‘西林3 號’核桃體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)與增殖的影響因素

摘 要：【目的】篩選最佳的‘西林3 號’核桃體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)條件?！痉椒ā客ㄟ^進(jìn)行不同消毒方法、不同外植體、不同采樣時期、不同激素濃度配比、不同蔗糖與谷氨酰胺濃度處理，對核桃胚性愈傷組織的誘導(dǎo)情況進(jìn)行研究，篩選最佳誘導(dǎo)條件；同時對比不同激素濃度對核桃體細(xì)胞胚胎增殖率的影響，篩選最佳增殖培養(yǎng)基?！窘Y(jié)果】雄花（花藥）、種子、幼胚的最佳消毒方法分別為70% 乙醇15 s+10%NaClO 浸泡4 min、70% 乙醇30 s、70% 乙醇5 min，培養(yǎng)4 d 后的存活率高，污染率低。幼胚是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳材料，5 月31 日是最佳的采樣時間，誘導(dǎo)率分別為（65.00±7.07）% 和（85.83±1.17）%。以愈傷組織為材料時，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳激素濃度配比為改良DKW 培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.01 mg/L IBA，誘導(dǎo)率為（37.94±1.33）%。以愈傷組織為材料時，誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L，誘導(dǎo)率為（82.67±0.94）%，谷氨酰胺不是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的影響因素。體胚增殖的最佳激素濃度配比為改良DKW 培養(yǎng)基添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、0.005 mg/L IBA，增殖率為98%?！窘Y(jié)論】外植體和采樣時間的選擇直接影響體胚誘導(dǎo)的結(jié)果，對于幼胚這類果實內(nèi)部材料來說，僅進(jìn)行簡便快捷消毒即可。激素和碳源是胚性愈傷組織誘導(dǎo)與發(fā)生的關(guān)鍵因素，谷氨酰胺不是胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素。在進(jìn)行體胚繼代增殖培養(yǎng)時，適當(dāng)添加激素可以抑制體胚成熟，提高增殖率。

關(guān)鍵詞：核桃；幼胚；胚性愈傷組織；體細(xì)胞胚胎；誘導(dǎo)；增殖

中圖分類號：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）01—0039—09

核桃Juglas regia 是胡桃科Juglandaceae 胡桃屬Juglans 的重要樹種。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)樹種，其果實富含營養(yǎng)物質(zhì)，木材堅硬耐用，核桃產(chǎn)業(yè)是發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟(jì)和增加農(nóng)民收入的重要支柱產(chǎn)業(yè)，核桃也是國家的戰(zhàn)略儲備糧油品類之一。核桃在我國的種植分布廣泛，其中陜西省的種植面積位列前茅[1]。但在生產(chǎn)中存在良種應(yīng)用率低、易受環(huán)境脅迫和病蟲害嚴(yán)重等困境。利用體細(xì)胞胚胎（簡稱“體胚”）進(jìn)行良種快繁和分子育種是非常有效的，不但具有繁殖系數(shù)大、結(jié)構(gòu)完整、培育年限短和不受季節(jié)影響的特點(diǎn)，而且能保持優(yōu)良基因的穩(wěn)定遺傳，可為基因功能研究提供材料體系。自從Tulecke 等[2] 首次成功建立核桃體胚發(fā)生體系以來，胡桃屬一些種和雜交品種的體胚發(fā)生體系相繼被建立，但不同種間建立體胚發(fā)生體系的條件存在差異，且普遍存在體胚誘導(dǎo)困難和萌發(fā)率低的問題。較多研究結(jié)果表明，核桃體胚的誘導(dǎo)與發(fā)生受外植體、采樣時期和培養(yǎng)基（包含植物激素）的影響，來自不同采樣時期的外植體具有不同的胚性感受態(tài)水平，并且在不同培養(yǎng)基與激素的作用下體胚被誘導(dǎo)的效果大有不同，產(chǎn)生的體胚數(shù)量與質(zhì)量存在明顯差異[2-7]。

在核桃眾多品種中，‘西林3 號’核桃是從新疆核桃實生樹種中選育出的優(yōu)良早實核桃品種，‘西林3 號’核桃具有樹勢旺盛、豐產(chǎn)性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)和坐果率高的優(yōu)點(diǎn)[8]。本研究中以‘西林3號’核桃為材料，探究不同消毒方法、不同外植體、不同采樣時期、不同激素濃度配比、不同蔗糖與谷氨酰胺濃度對‘西林3 號’核桃胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，同時探究不同激素濃度配比對‘西林3 號’核桃體胚增殖率的影響，篩選最佳的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)條件，以期建立高效的核桃體胚發(fā)生與增殖體系，為核桃良種離體快繁和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）植物材料?！髁? 號’供體核桃定植于西北農(nóng)林科技大學(xué)山陽核桃示范站，樹齡14 a。雄花采集時間為2021 年3 月31 日—4 月7 日；種子采集時間為2021 年4 月16 日—5 月20 日，每7 d 采集1 次；幼胚采集時間為2021 年5 月24 日—6 月4 日；子葉采集時間為2021 年5 月31 日—7 月12 日。

2）激素與培養(yǎng)基。激素為6- 芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、激動素（kinetin，KT）、3- 吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）?；九囵B(yǎng)基為改良版DKW（Driver-Kuniyuki-Walnut）培養(yǎng)基[2]，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良版DKW 培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.005 mg/L IBA+5 g/L植物凝膠（phytagel）。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃外植體的消毒

雄花（花藥）、種子和幼胚（子葉）分別設(shè)置以下的消毒處理（表1），除特別說明外，將材料使用各消毒劑處理后均用無菌水沖洗4 次，然后用撥針分別從雄花序中挑出單顆雄花（或單顆花藥），從幼果內(nèi)挑出種子和幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每處理接種30 個外植體，重復(fù)3 次，4 d 后記錄污染率、存活率。

雄花（花藥）、種子、幼胚、子葉（當(dāng)幼胚大于2 cm 時，將子葉切成1 cm2 方塊接種）分別以X3、Z1、Y1、Y1 處理方式進(jìn)行消毒，以4 d后未被污染的材料為外植體接種于新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每處理接種10 個外植體，重復(fù)3 次。均置于（25±2）℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)4 ～ 20 d 時，每隔4 d 記錄褐化率，每2 周轉(zhuǎn)移至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 核桃體胚的誘導(dǎo)

1）不同外植體。分別于2021 年的3 月31 日、4 月16 日、5 月31 日、5 月31 日各推后1 周內(nèi)采集雄花（花藥）、種子、幼胚、子葉，置于冰箱（4 ℃）中冷藏4 d 后用于接種。消毒后用撥針分別從雄花序中挑出單顆花藥，從幼果內(nèi)挑出種子和幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，當(dāng)幼胚大于2 cm 時，將子葉切成1 cm2 方形接種。每處理接種30 個外植體，重復(fù)3 次，培養(yǎng)7 d 后記錄愈傷組織的狀態(tài)及誘導(dǎo)率，14 d 后記錄胚性愈傷組織的狀態(tài)及誘導(dǎo)率。

2）不同采樣時期。分別于2021 年的4 月16日—5 月20 日（間隔7 d）、5 月24 日—6 月4 日、6 月4 日—7 月12 日采集種子、幼胚和子葉，消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每處理接種60 個外植體，重復(fù)3 次，均置于（25±2）℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，每2 周轉(zhuǎn)移至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)20 d 后記錄胚性愈傷組織的狀態(tài)及誘導(dǎo)率。

1.2.3 核桃體胚培養(yǎng)基的篩選

1）誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以誘導(dǎo)出的愈傷組織為材料，切成1 cm3 方塊接種于含有不同激素濃度配比（表2）、不同蔗糖質(zhì)量濃度（20、30、40、50 g/L）與谷氨酰胺質(zhì)量濃度（0、0.5、1.0 g/L）的改良版DKW 培養(yǎng)基上，置于（25±2）℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，每2 周轉(zhuǎn)移至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每處理接種30 盤，每盤4 塊愈傷組織，重復(fù)3 次。培養(yǎng)2 周后記錄谷氨酰胺處理下的愈傷組織狀態(tài)。培養(yǎng)4 周后記錄胚性愈傷組織的狀態(tài)及誘導(dǎo)率。

2）增殖培養(yǎng)基。以誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織為材料，切成1 cm3 大小方塊接種于含有不同激素濃度（表3）的改良版DKW 培養(yǎng)基上，置于（25±2）℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，每2 周轉(zhuǎn)移至新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每個處理接種10 盤，每盤4 塊胚性愈傷組織，重復(fù)3 次。培養(yǎng)3 周后記錄體胚的狀態(tài)及增殖率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2022 軟件、SPSS 26.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

污染率為被污染外植體數(shù)量占外植體總數(shù)量的百分比；存活率為存活外植體數(shù)量占外植體總數(shù)量的百分比；褐化率為褐化外植體數(shù)量占外植體總數(shù)量的百分比；愈傷組織誘導(dǎo)率為產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)量占外植體總數(shù)量的百分比；胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為產(chǎn)生胚性愈傷組織外植體數(shù)量占外植體總數(shù)量的百分比；增殖率為增殖后胚性愈傷組織鮮質(zhì)量與接種前鮮質(zhì)量的差值占接種鮮質(zhì)量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法對外植體的影響

以雄花（花藥）為外植體時，乙醇與次氯酸鈉組合（X2、X3）使用的消毒效果較好（圖1），與單獨(dú)使用乙醇（X1）及乙醇與升汞組合（X4）使用相比，存活率高，花藥呈綠色且狀況良好。2 個乙醇與次氯酸鈉組合相比，乙醇和10% NaClO組合使用的消毒效果最佳，雄花（花藥）存活率最高，為（34.17±1.18）%，污染率低于乙醇和5% NaClO 組合使用。以種子為外植體時，隨著消毒時間的增加，種子污染率無顯著差異，但是存活率降低，接種后褐化程度逐漸加重，其中單獨(dú)使用乙醇消毒30 s 的效果最佳，種子存活率達(dá)（61.56±0.62）%，且種子呈通透的白色且狀態(tài)良好。以幼胚為外植體時，使用乙醇消毒5 min（未使用無菌水沖洗）的污染率最高，與其他3 個處理（Y1、Y2、Y3）存在顯著差異，在4 種消毒處理中，使用乙醇消毒5 min 的存活率最高，為（82.89±7.22）%，與使用乙醇消毒15 min、乙醇消毒5 min（未使用無菌水沖洗）相比無顯著差異，然而消毒時間過長會對幼胚造成傷害，消毒時間為5 min 的幼胚呈乳白色，消毒時間為10、15 min的幼胚會產(chǎn)生黑褐色斑塊且不再生長。

在消毒并接種后，花藥、種子、幼胚和子葉的褐化率在培養(yǎng)12 ～ 20 d 時逐漸趨于穩(wěn)定（圖1）；外部組織花藥的褐化率遠(yuǎn)高于其他3 種果實內(nèi)部組織，消毒劑的毒害作用明顯，4 種外植體中幼胚的褐化率是最低的。

2.2 外植體對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表4 所示，核桃胚性愈傷組織的誘導(dǎo)情況與外植體種類存在密切的關(guān)系，不同種類外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異，且愈傷組織誘導(dǎo)率高的外植體，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也高。其中，種子和子葉產(chǎn)生較少的胚性愈傷組織，雄花（花藥）未產(chǎn)生胚性愈傷組織，幼胚的愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均最高，分別為（84.78±1.10）% 和（65.00±7.07）%，體胚直接發(fā)生或間接發(fā)生，愈傷組織前期呈疏松狀，白色或淡黃色，后期呈塊狀（圖2）。

2.3 采樣時期對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如圖3 所示，核桃胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與采樣時期存在密切的關(guān)系，不同采樣時期的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異，這可能與核桃果實的成熟度有關(guān)，不同發(fā)育時期果實的細(xì)胞全能性不同。種子和幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率隨著采樣時期的延后而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，子葉的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率則呈現(xiàn)一直下降的趨勢，因此以子葉為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織時應(yīng)將采樣時期提前。在3 種外植體中，幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率整體上遠(yuǎn)高于種子和子葉，并在5 月31 日達(dá)到峰值，誘導(dǎo)率為（85.83±1.17）%。

2.4 植物激素與有機(jī)物對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如圖4 所示，以愈傷組織為材料時，不同種類和濃度植物激素處理中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率存在顯著差異，其中最佳的激素濃度配比為I5，即改良版DKW 培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.01 mg/L IBA，該處理下誘導(dǎo)率最高，為（37.94±1.33）%。以愈傷組織誘導(dǎo)胚性愈傷組織時，不添加激素（I1）無法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，單獨(dú)添加細(xì)胞分裂素（I9、I10）或生長素（I11）僅能產(chǎn)生少量的胚性愈傷組織，因此在誘導(dǎo)階段添加細(xì)胞分裂素和生長素是必要的。添加不同濃度配比激素處理中誘導(dǎo)出的核桃胚性愈傷組織如圖5 所示。

以愈傷組織為材料時，不同質(zhì)量濃度蔗糖處理中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率存在顯著差異，不同質(zhì)量濃度谷氨酰胺對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)無顯著差異（表5）。隨著蔗糖質(zhì)量濃度的上升，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為（82.67±0.94）%，蔗糖質(zhì)量濃度過高或過低均會導(dǎo)致胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的下降，且蔗糖質(zhì)量濃度過高時會出現(xiàn)體胚成熟現(xiàn)象，30 ～ 40 g/L 的蔗糖可以提供充足的碳源。添加谷氨酰胺后胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率未發(fā)生顯著改變，谷氨酰胺不是胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段必要的培養(yǎng)基有機(jī)附加物。

2.5 激素對胚性愈傷組織增殖的影響

以胚性愈傷組織為材料時，不同濃度激素處理中體胚的增殖存在顯著差異（表6），其中最佳的激素濃度配比為R2，即改良版DKW 培養(yǎng)基添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、0.005 mg/L IBA，該處理下增殖率最高，為（97.50±35.36）%，此時體胚表面有新的球形胚生成。在無激素培養(yǎng)基（R1）中，體胚整體膨大且表面有新的球形胚生成，體胚繼代和成熟現(xiàn)象同時存在；在含激素培養(yǎng)基（R2、R3）中，體胚無膨大現(xiàn)象且每個體胚周圍增殖出多個球形胚，表明添加細(xì)胞分裂素和生長素可以抑制體胚成熟，提高增殖率，體胚傾向于繼代繁殖，但不同濃度激素處理的增殖效果差異顯著。

3 結(jié)論與討論

在‘西林3 號’核桃體胚誘導(dǎo)過程中，幼胚是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳材料，5 月31 日是最佳的采樣時間，對于幼胚這類果實內(nèi)部材料來說，僅使用70% 乙醇消毒5 min 即可，重點(diǎn)是防褐化。在以愈傷組織為材料時，植物激素和碳源對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與發(fā)生起關(guān)鍵作用，最佳激素濃度配比為改良版DKW 培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.01mg/L IBA，最佳蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L，谷氨酰胺不是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的影響因素。在進(jìn)行體胚的繼代增殖培養(yǎng)時，適當(dāng)添加細(xì)胞分裂素和生長素可以抑制體胚成熟，提高增殖率，最佳激素濃度配比為改良版DKW 培養(yǎng)基添加0.5 mg/L 6-BA、1.0mg/L KT、0.005mg/L IBA。

3.1 影響核桃體胚發(fā)生的因素

3.1.1 消毒方法

在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體的消毒是試驗順利開展的前提。消毒劑種類多樣，不同的消毒劑各有優(yōu)缺點(diǎn)。乙醇易揮發(fā)，消毒能力一般，可通過適當(dāng)延長消毒時間來增強(qiáng)消毒能力。次氯酸鈉消毒能力一般，使用較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5% ～ 10%）的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，可達(dá)到較好的效果。升汞消毒能力強(qiáng)，但毒害作用明顯，可通過降低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.05% ～ 0.15%）或是縮短消毒時間，來減少對植物生長所產(chǎn)生的影響[9-10]。此外，外植體自身帶菌程度與耐毒害性不同，適宜使用的消毒劑種類、濃度和時間也不同，或是多種消毒劑搭配使用，方可達(dá)到最佳消毒效果[11]。在本試驗中，對于雄花（花藥）這類外部組織，使用升汞消毒后雖然污染率最低，但是因發(fā)生毒害，雄花（花藥）的褐化率上升，存活率降低。對于種子、幼胚這類果實內(nèi)部組織，不同消毒劑處理中污染率的差異不顯著，這表明對此類材料僅進(jìn)行簡便快捷的表面消毒即可，關(guān)鍵是要防褐化。在接種幼胚時會黏附許多黏稠狀胚乳，而胚乳產(chǎn)生的酚類化合物堆積在培養(yǎng)基中，會加劇褐化情況?？刂泼棵笥着呓臃N數(shù)量[12]，或提高轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基的頻率，可以有效防止出現(xiàn)褐化情況。

3.1.2 外植體

核桃胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與外植體種類存在密切關(guān)系，核桃的幼胚和子葉具有較高的胚性感受態(tài)水平[6]，Tulecke 等[2] 和Fang 等[13] 用未成熟子葉、湯浩茹等[6] 用幼胚胚軸與子葉成功誘導(dǎo)出核桃體胚，Avilés 等[7] 和李好先等[5] 用葉片僅誘導(dǎo)出核桃愈傷組織。在本試驗中，用雄花（花藥）、種子、幼胚、子葉均可誘導(dǎo)出愈傷組織，且種子、幼胚、子葉具備誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的能力，表明外植體種類直接影響體胚誘導(dǎo)的結(jié)果，其中幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為（65.00±7.07）%， 這與Tulecke 等[2] 的試驗結(jié)果一致。此外，本試驗結(jié)果表明早期核桃種子同樣具備誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的能力，且能被直接誘導(dǎo)產(chǎn)生體胚，可作為核桃體胚誘導(dǎo)的外植體。

3.1.3 外植體采樣時期

核桃胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與采樣時期存在密切的關(guān)系，Tulecke 等[2]、胡恒康[4] 和常英英等[3]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)幼果發(fā)育時期與核桃體胚的發(fā)生有密切關(guān)系，這與核桃果實的成熟度有關(guān)，不同發(fā)育時期果實的內(nèi)部狀態(tài)和細(xì)胞全能性不同，且不同栽培品種的體胚最佳誘導(dǎo)時間也存在差異，同時幼果發(fā)育狀況也受當(dāng)年氣候影響。在本試驗中，種子、幼胚、未成熟子葉的最佳采樣時間分別為4 月23 日、5 月31 日、6 月4 日，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為（28.00±2.82）%、（85.83±1.17）%、（29.56±2.20）%。在成功受精后的一段時間內(nèi)，種子細(xì)胞的全能性較強(qiáng)，內(nèi)部干燥無菌，經(jīng)過一段時間的發(fā)育后，細(xì)胞分化程度提高，胚乳呈黏稠狀，接種后易被污染、褐化率高，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸降低。在5 月底幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率要高于6 月初，且伴隨著體胚直接發(fā)生現(xiàn)象，這與袁巧平等[14] 和Long 等[15] 的試驗結(jié)果一致，幼胚、子葉隨著逐漸成熟不再具備誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的能力。

3.1.4 激素與有機(jī)物

激素和碳源是影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)與發(fā)生的關(guān)鍵因素。用愈傷組織誘導(dǎo)胚性愈傷組織時，適當(dāng)提高激素濃度可以提高誘導(dǎo)率，待胚性愈傷組織形成時，降低激素濃度或去除激素才能完成體胚的誘導(dǎo)與植株再生[16]。此外，以不同核桃品種誘導(dǎo)體胚時所需的激素種類與濃度也有差異。常英英等[3] 單獨(dú)使用2.0 mg/L BA 對‘林早香’和‘中林6 號’核桃進(jìn)行體胚誘導(dǎo)的效果最佳，張夢妍[17] 使用2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2，4-D 對‘香玲’核桃進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)的效果最佳。在本試驗中，對‘西林3 號’核桃胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的組合為1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/LKT+0.01 mg/L IBA，與Tulecke 等[2] 的試驗結(jié)果相同。在培養(yǎng)基中糖類作為碳源物質(zhì)為體胚發(fā)育提供能量，同時糖類是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其濃度升高時引起細(xì)胞失水，使內(nèi)含物含量升高，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育[18]。蔗糖是植物組織培養(yǎng)中常用的糖類之一，不僅是光合作用的主要產(chǎn)物，還是合成淀粉的必要物質(zhì)，其用量也是組織培養(yǎng)的影響因子之一。在本試驗中，低濃度蔗糖有利于胚性愈傷組織的形成，濃度過高則出現(xiàn)體胚成熟現(xiàn)象，30 ～ 40 g/L 的蔗糖即可提供充足的碳源。

3.2 影響核桃體胚增殖的因素

在體胚繼代增殖培養(yǎng)過程中，植物激素不是必需因素。Tulecke 等[19] 在體胚繼代中未添加任何激素，本試驗結(jié)果也表明無激素同樣可以誘導(dǎo)產(chǎn)生次生胚胎，但體胚繼代和體胚成熟同時存在，增殖率較低。適當(dāng)添加細(xì)胞分裂素和生長素可以提高增殖率，體胚傾向于繼代繁殖，這也與Merkle 等[20] 的試驗結(jié)果類似，但激素的添加會導(dǎo)致更多畸形胚的形成。此外，繼代越多，體胚的畸形率越高，畸形胚不能發(fā)育成苗，嚴(yán)重影響體胚在生產(chǎn)和育種中的應(yīng)用。有研究結(jié)果表明，在繼代培養(yǎng)基中加入適量脫落酸（ABA）能抑制核桃、核桃楸畸形胚的產(chǎn)生[3，21]。這可能是由于外源ABA 促進(jìn)了細(xì)胞蛋白的積累，抑制了細(xì)胞擴(kuò)增，并促進(jìn)了體胚的發(fā)育[22]。

在體胚誘導(dǎo)過程中，胚乳產(chǎn)生的酚類化合物大量堆積在培養(yǎng)基中，加劇幼胚褐化，導(dǎo)致體胚誘導(dǎo)率下降。本試驗中僅通過采用控制每皿幼胚接種數(shù)量、提高轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基頻率的方法來緩解褐化情況，未添加防褐化劑，后續(xù)可考慮通過添加活性炭[23]、硝酸銀（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[24] 等防褐化劑，確定最佳防褐化劑的種類與濃度，提高體胚誘導(dǎo)率。

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[ 本文編校：聞 麗]

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2021YFD2200304-3）。