基于RNA-Seq 探究蔗糖影響黑果枸杞枝刺發(fā)生的機(jī)理

摘 要：【目的】黑果枸杞Lycium ruthenicum 是集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值等為一體的灌木。然而，其密集的枝刺嚴(yán)重阻礙其作為經(jīng)濟(jì)林推廣，本研究旨在探究蔗糖（Suc）促進(jìn)黑果枸杞（黑杞）枝刺的發(fā)生機(jī)理，為培育其無刺優(yōu)良品種提供依據(jù)。【方法】在證明Suc 通過能量和信號(hào)路徑促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生的基礎(chǔ)上，利用RNA-Seq對(duì)無刺莖頂芽（TleCK）、有刺莖頂芽（ThoCK）、黑暗處理的有刺莖頂芽（ThoDCK）、減少內(nèi)源Suc 處理后有刺變無刺莖頂芽（TleDPL）和噴施外源Suc 后無刺變有刺莖頂芽（ThoSuc）5 種樣品的差異表達(dá)基因（DEG）和葉綠體差異基因（cpDEG）進(jìn)行篩選和分析，并采用RT-qPCR 驗(yàn)證了9 個(gè)DEG 的表達(dá)情況。【結(jié)果】5 組有刺和無刺材料頂芽之間（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL、TleCK vs. ThoSuc 和TleDPL vs. ThoSuc）的DEG 分別為5 281、4 363、3 125、5 226 和3 278 個(gè)，這5 組DEG 共同顯著富集在9 個(gè)GO 條目和4 個(gè)KEGG 通路（“類黃酮生物合成”“二萜生物合成”“苯丙烷生物合成”、“芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成”）。韋恩圖顯示5 組比較組共有的DEG 是196 個(gè)，其中33 個(gè)被預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子基因，較多轉(zhuǎn)錄因子基因被預(yù)測(cè)為NAC 和WRKY 家族。5 組比較組有3 個(gè)共有DEG 注釋在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG通路，分別參與生長(zhǎng)素、茉莉酸和水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)。3 個(gè)關(guān)鍵有刺和無刺比較組（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs.TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc）中共有2 個(gè)DEG 被預(yù)測(cè)為TCP 轉(zhuǎn)錄因子基因，這3 個(gè)比較組均有cpDEG 被注釋到光合作用KEGG 通路。9 個(gè)DEG 的RT-qPCR 驗(yàn)證了RNA-Seq 結(jié)果的可靠性?！窘Y(jié)論】Suc 可能通過影響生長(zhǎng)素、茉莉酸和水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)以及赤霉素合成基因表達(dá)來促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生，枝刺發(fā)生也可能與類黃酮積累和木質(zhì)素減少有關(guān)，而且增施外源和減少內(nèi)源Suc 并非通過簡(jiǎn)單地逆轉(zhuǎn)cpDEG 的表達(dá)來影響枝刺發(fā)生。注釋到WRKY、TCP 和NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族的共有DEG 可能是調(diào)控枝刺發(fā)生的關(guān)鍵基因。本研究建立了Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生的機(jī)理模型圖。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞；頂芽；枝刺；RNA-Seq；蔗糖

中圖分類號(hào)：S665.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）01—0126—14

黑果枸杞Lycium ruthenicum 屬茄科多年生灌木，兼具生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[1]，具有抗旱、抗寒、抗風(fēng)沙、耐鹽堿和耐貧瘠的特性[2]，已被用來修復(fù)我國西北地區(qū)鹽漬化土壤[3]，是西北地區(qū)的特色植物資源[4]，在沙漠生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用[5]。最新研究表明，黑果枸杞（黑杞）含有豐富的多糖、花青素、黃酮類化合物、甜菜堿和多酚類化合物等活性成分[6]，尤其是花青素含量特別高，具有抗氧化[7]、抗炎[8]、緩解記憶障礙[9]、調(diào)節(jié)腸道菌群[8]、護(hù)肝[10] 等功能，且被用來穩(wěn)定食品并延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[11]。此外，黑杞含17 種氨基酸[12]，還富含酚酸、類胡蘿卜素、生物堿、維生素、精油等多種成分[13]，果實(shí)可以直接食用或用于制作營養(yǎng)食品和飲料的原料[14]。

植物刺類型多樣，在被子植物中常見，在相對(duì)低等的裸子植物中較少見，主要有保護(hù)、警戒、攀援和抗逆作用[15]。相比于側(cè)枝，植物枝刺的研究相對(duì)滯后。黑杞的刺為枝刺，本課題組前期顯微觀察發(fā)現(xiàn)黑杞枝刺起源于葉腋處的刺原基；在充分的土壤水分條件下，組培無性黑杞盆栽的刺原基可以不發(fā)育為可見枝刺，干旱促進(jìn)無性系盆栽產(chǎn)生可見枝刺[16]；黑杞的刺原基發(fā)育為可見枝刺后覆蓋腋芽，可能在保護(hù)腋芽中起重要作用，黑杞枝刺的有無與該莖節(jié)處葉片基因組DNA 的甲基化修飾有關(guān)[16]。本課題組通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)黑杞蔗糖合酶基因（LrSUS）促進(jìn)其枝刺的發(fā)生[17]，發(fā)現(xiàn)0.1 mg/L 外源IAA 處理抑制黑杞有刺莖新生莖節(jié)枝刺發(fā)生[18]。對(duì)柑橘Citrus 的研究發(fā)現(xiàn)采用CRISPR/Cas9 方法構(gòu)建的ti1 ti2 雙突變體植株表現(xiàn)出幾乎每根枝刺都轉(zhuǎn)化分枝[19]。Zhang等[20] 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因柑橘CsCEN-OX 的前16 個(gè)節(jié)中有超45% 的枝刺轉(zhuǎn)化為休眠芽，約15% 的枝刺轉(zhuǎn)化為休眠分枝，同時(shí)構(gòu)建的cscen ti1 ti2 三突變體表現(xiàn)出與ti1 ti2 雙突變體相似的表型，cscen ti1ti2 三突變體幾乎每根枝刺也向分枝轉(zhuǎn)化。盡管植物枝刺有重要的作用，但是參照沙棘Hippophaerhamnoides‘無刺豐’和刺鈍化的寧夏枸杞Lyciumbarbarum 的優(yōu)良生產(chǎn)表現(xiàn)，推測(cè)同等條件的無刺、少刺或刺鈍化黑杞更適宜作為經(jīng)濟(jì)林栽培。

至今尚未發(fā)現(xiàn)完全無刺黑杞，前期研究曾發(fā)現(xiàn)黑杞一個(gè)組培無性系枝刺的表型具備可塑性。該無性系于組培瓶中時(shí)均無肉眼可見枝刺，移栽后置于玻璃溫室的相同條件下，會(huì)出現(xiàn)完全無刺（肉眼觀測(cè)）和有刺兩種類型，且其無刺類型單簇葉片數(shù)量也顯著少于有刺類型[21]；移栽大田之后，該無性系有刺和無刺植株的新發(fā)莖又均能產(chǎn)生肉眼可見的枝刺。本研究以上述溫室無性系盆栽的有刺和無刺植株為原始材料，在發(fā)現(xiàn)增施外源蔗糖（Suc）促進(jìn)枝刺發(fā)生、減少內(nèi)源Suc 抑制枝刺發(fā)生的基礎(chǔ)之上[21]，以對(duì)照有刺和無刺植株頂芽、黑暗處理的有刺莖頂芽、增施外源Suc 后無刺變有刺莖頂芽、減少內(nèi)源Suc 后有刺變無刺莖頂芽共5 類為實(shí)驗(yàn)材料，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）的方法探索Suc 影響枝刺發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝路徑。本研究挖掘了Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生的相關(guān)基因和代謝路徑，為培育黑杞無刺、少刺優(yōu)良品種和其他枝刺植物的分子育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用玻璃溫室1 年生有刺和無刺黑杞長(zhǎng)度為15 ～ 25cm 的新發(fā)枝條為原始試驗(yàn)材料，進(jìn)行增施外源和減少內(nèi)源Suc 的處理。所有植株均來自一個(gè)黑果枸杞組織培養(yǎng)無性系[16]。此外，無刺植株整枝無肉眼可見枝刺，有刺植株枝條通常從上往下數(shù)的前4 ～ 5 個(gè)莖節(jié)無肉眼可見枝刺，其余莖節(jié)有肉眼可見枝刺，但隨著發(fā)育的進(jìn)行，所有莖節(jié)將逐漸依次出現(xiàn)肉眼可見枝刺。采用原始有刺、無刺莖頂芽、黑暗處理后有刺莖頂芽、增施外源和減少內(nèi)源Suc 處理后刺表型顯著變化的枝條頂芽為試驗(yàn)材料，進(jìn)行RNA-Seq 以及RT-qPCR分析。

1.2 噴施外源Suc 和減少內(nèi)源Suc 處理

前期研究顯示，黑杞有刺莖頂芽的Suc 含量顯著高于無刺莖頂芽[21]，推測(cè)外源施加Suc 能促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生，減少內(nèi)源Suc 合成能抑制其枝刺發(fā)生。因此，對(duì)無刺和有刺黑杞分別進(jìn)行增施外源和減少內(nèi)源Suc 的處理。參照前期報(bào)道[22]，本研究采取噴施外源Suc 方法來提高內(nèi)源Suc 的含量。具體方法如下：采用46.74 mmol/L 的Suc 溶液噴灑健康、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的無刺黑杞枝條，對(duì)照噴施等量清水，每日每盆噴灑3 mL 溶液或清水。參照前人的報(bào)道，本研究采用黑暗[23] 聯(lián)合去葉[24-25] 的方法來降低內(nèi)源Suc 含量。具體方法為先黑暗處理盆栽48 h 消耗其內(nèi)源糖，然后將黑暗處理后的一半材料作為對(duì)照組，不做任何其他處理；另外一半為去葉組（保留頂芽處4 ～ 6 片葉，其余葉片摘除）。整個(gè)處理周期內(nèi)，去葉組頂芽處始終保留4 ～ 6 片葉。以上試驗(yàn)均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理10 盆（灌木多枝）。處理14 d 后，統(tǒng)計(jì)分析各類對(duì)照和處理材料新發(fā)莖的有刺莖節(jié)率。因?yàn)闊o刺和有刺枝條的頂端4 莖節(jié)均無肉眼可見枝刺，因此新發(fā)莖有刺莖節(jié)率= 有刺的新發(fā)節(jié)數(shù)/（新發(fā)總節(jié)數(shù)- 頂端4 節(jié)數(shù)）×100%。

1.3 RNA-Seq 分析

前期對(duì)未經(jīng)處理的黑杞無刺（TleCK）和有刺（ThoCK）莖頂芽2 種材料進(jìn)行過RNA-Seq 分析，探索影響枝刺發(fā)生的基因[21]。為了進(jìn)一步探索哪些基因通過響應(yīng)增施外源、減少內(nèi)源Suc 處理來影響黑杞枝刺發(fā)生，采用RNA-Seq 分析比較未經(jīng)處理的無刺和有刺黑杞莖頂芽、黑暗處理的有刺黑杞莖頂芽（ThoDCK）、有刺黑杞減少內(nèi)源Suc 處理后新生完全無刺莖的頂芽（TleDPL）、無刺植株增施外源Suc 處理后新發(fā)的變有刺莖頂芽（ThoSuc）5 種材料。每種材料設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含50 個(gè)左右的頂芽，樣品送至中國南京派森諾公司進(jìn)行RNA-Seq 分析。

1.3.1 RNA 制備、文庫構(gòu)建、測(cè)序與組裝

采用Invitrogen 的TRlzol 試劑，按照制造商說明提取上述5 種材料的總RNA，采用RNA 專用瓊脂糖電泳檢測(cè)。通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA 中帶有polyA 結(jié)構(gòu)的mRNA，采用離子打斷的方式，將mRNA 片段化后合成cDNA。通過Agilent 2100 Bioanalyzer 對(duì)構(gòu)建完成的文庫進(jìn)行質(zhì)檢?；贗llumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)，對(duì)這些文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序。使用Trinity 軟件對(duì)Clean Reads 進(jìn)行拼接得到Transcript 后再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2 表達(dá)量、樣品相關(guān)性分析

本研究進(jìn)行無參RNA-Seq 分析。使用轉(zhuǎn)錄組表達(dá)定量軟件RSEM，以Transcript 序列為參考，分別將每個(gè)樣品的Clean Read 比對(duì)到參考序列上。利用RSEM 計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平[26]。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)r 作為樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)。

1.3.3 功能注釋、差異表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子分析

利用NR、GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot和Pfam 數(shù)據(jù)庫對(duì)基因進(jìn)行功能注釋。首先，與常規(guī)無參RNA-Seq 一樣，采用DESeq 對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析[27]，將差異倍數(shù)|log2Fold Change| ＞1 且顯著性P ＜ 0.05 的認(rèn)定為差異表達(dá)基因（DEG）。其次， 將測(cè)序Clean Read 比對(duì)到黑杞葉綠體參考基因組（SRX19877303），將符合|log2Fold Change| ＞ 1 且P ＜ 0.05 的葉綠體基因篩選為葉綠體差異基因（cpDEG）。本研究之所以篩選cpDEG，是因?yàn)橛写毯蜔o刺材料Suc 含量及葉片數(shù)量的差異提示刺的發(fā)生可能與光合作用相關(guān)，而光合作用的場(chǎng)所為葉綠體且受葉綠體基因影響[28]。采用超幾何檢驗(yàn)確定DEG 顯著富集的GO 條目和KEGG 通路。使用topGO 進(jìn)行GO 富集分析，將FDR ＜ 0.05 定義為顯著富集的GO 條目。選取P ＜ 0.05 的KEGG 通路為DEG 顯著富集的KEGG 通路。被上調(diào)DEG顯著富集（P ＜ 0.05）的DEG 通路被認(rèn)定為顯著上調(diào)的KEGG 通路；被下調(diào)DEG 顯著富集的被認(rèn)定為顯著下調(diào)的KEGG通路。根據(jù)5 組有刺和無刺比較組（ThoCK vs.TleCK、TleDPL vs. ThoSuc、ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc）之間的DEG 繪制Venn 圖，用來展示各比較組間DEG 的個(gè)數(shù)以及重疊關(guān)系。將DEG 與PlantTFDB（PlantTranscription Factor Database）數(shù)據(jù)庫比較，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。

1.4 RT-qPCR

RT-qPCR 的材料、生物學(xué)重復(fù)與RNA-Seq材料相同。對(duì)提取出達(dá)標(biāo)的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。按照制造商的說明，使用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for Qpcr（+gDNAwiper）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)選擇9 個(gè)高表達(dá)DEG進(jìn)行RT-qPCR 分析， 按照論文[21] 的標(biāo)準(zhǔn)篩選SCAB3IX1 作為內(nèi)參基因。定量反應(yīng)體系按照ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 的說明進(jìn)行，RT-qPCR 條件為：95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（45 個(gè)循環(huán)），設(shè)置3 次重復(fù)，采用2?ΔΔCT 方法[29] 計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0 軟件對(duì)RT-qPCR 結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本T 檢驗(yàn)分析（P ＜ 0.05，0.01，0.001），對(duì)有刺莖節(jié)率數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本T 檢驗(yàn)（P ＜ 0.05）和單因素方差分析（LSD，P ＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 增施外源和減少內(nèi)源Suc 處理后刺表型變化

外源噴施Suc 會(huì)促使原本完全無刺莖（圖1A）的新生莖節(jié)發(fā)生大量可見枝刺（圖1B），同時(shí)單簇葉片數(shù)量也有所增加（圖1B）。噴施Suc處理后新發(fā)莖有刺莖節(jié)率為90.08±0.84%，顯著高于清水對(duì)照組（11.91±0.09%）。此外，Suc 處理組的刺長(zhǎng)和刺寬也均顯著高于對(duì)照組[21]。對(duì)有刺植株做黑暗聯(lián)合去葉處理顯著抑制新發(fā)枝條枝刺發(fā)生，處理后有刺莖節(jié)率僅為33.98±3.08 %，顯著低于未處理的有刺對(duì)照（98.11±1.89 %），處理后新生莖節(jié)甚至無任何可見枝刺發(fā)生（圖1C）。但是，單獨(dú)黑暗處理并不能抑制枝刺發(fā)生（圖1D）。

2.2 RNA-Seq 建庫、組裝及Unigene 功能注釋

5 種15 個(gè)樣品測(cè)序，總共獲得98.56 Gb 的Clean Data。每個(gè)樣品的Q30 值達(dá)93.20 % 以上。經(jīng)過Trinity 組裝共得到87 336 個(gè)Unigene，其中長(zhǎng)度大于N50 的序列總數(shù)為15 956，Unigene 的GC 含量38.25 %。有6 666 個(gè)Unigene 在6 個(gè)數(shù)據(jù)庫中均有被注釋，基因總注釋率為51.59 %。

2.3 差異表達(dá)分析

2.3.1 5 類樣品間的相關(guān)性

5類共15個(gè)樣品均來自一個(gè)黑杞組培無性系，結(jié)果顯示每類樣品的3 次生物學(xué)重復(fù)均優(yōu)先歸為一類，同類樣品生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)系數(shù)多數(shù)為1（圖2），這可能是因?yàn)槊看紊飳W(xué)重復(fù)頂芽數(shù)量較多（50 左右）且均為一個(gè)無性系。說明本研究的生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性極強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)可靠。

2.3.2 DEG 統(tǒng)計(jì)

差異表達(dá)分析顯示有刺和無刺對(duì)照（ThoCKvs. TleCK）之間的DEG 數(shù)量最多（5 281），其中無刺對(duì)照中上調(diào)的基因數(shù)（3 777）多于下調(diào)的基因數(shù)（1 504）（圖3）。除上述對(duì)照組外，ThoCK vs. TleDPL 以及TleCK vs. ThoSuc 是用于揭示響應(yīng)Suc 且影響枝刺發(fā)生關(guān)鍵基因的最核心組別，其DEG 數(shù)分別是4 363 和5 226，且有刺材料中上調(diào)DEG 數(shù)均小于下調(diào)數(shù)（圖3）。

2.3.3 DEG 的Venn 圖統(tǒng)計(jì)

為了更加嚴(yán)格地篩選與黑杞枝刺發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵候選基因，對(duì)5 個(gè)有刺和無刺比較組的DEG繪制Venn 圖，發(fā)現(xiàn)這5 組對(duì)比組共有的DEG 為196 個(gè)（圖4），這196 個(gè)DEG 很可能就是影響黑杞枝刺發(fā)生的關(guān)鍵基因，可用于后續(xù)開展深入的研究。

2.3.4 DEG 的GO 富集

GO 數(shù)據(jù)庫注釋主要分為3 類： 生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。這5 組比較組的DEG 共同顯著富集在MF 的1 個(gè)GO 條目和BP 的8 個(gè)GO 條目，這9 個(gè)GO 條目表明黑杞枝刺發(fā)生可能響應(yīng)酸性化合物、含氧復(fù)合物、內(nèi)源性刺激、激素、損傷、刺激、壓力，并可能與氧化還原酶活性及氧化還原過程相關(guān)。

2.3.5 DEG 顯著富集的KEGG 代謝通路

5 個(gè)有刺和無刺比較組DEG 共同顯著富集4 個(gè)KEGG 代謝通路（表1），表明黑杞枝刺的發(fā)生可能與類黃酮、苯丙烷、二萜、芪類、二芳基庚烷、姜辣素等次生代謝物有關(guān)，其中的2 個(gè)KEGG 代謝通路（類黃酮生物合成，芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成）在3 個(gè)關(guān)鍵比較組（ThoCK vs. TleCK、ThoCK vs. TleDPL、TleCKvs. ThoSuc）的無刺材料（TleCK 和TleDPL）中均被下調(diào)DEG 顯著富集。這表明低Suc 可能通過降低類黃酮、芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成來抑制黑杞枝刺發(fā)生，高Suc 則可能相反。5 組比較組共有的196 個(gè)DEG 中有4 個(gè)注釋在上述2個(gè)共同顯著富集的KEGG 通路；注釋到二萜生物合成通路2 個(gè)DEG 中的1 個(gè)（赤霉素3-β- 雙加氧酶基因GA3ox1）在5 個(gè)比較組的無刺材料中均上調(diào)，而另外1 個(gè)DEG（四甲基十六碳四烯醇合酶GES）則在所有無刺材料中均下調(diào)；注釋到苯丙烷生物合成KEGG 通路的2 個(gè)DEG 中的1 個(gè)（過氧化物酶47 Perid47）在5 個(gè)比較組的無刺材料中均上調(diào)，而另外1 個(gè)DEG（木質(zhì)素形成陰離子過氧化物酶基因LFAP）的表達(dá)雖然沒有這么一致的規(guī)律，但是在4 個(gè)比較組（除去ThoDCKvs. TleDPL）無刺材料中均表現(xiàn)為上調(diào)。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG 通路被4 個(gè)有刺和無刺比較組（ThoCK vs. TleDPL、ThoDCK vs. TleDPL、TleCK vs. ThoSuc 和TleDPL vs. ThoSuc） 的DEG顯著富集，此通路雖然沒被ThoCK vs. TleCK 比較組的DEG 顯著富集，但是這5 組有3 個(gè)共有的在無刺材料中均上調(diào)或下調(diào)的DEG 參與該通路。其中，基因JAZ（蛋白TIFY 10A- 樣異構(gòu)體X2 基因）在所有5 個(gè)比較組的無刺材料中均下調(diào)，其表達(dá)產(chǎn)物位于茉莉酸信號(hào)通路，且參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解。假定蛋白H5410 _ 039438 基因SAUR 在無刺材料表達(dá)均上調(diào)，其表達(dá)產(chǎn)物位于生長(zhǎng)素信號(hào)通路，參與細(xì)胞增大植株生長(zhǎng)；PR1 蛋白前體基因PR-1 在無刺材料中表達(dá)均上調(diào)，且其表達(dá)產(chǎn)物位于水楊酸信號(hào)通路，參與抗病性。以上發(fā)現(xiàn)說明Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生可能與茉莉酸、生長(zhǎng)素和水楊酸信號(hào)的傳導(dǎo)及相關(guān)基因有關(guān)。另外，ThoCK vs. TleCK、ThoDCK vs. TleDPL 和TleCKvs. ThoSuc 這3 組的DEG 均顯著富集在淀粉和蔗糖代謝KEGG 通路，3 組共有DEG 在TleCK vs.ThoSuc 組的有刺材料中表達(dá)上調(diào)，此DEG 參與Suc 降解過程，注釋信息為α- 葡萄糖苷酶（AG）（表2）。這表明Suc 處理后黑杞頂芽?jī)?nèi)源Suc 降解可能會(huì)顯著提高。此外，在另兩個(gè)比較組（ThoCKvs. TleCK 和ThoDCK vs. TleDPL） 的有刺樣品（ThoCK 和ThoDCK）中該DEG表達(dá)亦上調(diào)（表2）。以上結(jié)果證明AG 基因的高表達(dá)與枝刺發(fā)生相關(guān)，降低該基因的表達(dá)有可能會(huì)成功抑制枝刺發(fā)生。

2.3.6 葉綠體cpDEG

本部分重點(diǎn)分析3 個(gè)關(guān)鍵比較組（ThoCK vs.TleCK、TleCK vs. ThoSuc 和ThoCK vs. TleDPL）的DEG 和cpDEG 注釋到光合作用KEGG 通路的情況。黑杞ThoCK vs. TleCK 組共有4 個(gè)cpDEG（表3），在無刺樣品（TleCK）中表達(dá)均下調(diào)，且其表達(dá)產(chǎn)物均參與光合作用KEGG 通路（圖5）；在無參轉(zhuǎn)錄組DEG 篩選中發(fā)現(xiàn)該比較組有9 個(gè)DEG 注釋到光合作用KEGG 通路。因?yàn)榛刭N葉綠體基因組的有參分析方法可以更準(zhǔn)確地篩選出黑杞cpDEG，因此將無參RNA-Seq 分析得到的注釋到光合作用KEGG 通路且來自葉綠體基因組的DEG 去掉，剩余的6 個(gè)細(xì)胞核DEG 表達(dá)產(chǎn)物是光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）、PSI 和光合電子傳遞鏈的組成部分，且其中5 個(gè)在無刺材料下調(diào)（圖5）。TleCK vs. ThoSuc 組3 個(gè)cpDEG 在Suc 處理后有刺樣品（ThoSuc）中表達(dá)下調(diào)，其中2 個(gè)cpDEG注釋到光合作用KEGG 通路，另外1 個(gè)編碼RNA聚合酶PEP 的β″ 亞基[30]（表3）；分析該組的無參RNA-Seq 發(fā)現(xiàn)2 個(gè)細(xì)胞核DEG 注釋到光合作用KEGG 通路，1 個(gè)PetF 基因在無刺材料上調(diào)，另外1 個(gè)PetC 基因則下調(diào)。ThoCK vs. TleDPL組cpDEG 有2 個(gè)注釋到核糖體KEGG 通路，表達(dá)核糖體蛋白，且一個(gè)上調(diào)一個(gè)下調(diào)；該組有1個(gè)cpDEG 在無刺樣品表達(dá)下調(diào)且注釋到光合作用KEGG 通路（表3）。此外，該組的無參DEG 篩選發(fā)現(xiàn)3 個(gè)細(xì)胞核DEG 注釋到光合作用KEGG 通路，其中2 個(gè)DEG（分別表達(dá)PetC 和PetF）在無刺材料表達(dá)上調(diào)，1 個(gè)PetF 基因表達(dá)下調(diào)。3 個(gè)關(guān)鍵比較組無共有的cpDEG（表3），也無共有的注釋到光合作用KEGG 通路的細(xì)胞核DEG。

2.3.7 差異轉(zhuǎn)錄因子

5 組比較組共有的196 個(gè)DEG 中被預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子的DEG 有33 個(gè)，主要分布于NAC、bHLH、WRKY 這3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。此外，本研究中的3 組關(guān)鍵比較組（ThoCK vs. TleCK，ThoCK vs. TleDPL 和TleCK vs. ThoSuc） 的共有轉(zhuǎn)錄因子中有兩個(gè)注釋為TCP4（TRINITY_DN3219_c1_g3、TRINITY_DN17710_c0_g1），且在無刺材料（TleCK 和TleDPL）均表達(dá)下調(diào)。

2.4 RT-qPCR 驗(yàn)證RNA-Seq 結(jié)果可靠

RT-qPCR 結(jié)果表明，9 個(gè)DEG 在ThoCK vs.TleCK 比較組（ 圖6A—B）、ThoCK vs. TleDPL比較組（圖6C—D）、ThoDCK vs. TleDPL 比較組（圖6E—F）、TleCK vs. ThoSuc 比較組（圖6G—H）和TleDPL vs. ThoSuc 比較組（圖6I—J）中的表達(dá)差異情況與RNA-Seq 中的一致，這表明本研究的RNA-Seq 實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

黑杞枝刺表型具備典型的可塑性，同一無性系于試管內(nèi)、溫室內(nèi)和露天條件下枝刺表型不同[16]。在溫室內(nèi)相同條件下同一移栽無性系可以出現(xiàn)有刺和無刺兩種類型。本研究和我們前期研究[21]均發(fā)現(xiàn)刺的有無與頂芽Suc 含量有關(guān)：增施外源Suc 促進(jìn)其枝刺發(fā)生，反之抑制其枝刺發(fā)生。Suc通過能量和信號(hào)雙重作用促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生[21]。本研究以溫室內(nèi)原本的無刺和有刺植株為原始材料，增施外源和減少內(nèi)源Suc 后枝刺發(fā)生率有明顯變化，甚至從有刺變?yōu)橥耆珶o刺或者從無刺變?yōu)橥耆写痰臓顟B(tài)。選取5 種材料頂芽為試驗(yàn)材料，進(jìn)行RNA-Seq 分析，以揭示Suc 通過哪些基因和路徑來影響溫室內(nèi)黑杞無性系的枝刺表型可塑性。

GO 富集分析顯示5 組有刺和無刺比較組的DEG 共同顯著富集在BP 的響應(yīng)刺激、激素、傷害、脅迫等GO 條目，這些條目多數(shù)與植物防御和脅迫相關(guān)。并且研究還發(fā)現(xiàn)，土壤干旱脅迫促進(jìn)黑杞無性系枝刺的發(fā)生[16]，前人研究發(fā)現(xiàn)火燒[31] 和動(dòng)物取食[32] 等脅迫可以促使植物增加分配給刺的生物量，刺屬于植物的誘導(dǎo)防御性器官。因此推測(cè)黑杞枝刺發(fā)生也會(huì)響應(yīng)各類脅迫并與上述富集GO 條目的DEG 息息相關(guān)。

植物可能會(huì)利用次生代謝產(chǎn)物作為防御非生物脅迫的機(jī)制[33]，皮刺是植物防御的一種方式，它的形成與一些特定的次生代謝產(chǎn)物積累有關(guān)[34-35]，包括黃酮類化合物、萜類化合物和生物堿[36]。關(guān)于植物枝刺發(fā)生和次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，目前未檢索到報(bào)道。本研究的RNA-Seq 分析結(jié)果顯示5 組有刺和無刺材料比較組的DEG 共同顯著富集的KEGG 通路是“類黃酮生物合成”“二萜生物合成”“苯丙烷生物合成”和“芪類、二芳基庚烷和姜辣素生物合成”。類黃酮生物合成通路中的26 個(gè)DEG 在ThoCK vs. TleCK 組的有刺材料中表達(dá)上調(diào)，說明這些基因可能響應(yīng)高Suc 促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生。注釋到二萜生物合成通路的共同DEG（GA3ox1），在5 個(gè)比較組的無刺材料中均上調(diào)，該DEG 與赤霉素合成有關(guān)，說明赤霉素可能響應(yīng)低Suc 抑制黑杞枝刺發(fā)生。注釋到該通路的四甲基十六碳四烯醇合酶基因（GES）的表達(dá)情況則正好相反，在5 個(gè)比較組的無刺材料中均下調(diào)，說明該基因可能響應(yīng)高Suc 促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生。單獨(dú)或者聯(lián)合GA3ox1 高表達(dá)、GES 低表達(dá)（或敲除）有望用于培育無刺黑杞。苯丙烷類合成可產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，如木質(zhì)素[37]。注釋到苯丙烷生物合成通路的共有DEG（LFAP）在4 個(gè)比較組的無刺材料中表達(dá)上調(diào)，其注釋為木質(zhì)素形成陰離子過氧化物酶，可催化木質(zhì)素合成。說明低Suc 可能通過加速木質(zhì)素合成來抑制黑杞枝刺發(fā)生，木質(zhì)素含量應(yīng)該與枝刺發(fā)生負(fù)相關(guān)。綜上，推測(cè)本研究的黑杞無性系枝刺發(fā)生可能與高類黃酮、低木質(zhì)素積累和低赤霉素合成量，以及相關(guān)基因的表達(dá)水平有關(guān)；且這些基因的表達(dá)可能均受Suc 的調(diào)控。

轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子[38]，在植物細(xì)胞代謝、器官構(gòu)成及環(huán)境應(yīng)答等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[39]。Zhang 等[40] 發(fā)現(xiàn)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在茄子Solanum melongena L. 皮刺的發(fā)育過程中特異性上調(diào)。薔薇Rosa multiflora中NAC 和WRKY 等幾個(gè)與次生代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在皮刺中表達(dá)上調(diào)[36]。本研究Venn 圖中33 個(gè)共有差異轉(zhuǎn)錄因子中的NAC 和WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子較多，NAC 轉(zhuǎn)錄因子基因在5 個(gè)比較組的無刺材料中均上調(diào)，而WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因則均下調(diào)，由此我們推測(cè)低Suc 可能通過下調(diào)WRKY、上調(diào)NAC 轉(zhuǎn)錄因子來抑制黑杞枝刺發(fā)生。聯(lián)合或者單獨(dú)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NAC 表達(dá)、降低WRKY 表達(dá)（或者敲除）有望培育出無刺或少刺黑果枸杞。目前亦無NAC 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子影響植物枝刺的報(bào)道。這些推測(cè)性結(jié)論仍需進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證。TCP 轉(zhuǎn)錄因子由于其廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程和多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而備受關(guān)注[41]。本研究中，RNA-Seq 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)關(guān)鍵比較組2個(gè)共同的DEG，被預(yù)測(cè)為TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族，且在無刺樣品中均下調(diào)。這提示我們2 個(gè)TCP 轉(zhuǎn)錄因子的低表達(dá)或者敲除有望用于培育無刺黑杞。前人研究發(fā)現(xiàn)柑橘兩個(gè)TCP 類轉(zhuǎn)錄因子基因TI1和TI2 成功編輯之后產(chǎn)生的ti1 突變體、ti2 突變體和ti1 ti2 雙突變體，三種突變體分別導(dǎo)致超10%、約6% 和幾乎每根枝刺向側(cè)枝轉(zhuǎn)變[19]。這也再次證明本研究發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)TCP 基因的低表達(dá)或者敲除可用于培育無刺或者少刺黑杞。

植物激素是植物感受外部環(huán)境變化、調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)狀態(tài)、抵御不良環(huán)境及維持生存必不可少的信號(hào)分子[42]，在植物的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮著重要作用，促進(jìn)植物生命活動(dòng)正常進(jìn)行[43]。本研究發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)有刺和無刺比較組的DEG 顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG 通路。5 組比較組共有的196個(gè)DEG 中3 個(gè)分別注釋到此通路的茉莉酸、生長(zhǎng)素和水楊酸的信號(hào)通路。其中水楊酸相關(guān)（PR-1）和生長(zhǎng)素相關(guān)（SAUR）DEG 的在各類無刺樣品表達(dá)上調(diào)，茉莉酸相關(guān)DEG（JAZ）則表達(dá)下調(diào)。這說明生長(zhǎng)素、茉莉酸、水楊酸可能響應(yīng)Suc 含量變化影響黑杞枝刺發(fā)生；單獨(dú)或者聯(lián)合通過調(diào)控JAZ 低表達(dá)、PR-1 和SAUR 高表達(dá)很可能達(dá)到有效抑制黑杞枝刺發(fā)生的效果。另外，本課題組研究發(fā)現(xiàn)外源生長(zhǎng)素IAA 處理可以抑制黑杞枝刺發(fā)生，水楊酸含量與其枝刺發(fā)生也呈負(fù)相關(guān)[18]。前人研究發(fā)現(xiàn)水楊酸和茉莉酸對(duì)植物防御起關(guān)鍵作用[44-45]，枝刺也屬于植物的防御性器官[16]。這說明Suc 可能通過低表達(dá)SAUR 介導(dǎo)的低IAA 信號(hào)來促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生，低Suc 通過高表達(dá)SAUR介導(dǎo)的高IAA 信號(hào)來抑制黑杞枝刺發(fā)生；水楊酸和PR-1 可能具有類似的機(jī)制，而茉莉酸及JAZ 也可能參與了Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生事件。

葉綠體差異表達(dá)基因分析顯示有刺和無刺材料（頂芽）之間的cpDEG 主要參與光合作用、葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。本研究中有刺黑杞枝條單簇葉片數(shù)量顯著高于無刺枝條。葉片是光合作用的器官，數(shù)量較多的葉片使植物總體光合作用增強(qiáng)。較無刺頂芽（TleCK），有刺頂芽（ThoCK）光合作用KEGG 通路9 個(gè)差異基因有8 個(gè)表達(dá)上調(diào)，證明葉片發(fā)育原始階段，有刺材料的光合強(qiáng)度可能已經(jīng)顯著強(qiáng)于無刺材料。多葉片導(dǎo)致的總體光合作用增強(qiáng)和頂芽光合作用KEGG通路上調(diào)，極可能是有刺頂芽Suc（光合產(chǎn)物）含量顯著高于無刺頂芽的原因。9 個(gè)差異基因包括4 個(gè)cpDEG和5 個(gè)細(xì)胞核DEG，這也提示我們頂芽細(xì)胞核和葉綠體基因的表達(dá)調(diào)控共同決定了黑杞枝刺的發(fā)育和有無。細(xì)胞核和葉綠體基因的表達(dá)存在交互調(diào)控，可能涉及細(xì)胞核到葉綠體的順行信號(hào)和葉綠體到細(xì)胞核的逆行信號(hào)[46]。有研究發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控影響光合作用，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[47]。因此，推測(cè)基因表達(dá)和光合作用的差異引起的Suc 含量差異影響了黑杞刺原基的發(fā)育進(jìn)而導(dǎo)致黑杞出現(xiàn)有刺和無刺兩種類型的植株。但是，按照本研究的分析方法，增施外源Suc 后無刺變有刺材料和減少內(nèi)源Suc 后有刺變無刺材料與相應(yīng)對(duì)照之間的cpDEG，與有刺和無刺對(duì)照之間的cpDEG 并無重疊。這說明增施外源或者減少內(nèi)源Suc 的處理并非簡(jiǎn)單通過逆轉(zhuǎn)葉綠體相關(guān)cpDEG的表達(dá)來達(dá)到逆轉(zhuǎn)刺表型的目的，這種表型逆轉(zhuǎn)可能存在更加復(fù)雜的機(jī)制。增施外源Suc 后無刺變有刺材料（ThoSuc）的光合作用KEGG 通路有2 個(gè)葉綠體基因和1 個(gè)細(xì)胞核基因表達(dá)下調(diào)，說明外源Suc 處理后內(nèi)源Suc 的增加可能會(huì)使黑杞頂芽光合作用適當(dāng)減弱。增施外源Suc 的處理除了顯著促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生，還顯著增加了新發(fā)枝條單簇的葉片數(shù)量。這證明雖然外源Suc 處理可能并沒有使頂芽光合作用增強(qiáng)，但是增加的葉片數(shù)量會(huì)使整個(gè)植株的光合作用增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致更多的Suc 運(yùn)輸?shù)巾斞?。rpoC2 表達(dá)葉綠體RNA 聚合酶PEP 的β″ 亞基[48]，其在TheCK vs. ThoSuc 表達(dá)下調(diào)可能預(yù)示著只含有PEP 類啟動(dòng)子的葉綠體基因表達(dá)也會(huì)隨之下調(diào)[49]。但是本研究?jī)H檢測(cè)到另外2 個(gè)光合作用相關(guān)基因psaB、petB 在ThoSuc表達(dá)顯著下調(diào)。這提示我們這2 個(gè)光合葉綠體基因可能只含有PEP 類啟動(dòng)子，而不含NEP 類啟動(dòng)子[50]。參照前人的研究[24-25]，我們采用黑暗聯(lián)合去葉處理來降低有刺黑杞的內(nèi)源Suc 含量。結(jié)果顯示黑暗聯(lián)合去葉顯著降低了黑杞新發(fā)莖的枝刺發(fā)生，甚至使其完全無刺。與有刺對(duì)照相比，黑暗去葉處理后無刺枝條頂芽只有一個(gè)注釋到光合作用KEGG 通路的葉綠體基因表達(dá)顯著下調(diào)，另外還有兩個(gè)葉綠體核糖體蛋白基因表達(dá)顯著變化（表3），這說明黑暗聯(lián)合去葉處理抑制枝刺發(fā)生可能與光合作用以及葉綠體蛋白翻譯有關(guān)。綜上所述，我們建立Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生的機(jī)理模型（圖7）：多葉高光合或者外源Suc 處理導(dǎo)致的頂芽高Suc，通過圖中路徑促進(jìn)黑杞枝刺發(fā)生；反之，少葉低光合或者去葉導(dǎo)致的頂芽低Suc，則抑制黑杞枝刺發(fā)生。本研究屬于上游性研究，要最終揭示Suc 影響黑果枸杞枝刺發(fā)生機(jī)理，還有大量工作需要進(jìn)行。課題組目前正在進(jìn)行黑果枸杞的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，已經(jīng)獲得幾個(gè)基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系。今后我們將在本研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上，繼續(xù)開展單基因或者多基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。另外，內(nèi)源Suc 以及各類激素的測(cè)定也需要繼續(xù)開展。

3.2 結(jié) 論

本研究通過RNA-Seq 發(fā)現(xiàn)黑杞5 個(gè)有刺和無刺比較組DEG 共同顯著富集在9 個(gè)GO 條目和4個(gè)KEGG 通路，共有196 個(gè)DEG，其中較多轉(zhuǎn)錄因子基因被預(yù)測(cè)為NAC 和WRKY 家族。5 組比較組有3 個(gè)共有DEG 注釋在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)KEGG 通路，分別參與生長(zhǎng)素、茉莉酸和水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)。3 個(gè)關(guān)鍵比較組共有2 個(gè)DEG 被預(yù)測(cè)為TCP 轉(zhuǎn)錄因子基因，同時(shí)均有cpDEG 被注釋到光合作用KEGG 通路。本研究建立了Suc 影響黑杞枝刺發(fā)生的機(jī)制模型，為揭示更深層次的黑杞枝刺發(fā)生機(jī)理和培育其無刺優(yōu)良品種奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] GAO Y， WANG Q M， AN Q X， et al. A novel micropropagationof Lycium ruthenicum and epigenetic fidelity assessment of threetypes of micropropagated plants in vitro and ex vitro[J]. PLoSONE，2021，16（2）：e0247666-e0247666.

[2] CHEN S S， ZENG Z， HU N， et al. Simultaneous optimizationof the ultrasound-assisted extraction for phenolic compoundscontent and antioxidant activity of Lycium ruthenicum Murr.fruit using response surface methodology[J]. Food Chemistry，2018，242：1-8.

[3] LI Y， HE X M， YUAN H F， et al. Differed growth stage dynamics ofroot-associated bacterial and fungal community structure associatedwith halophytic plant Lycium ruthenicum[J]. Microorganisoms，2022，10（8）：1644-1644.

[4] BAO X M， GAN X L， FAN G H， et al. Transcriptome analysisidentifies key genes involved in anthocyanin biosynthesis in blackand purple fruits （Lycium ruthenicum Murr. L）[J]. Biotechnology amp;Biotechnological Equipment，2022，36（1）：553-560.

[5] LU Y Y， KONG X F， ZHANG J H， et al. Composition changes inLycium ruthenicum fruit dried by different methods[J]. Frontiersin Nutrition，2021，8：737521-737521.

[6] 武雪玲， 李筱筱， 戴雪伶， 等. 黑果枸杞提取物活性的研究進(jìn)展[J]. 生命的化學(xué)，2017，37（5）：761-766.

WU X L， LI X X， DAI X L， et al. Research progress of extractionfrom Lycium ruthenicum Murr. in biological activity[J].Chemistry of Life，2017，37（5）：761-766.

[7] CHEN S S， HU N， WANG H L， et al. Bioactivity-guidedisolation of the major anthocyanin from Lycium ruthenicumMurr. fruit and its antioxidant activity and neuroprotective effectsin vitro and in vivo[J]. Food amp; Function，2022，13（6）：3247-3257.

[8] PENG Y J， DONG W， CHEN G J， et al. Anthocyanins fromLycium ruthenicum Murray ameliorated high-fructose dietinducedneuroinflammation through the promotion of the integrityof the intestinal barrier and the proliferation of lactobacillus[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2023，71（6）：2864-2882.

[9] CHEN S S， ZHOU H N， ZHANG G， et al. Anthocyanins fromLycium ruthenicum Murr. ameliorated D-galactose-inducedmemory impairment， oxidative stress， and neuroinflammationin adult rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（11）：3140-3149.

[10] CHEN S S， WANG H L and HU N. Long-term dietary Lyciumruthenicum Murr. anthocyanins intake alleviated oxidative stressmediatedaging-related liver injury and abnormal amino acidmetabolism[J]. Foods，2022，11（21）：3377-3377.

[11] LIU P， LI W R， HU Z Z， et al. Isolation， purification， identification，and stability of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr[J].LWT- Food Science and Technology，2020，126 （prepublish）：109334-109334.

[12] 李強(qiáng)， 何彩， 史星雲(yún)， 等. 不同種源黑果枸杞果實(shí)游離氨基酸的品質(zhì)評(píng)價(jià)[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2023，41（1）：26-35.

LI Q， HE C， SHI X Y， et al. Quality evaluation of free aminoacids in fruits for different provenances of Lycium ruthenicum[J].Non-wood Forest Research，2023，41（1）：26-35.

[13] YUN D W， YAN Y M and LIU J. Isolation， structure andbiological activity of polysaccharides from the fruits of Lyciumruthenicum Murr： A review[J]. Carbohydrate Polymers，2022，291：119618-119618.

[14] WANG H Q， LI J N， TAO W W， et al. Lycium ruthenicumstudies： molecular biology， phytochemistry and pharmacology[J].Food Chemistry，2018，240：759-766.

[15] 武延生， 嚴(yán)文培， 張曉麗， 等. 植物刺的類型與功能辨析[J].生物學(xué)通報(bào)，2021，56（4）：13-15.

WU Y S， YAN W P， ZHANG X L， et al. Analysis on the typesand functions of plant thorns[J]. Bulletin of Biology，2021，56（4）：13-15.

[16] YANG A L， QI X Y， WANG Q M， et al. The branch-thornoccurrence of Lycium ruthenicum is associated with leaf DNAhypermethylation in response to soil water content[J]. MolecularBiology Reports，2021，1-10.

[17] 齊新宇. 黑果枸杞LrSUS 對(duì)枝刺發(fā)生的影響及其可能機(jī)理[D]. 沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

QI X Y. Effect of Lycium ruthenicum LrSUS on the occurrenceof branch thorn and its possible mechanism[D]. Shenyang：Shenyang Agricultural University，2022.

[18] 王欽美， 劉雯， 喬楊， 等. 吲哚乙酸在培育無刺黑果枸杞方面的應(yīng)用：CN114303766B[P].2023-08-04.

WANG Q M， LIU W， QIAO Y， et al. Application of indoleaceticacid in the cultivation of Lycium ruthenicum： CN114303766B[P].2023-08-04.

[19] ZHANG F， ROSSIGNOL P， HUANG T B， et al. Reprogrammingof stem cell activity to convert thorns into branches[J]. CurrentBiology，2020，PP：2951-2961.e5.

[20] ZHANG F， WANG Y W， IRISH V F. CENTRORADIALISmaintains shoot meristem indeterminacy by antagonizingTHORN IDENTITY1 in citrus[J]. Current Biology，2021，31（10）：2237-2242.e4.

[21] LI L J， QIAO Y， QI X Y， et al. Sucrose promotes branch-thornoccurrence of Lycium ruthenicum through dual effects of energyand signal[J]. Tree Physiology，2023，43（7）：1187-1200.

[22] LIU J Q， LYU M X， XU X X， et al. Exogenous sucrose promotesthe growth of apple rootstocks under high nitrate supply bymodulating carbon and nitrogen metabolism[J]. Plant Physiologyand Biochemistry，2022，192：196-206.

[23] JIAN Y， WU G L， ZHOU D H， et al. Effects of shading oncarbohydrates of syzygium samarangense[J]. Notulae BotanicaeHorti Agrobotanici Cluj-napoca，2019，47（4）：1252-1257.

[24] 沙建川， 王芬， 賈志航， 等. 葉果比和摘葉方式對(duì)蘋果13C同化物向果實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（1）：93-100.

SHA J C， WANG F， JIA Z H， et al. Effect of leaf-fruit ratio andleaf-picking methods on translocation of 13C-photoassimilatesto fruit and fruit quality in apple[J]. Plant Physiology Journal，2020，56（1）：93-100.

[25] KASAI M. Regulation of leaf photosynthetic rate correlatingwith leaf carbohydrate status and activation state of Rubiscounder a variety of photosynthetic source/sink balances[J].Physiologia Plantarum，2008，134（1）：216-226.

[26] DEWEY C N， LI B. RSEM： accurate transcript quantificationfrom RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMCBioinformatics，2011，12（1）：323.

[27] WANG L K， FENG Z X， WANG X， et al. DEGseq： an R packagefor identifying differentially expressed genes from RNA-seqdata[J]. Bioinformatics （Oxford， England），2010，26（1）：136-8.

[28] MA X H， ZHOU Q， HU Q D， et al. Effects of different irradianceconditions on photosynthetic activity， photosystem Ⅱ ， rubiscoenzyme activity， chloroplast ultrastructure， and chloroplast-relatedgene expression in Clematis tientaiensis leaves[J]. Horticulturae，2023，9（1）：118-118.

[29] WANG Q M， CUI J G， DAI H Y， et al. Comparative transcriptomeprofiling of genes and pathways involved in leaf-patterning ofClivia miniata var. variegata[J]. Gene，2018，677：280-288.

[30] 鄭祎. 基于高通量測(cè)序探索彩葉君子蘭條紋葉形成機(jī)理[D].沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué).2020.

ZHENG Y. Exploring the formation mechanism of stripedleaves of Clivia miniata var. variegata based on high-throughputsequencin[D]. Shenyang： Shenyang Agricultural University，2020.

[31] JUAN G， ESTELA R. Spine production is induced by fire：a natural experiment with three Berberiss pecies[J]. ActaOecologica，2004，26：239-245.

[32] MICHAL R， HAVIVA M， SIMCHA L Y. Quantitativecharacterization of the thorn system of the common shrubsSarcopoterium spinosum and Calicotome villosa[J]. IsraelJournal of Plant Sciences，2007，55（1）：63-72.

[33] SHATRUJEET P， RIDHI G， ARCHANA B， et al. Transcriptomeanalysis provides insight into prickle development and its link todefense and secondary metabolism in Solanum viarum Dunal[J].Scientific Reports，2018，8（1）：1-12.

[34] SWARNKAR M K， KUMAR P， DOGRA V， et al. Pricklemorphogenesis in rose is coupled with secondary metaboliteaccumulation and governed by canonical MBW transcriptionalcomplex[J]. Plant Direct，2021，5（6）：e00325-e00325.

[35] XIAO F， ZHAO Y， WANG X R， et al. Comparative transcriptomeanalysis of Gleditsia sinensis thorns at different stages ofdevelopment[J]. Plants，2023，12（7）：1456.

[36] ZHANG Y， ZHAO M J， ZHU W， et al. Nonglandular prickleformation is associated with development and secondarymetabolism related genes in Rosa multiflora[J]. Physiologia Plantarum，2021，173（3）：1147-1162.

[37] THOMAS V. Phenylpropanoid biosynthesis[J]. MolecularPlant，2010，3（1）：2-20.

[38] SEO E， CHOI D. Functional studies of transcription factorsinvolved in plant defenses in the genomics era[J]. Briefings inFunctional Genomics，2015，14（4）：260-7.

[39] 李芳蕊， 許思佳， 劉霽廣， 等. 轉(zhuǎn)BpTCP10 基因抑制表達(dá)白樺的耐鹽性分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（3）：16-25+38.

LI F R， XU S J， LIU J G， et al. Salt tolerance analysis oftransgenic Betula platyphylla seedlings with inhibited BpTCP10expression[J]. Journal of Central South University of Forestry amp;Technology，2022，42（3）：16-25，38.

[40] ZHANG L， SUN H Y， XU T， et al. Comparative transcriptomeanalysis reveals key genes and pathways involved in prickledevelopment in Eggplant[J]. Genes，2021，12（3）：341-341.

[41] 馮志娟， 徐盛春， 劉娜， 等. 植物TCP 轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2018，19（1）：112-121.

FENG Z J， XU S C， LIU N， et al. Molecular mechanisms andapplications of TCP transcription factors in plants[J]. Journal ofPlant Genetic Resources，2018，19（1）：112-121.

[42] 資麗媛， 林浴霞， 傅若楠， 等. 植物激素轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2022，58（12）：2238-2252.

ZI L Y， LIN Y X， FU R N， et al. Research progress in planthormones transport[J]. Plant Physiology Journal，2022，58（12）：2238-2252.

[43] 王鎵鋇， 李文瑩， 葛暢， 等. 外源激素對(duì)‘ 葡萄桐’ 雄樹開花性狀及果實(shí)特性的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，43（4）：20-32，110.

WANG J B， LI W Y， GE C， et al. Effects of exogenous hormoneson the flowering and fruit characteristics of male tunotrees of‘putaotong’ （Vernicia fordii Hemsl.）[J]. Journal of Central SouthUniversity of Forestry amp; Technology，2023，43（4）：20-32，110.

[44] MOHD S， QAZI F， TIBOR J. Multifaceted role of salicylic acidin combating cold stress in plants： a review[J]. Journal of PlantGrowth Regulation，2020，40 （prepublish）：1-22.

[45] WANG J， SONG L， GONG X， et al. Functions of jasmonic acidin plant regulation and response to abiotic stress[J]. InternationalJournal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1446-1446.

[46] OH S， MONTGOMERY B L. Phytochrome-dependent coordinatecontrol of distinct aspects of nuclear and plastid gene expressionduring anterograde signaling and photomorphogenesis[J].Frontiers in Plant Science，2014，5：171.

[47] LI Y， YU C， MO R L， et al. Screening and verification ofphotosynthesis and chloroplast-related genes in Mulberry bycomparative RNA-Seq and virus-induced gene silencing[J].International Journal of Molecular Sciences，2022，23（15）：8620-8620.

[48] CHEN Z， SCHERTZ K F， MULLET J E， et al. Characterizationand expression of rpoC2 in CMS and fertile lines of sorghum[J].Plant Molecular Biology，1995，28：799-809.

[49] LEGEN J， KEMP S， KRAUSE K， et al. Comparative analysis ofplastid transcription profiles of entire plastid chromosomes fromtobacco attributed to wild-type and PEP-deficient transcriptionmachineries[J]. The Plant Journal： for Cell and MolecularBiology，2022，31（2）：171-188.

[50] LERBS-MACHE S. Function of plastid sigma factors in higherplants： regulation of gene expression or just preservation ofconstitutive transcription？[J]. Plant molecular biology，2011，76（3-5）：235-249.

[ 本文編校：趙 坤]

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32171831）；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2023-MS-207）。