線桿菌綱可產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，綠彎菌很多種類具有光能和化能自養(yǎng)或異養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)方式，除草劑的使用形成了裸露的地表，增加了果園地面的光照和通風(fēng)條件，為綠彎菌的發(fā)展提供較好的光照環(huán)境，也為纖線桿菌綱產(chǎn)生、擴(kuò)散氣生菌絲和孢子營(yíng)造了適宜的環(huán)境，而密閉的天然林下則不利于綠彎菌的發(fā)展[17]。在植被恢復(fù)試驗(yàn)中，裸露的地表有利于綠彎菌門形成優(yōu)勢(shì)菌群，通風(fēng)透照條件可能對(duì)綠彎菌門的影響比較大[18]。人工生草處理中芽單胞菌和德潘菌門豐度顯著高于其他處理，芽單胞菌從門到屬水平都在處理中富集，相反根瘤菌種類并沒有富集[19]，芽單胞菌與地面的植被可能存在一定的關(guān)聯(lián)[20]，芽單胞菌適宜濕度相對(duì)穩(wěn)定而適中土壤環(huán)境，人工種植光葉紫花苕生草具有很好的覆蓋效果，在改善土壤濕度可能發(fā)揮了很重要的作用，進(jìn)而給芽單胞菌營(yíng)造了良好的環(huán)境[21]。但是，芽單胞菌與光葉紫花苕之間的內(nèi)在聯(lián)系還有待更深入的研究去揭示。芽孢桿菌是重要益生菌，在病蟲害生物防治和生固氮等方面具有重要的價(jià)值，其科和屬在生草處理（人工和自然）中豐度顯著高于另外2個(gè)處理，并且富集形成主要的菌群，固氮草種可能是其中重要的影響因素[22]。高通量測(cè)序技術(shù)雖然為土壤細(xì)菌種類的組成和結(jié)構(gòu)的分析帶來了便利，但是這些都依賴于形態(tài)學(xué)的分類基礎(chǔ)，可是至今依然有很多細(xì)菌種類還沒有分離、培養(yǎng)、鑒定，導(dǎo)致通過基因測(cè)序分析也不能鑒定到具體的種類，影響了結(jié)果分析的針對(duì)性和結(jié)論的指導(dǎo)性。例如，在目水平種類結(jié)構(gòu)分析上，SF 處理中Subgroup2（屬于酸桿菌綱）豐度最高、與其他處理比較差異極顯著，但是卻鑒定不到具體種類，影響了進(jìn)一步的深入分析。此外，土壤細(xì)菌種類結(jié)構(gòu)受到時(shí)空影響比較大，而貴州山區(qū)地形地貌比較復(fù)雜、土地比較破碎。在下一步研究中，只有加強(qiáng)土壤細(xì)菌的分離、鑒定，重視取樣點(diǎn)在時(shí)間和空間上的合理布局，才能更全面地反映一定區(qū)域內(nèi)的土壤細(xì)菌種類特征。

3.2 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌生態(tài)功能的影響

土壤中高豐度的細(xì)菌種類決定土壤代謝的基礎(chǔ)功能，而低豐度種類則在某些特殊的功能方面發(fā)揮積極的作用[23]。功能分析表明，氨基酸或氮代謝、能量代謝是土壤細(xì)菌的主要生態(tài)功能，這些都與放線菌門、變形菌門和酸桿菌門等這幾個(gè)優(yōu)勢(shì)門類相關(guān)[24]。天然林土壤木質(zhì)素分解功能最強(qiáng)、除草劑處理李園最弱，天然林的木質(zhì)素來源豐富，包括枯枝落葉、倒木、根系等，因此具備豐富的木質(zhì)素分解功能的細(xì)菌與自然生境比較吻合，其中酸桿菌可能發(fā)揮了重要的作用[15]，而除草劑使得果園地表光禿，缺少了木質(zhì)素來源。甲基營(yíng)養(yǎng)利用是除草劑處理土壤中一個(gè)比較顯著的功能，甲基營(yíng)養(yǎng)的利用目前已經(jīng)在芽孢桿菌、嗜甲基菌（Methylophilaceae）已經(jīng)有所研究[25-27]，纖線桿菌綱或綠彎菌門下的其他種類是否可利用甲基營(yíng)養(yǎng)還未見報(bào)道。人工生草處理的亞硝酸還原功能則可能與亞硝化單胞菌科Nitrosomonadaceae 密切關(guān)聯(lián)。在李生產(chǎn)中，磷、鉀肥不但是生長(zhǎng)所需的3種大量元素中的2 種，而且其與果實(shí)品質(zhì)關(guān)系密切，在下一步研究中，需要更關(guān)注土壤細(xì)菌與磷、鉀代謝的相關(guān)功能。

4 結(jié) 論

天然林Ace 和Chao 指數(shù)顯著低于李園的3 個(gè)處理，土壤酸桿菌優(yōu)勢(shì)度高，病原細(xì)菌少，并有少量的有益細(xì)菌蛭弧菌；李園鞘脂單胞菌相關(guān)病害的風(fēng)險(xiǎn)大，生草可在一定程度上提高芽孢桿菌等有益細(xì)菌的豐度，尤其自然生草比較明顯。人工生草還有利于提高李園細(xì)菌的多樣性，尤其是芽單胞菌的富集比較明顯。使用除草劑的李園則主要富集了具有光合自養(yǎng)能力的綠彎菌門種類，而降低苔蘚桿的豐度。在土壤細(xì)菌生態(tài)功能上，人工生草李園土壤硝酸還原功能強(qiáng)、氮代謝相對(duì)較旺盛；天然林土壤木質(zhì)素分解功能強(qiáng)、木質(zhì)素分解相對(duì)較旺盛；除草劑處理李園土壤甲基營(yíng)養(yǎng)功能強(qiáng)、甲基營(yíng)養(yǎng)利用相對(duì)較旺盛。

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[ 本文編校：趙 坤]

基金項(xiàng)目：貴州省科技支撐項(xiàng)目（黔科合支撐〔2020〕1Y028 號(hào)，黔科合支撐〔2019〕2265 號(hào)）。