冷脅迫下普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族的鑒定和分析

摘 要：【目的】為挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera 遺傳資源提供參考。【方法】基于普通油茶的冷脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)其CCCH 型鋅指蛋白基因進(jìn)行鑒定，并對(duì)CCCH 型鋅指蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等相關(guān)生物信息學(xué)分析，并以廬山高海拔油茶（LSG）和栽培油茶品種贛無1（GW1）為材料，對(duì)CCCH 型鋅指蛋白基因在冷脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】在普通油茶的冷脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白基因，參考水稻分類方法，將24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白聚類到2 個(gè)亞家族中。保守基序分析結(jié)果表明，在24 個(gè)基因中僅有3 種CCCH 型鋅指蛋白基序類型，即C-X8-C-X5-CX3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X5-C-X4-C-X3-H，數(shù)目分別為92、4 和4。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析結(jié)果表明：在野外冷脅迫試驗(yàn)中CoC3H17 基因在D4、D5 和D6 時(shí)期的表達(dá)量高于D1、D2 和D3 時(shí)期，在室內(nèi)冷脅迫試驗(yàn)中廬山高海拔油茶和贛無1 的CoC3H17 基因一直表現(xiàn)為更高的轉(zhuǎn)錄本豐度；CoC3H14 和CoC3H24 基因在野外試驗(yàn)的D4、D5 和D6 時(shí)期均表現(xiàn)為表達(dá)量明顯上升，且在室內(nèi)冷脅迫試驗(yàn)中廬山高海拔油茶的這2 個(gè)基因的表達(dá)量高于贛無1。【結(jié)論】CoC3H17、CoC3H14 和CoC3H24 基因可能是普通油茶應(yīng)對(duì)冷脅迫的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：普通油茶；CCCH 型鋅指蛋白基因家族；生物信息學(xué)分析；冷脅迫；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：S602.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）01—0011—09

普通油茶Camellia oleifera 當(dāng)前栽種面積超過433 萬hm2，是我國產(chǎn)量最大的木本油料作物[1-3]。油茶籽油中富含以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸，有良好的保健功能，其營養(yǎng)價(jià)值可以和橄欖油媲美，是一種優(yōu)質(zhì)的食用植物油[4-11]。普通油茶通常于秋冬季開花結(jié)果，易受低溫脅迫的影響，由于溫度的限制主要分布于我國長江流域及其以南的亞熱帶低山丘陵地區(qū)[12-18]。廬山高海拔地區(qū)的野生普通油茶能在-30 ℃的條件下生存，是抗寒育種的寶貴遺傳資源[19]。Xie 等[19] 對(duì)不同時(shí)期廬山高海拔地區(qū)普通油茶葉片進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明flg22、Ca2+ 和赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵基因可能參與了普通油茶對(duì)冷脅迫的響應(yīng)。

CCCH 型鋅指蛋白是一類含有3 個(gè)半胱氨酸（Cys）和1 個(gè)組氨酸（His）鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)半胱氨酸和組氨酸殘基之間氨基酸間隔區(qū)的數(shù)量，將CCCH 基序的一致性序列定義為C-X4-17-C-X4-6-C-X3-4-H（C 代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X 代表任意氨基酸）[20]。到目前為止，CCCH 型鋅指蛋白家族已經(jīng)在擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、玉米Zea mays、白菜Brassicarapa 等植物中被鑒定[21-24]。研究結(jié)果表明，CCCH型鋅指蛋白在植物響應(yīng)冷脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鋅指蛋白SIC3H39 基因負(fù)調(diào)控番茄的耐冷性[25]；在低溫處理過程中，柳枝稷轉(zhuǎn)基因株系的鋅指蛋白PvC3H72 基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[26]；在菊花Chrysanthemum morifolium 中過表達(dá)鋅指蛋白DgC3H1 基因可以提高其對(duì)冷脅迫的抗性[27]；過表達(dá)鋅指蛋白AtTZF1 基因的擬南芥植株在耐冷性方面優(yōu)于野生型[28]。

Xie 等[19] 的研究結(jié)果在轉(zhuǎn)錄組層面揭示了普通油茶耐寒的部分分子機(jī)制，然而，關(guān)于CCCH型鋅指蛋白基因在普通油茶響應(yīng)冷脅迫過程中的作用尚缺乏足夠的研究。為了給普通油茶良種選育相關(guān)工作提供參考，本研究中擬在已測定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定CCCH 型鋅指蛋白基因家族，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測等相關(guān)生物信息學(xué)分析。同時(shí)，補(bǔ)充分析普通油茶廬山耐寒種群在響應(yīng)冷脅迫過程中CCCH 型鋅指蛋白家族成員的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族的鑒定

試驗(yàn)材料為六倍體普通油茶，其冷脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本團(tuán)隊(duì)經(jīng)測序獲得（NCBI SRA 登錄號(hào)為PRJNA915196）[19]。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//rice.uga.edu/）下載CCCH 蛋白序列。將擬南芥和水稻的CCCH 蛋白序列作為查詢序列，使用BLASTP 程序以1×10-10 的E 值作為閾值，搜索普通油茶蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA915196）。利用HMMER3.0 程序中的hmmbuild 命令，構(gòu)建CCCH蛋白的隱馬爾科夫模型，并以此來搜索普通油茶蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。將HMMER 與BlASTP 搜索結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，并通過人工編輯的方式進(jìn)行篩選。利用Cdhit軟件去除預(yù)測同源蛋白的冗余序列。接著利用PFAM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）、NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi） 和SMART 數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)一步鑒定，去除沒有CCCH 結(jié)構(gòu)域的序列，最終確定普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員[21]。

1.2 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的生物信息學(xué)分析

利用Expasy 的在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）， 預(yù)測CCCH 型鋅指蛋白的基本理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)和平均疏水指數(shù)等理化性質(zhì)指標(biāo)[22]。利用在線工具SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma. html） 預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用在線工具Soft Berry Prot Comp9.0（http：//www.softberry.com/ berry.phtml？topic=protcompplamp;group=programsamp;subgroup=proloc）預(yù)測CCCH 型鋅指蛋白的亞細(xì)胞定位。通過在線工具TM-HMMServer 2.0（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）預(yù)測CCCH 型鋅指蛋白的跨膜區(qū)。通過在線工具M(jìn)EME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）檢測普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，最大主題數(shù)量設(shè)為10，其他可選參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值[21]。使用TBtools 軟件進(jìn)行結(jié)果可視化[29]。

1.3 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于水稻和普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族成員的全長氨基酸序列，使用Clustalx 2.0 進(jìn)行多重序列比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 7.0 軟件，采用Neighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)普通油茶CCCH型鋅指蛋白家族進(jìn)行亞家族分類[23]。

1.4 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族冷脅迫下表達(dá)模式的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證冷脅迫下CCCH 型鋅指蛋白基因家族的表達(dá)模式，設(shè)置了野外原位試驗(yàn)及室內(nèi)低溫模擬試驗(yàn)。

野外原位試驗(yàn)在江西省九江市廬山高海拔區(qū)域進(jìn)行，選取該區(qū)域內(nèi)3 株長勢健旺的普通油茶樹，標(biāo)記為LSG1 ～ LSG3。在普通油茶經(jīng)歷冷馴化后（氣溫降至10 ℃），從2020 年10 月16日到2021 年1 月2 日，選取了D1（13.4 ℃）、D2（16.3 ℃）、D3（11.3 ℃）、D4（4.7 ℃）、D5（6.6 ℃）、D6（1.6 ℃）共6 個(gè)時(shí)期的普通油茶葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

室內(nèi)低溫試驗(yàn)也在經(jīng)歷冷馴化后進(jìn)行，以上述3 株廬山高海拔普通油茶以及3 株栽種在江西省林業(yè)科學(xué)院低海拔區(qū)域的栽培普通油茶贛無1（GW1）為樣樹。在同一采樣日，從2 個(gè)區(qū)域選定的樣樹上各采集12 片帶葉柄的新鮮未受損的葉片。使用去離子水清洗樹葉表面，用吸水紙擦干。同一樣樹的1 ～ 3 片樹葉被裝在1 個(gè)穿孔塑料拉鏈袋（120 mm×85 mm）中。對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，將所有葉片全部放置在RXZ-0358-LED 型氣候箱（寧波江南儀器廠）中12 h，條件設(shè)置為4 ℃、黑暗條件。隨后將樣品分別放置在氣候箱中，在-10 ℃條件下處理0、1、3、6、16 和32 h，取出經(jīng)冷凍處理的葉片，馬上用鋁箔覆蓋，并立即放置在裝有液氮的真空瓶中，然后保存在-80 ℃冰箱中，用于轉(zhuǎn)錄組測序[19]。

對(duì)測序后獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察經(jīng)過不同處理后CCCH 型鋅指蛋白基因響應(yīng)冷脅迫的表達(dá)模式。使用TBtools 軟件進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)分析、聚類和展示。表達(dá)譜熱圖是使用log2（x+1） 轉(zhuǎn)換的每1 000 個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per millionmapped reads，F(xiàn)PKM）值生成的[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的理化性質(zhì)

通過蛋白質(zhì)同源性搜索，共鑒定到24 條具有完整CCCH 型鋅指結(jié)構(gòu)的序列。為便于研究，將24 個(gè)基因進(jìn)行統(tǒng)一命名（CoC3H1 ～ CoC3H24），其所編碼蛋白的編號(hào)為CoC3H1 ～ CoC3H24。利用Expasy 的在線工具ProtParam 對(duì)24 個(gè)基因編碼的CCCH 型鋅指蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白的氨基酸數(shù)量為191（CoC3H16）～ 736（CoC3H17）；預(yù)測的理論相對(duì)分子量質(zhì)量為21 364.31 Da（CoC3H16）～ 80 232.83 Da（CoC3H17）；理論等電點(diǎn)為4.7（CoC3H13） ～ 9.1（CoC3H21），其中有8 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白的等電點(diǎn)小于7，呈酸性，其余16 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白呈堿性；僅CoC3H16 的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余23 個(gè)CCCH型鋅指蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為41.77（CoC3H5）～ 75.01（CoC3H23）；平均疏水指數(shù)為-1.063 ～ -0.313，證明這24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白均為親水性蛋白。

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，在這24 個(gè)CCCH型鋅指蛋白中，多數(shù)成員定位于細(xì)胞核，僅有2 個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外，且這24 個(gè)蛋白均無跨膜區(qū)。SMART 在線工具檢測結(jié)果表明：普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族中，CCCH 基序的數(shù)量為2 ～ 5；CoC3H12、CoC3H14、CoC3H17、CoC3H23 這4 個(gè)成員僅有2 個(gè)CCCH 基序， 占總成員數(shù)量的16.7%；CoC3H6、CoC3H16、CoC3H18這3 個(gè)成員各有3 個(gè)CCCH 基序，占比12.5%；CoC3H10、CoC3H13、CoC3H21、CoC3H22 這4 個(gè)成員各有4 個(gè)基序，占比16.7%；具有5 個(gè)基序的成員數(shù)量最多，有13 個(gè)，占比54.1%（表1）。

2.2 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的亞家族分類

為了研究普通油茶中CCCH 型鋅指蛋白家族特性，將比對(duì)鑒定出來的24 個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。參照模式植物水稻的分類方法，將普通油茶中24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白家族全部聚類到2 個(gè)亞家族中（Bootstrap 值大于50%），如圖1 所示，即Ⅰ類亞家族和Ⅲ類亞家族。其中Ⅲ類亞家族最大，包含20 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白，剩余4 個(gè)家族成員位于Ⅰ類亞家族。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ類亞家族中的蛋白全部包含2 個(gè)CCCH 基序，在Ⅲ類亞家族中的蛋白包含3 ～ 5 個(gè)CCCH 基序（圖1 和表1）。

2.3 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)

從基序類型來看，24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白僅有3 種CCCH 基序類型， 即C-X8-C-X5-C-X3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X5-C-X4-C-X3-H， 數(shù)目分別為92、4 和4（圖2）。預(yù)測普通油茶CCCH 型鋅指蛋白中含有10 個(gè)保守基序（motif），不同CCCH 型鋅指蛋白家族成員所包含的基序類型不同，同一分支的CCCH 型鋅指蛋白家族成員具有相同或相似的基序組合，表明CCCH 型鋅指蛋白在亞家族內(nèi)存在功能分化，但在成員間高度保守（圖3）。其中CoC3H12、CoC3H17、CoC3H14、CoC3H23 的基序類型最為簡單且均只含有基序6、基序7、基序9。在CCCH 型鋅指蛋白家族中，基序1 和基序2 出現(xiàn)頻率較高，分別出現(xiàn)20、21 次，說明基序1 和基序2 保守基序可能是普通油茶CCCH 型鋅指蛋白家族的重要基序類型（圖3）。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，CCCH 型鋅指蛋白還攜帶其他幾種已知的功能性結(jié)構(gòu)域，包括Ank、PHA等（圖3）。10 個(gè)保守基序的詳細(xì)序列如圖4 所示。

普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的基序在同組內(nèi)相似，在不同組間存在差異。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，位于Ⅰ類亞家族的4 個(gè)家族成員僅含有基序6，基序7 和基序9，且基序類型均為C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H，位于Ⅲ類亞家族的20 個(gè)家族成員含有3 ～ 5 個(gè)基序，且基序類型均為C-X8-C-X5-C-X3-H，與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。

2.4 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SOPMA 分析工具預(yù)測普通油茶CCCH型鋅指蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CCCH 型鋅指蛋白中無規(guī)則卷曲占83.48% ～ 55.87%，α- 螺旋占32.22% ～ 2.89%，β- 轉(zhuǎn)角占6.17% ～ 2.59%， 延伸鏈占17.99% ～ 7.93%（表2）。

2.5 普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因響應(yīng)冷脅迫的表達(dá)譜

分析結(jié)果表明，54.17% 的CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員在LSG 和GW1 中均表現(xiàn)為較低的轉(zhuǎn)錄本豐度（FPKM 值小于5）。CoC3H17 基因在野外冷脅迫試驗(yàn)的D4、D5 和D6 時(shí)期的表達(dá)量高于D1、D2 和D3 時(shí)期，在室內(nèi)冷脅迫試驗(yàn)的LSG 和GW1 中一直表現(xiàn)為更高的轉(zhuǎn)錄本豐度。CoC3H14和CoC3H24 基因在野外試驗(yàn)的D4、D5 和D6 時(shí)期均表現(xiàn)為表達(dá)量明顯上升，且在室內(nèi)冷脅迫試驗(yàn)的LSG 中的表達(dá)量高于在GW1 中的表達(dá)量。CoC3H4、CoC3H13 和CoC3H23 等基因在GW1 中的表達(dá)量顯著高于在LSG 中的表達(dá)量（圖5）。

3 結(jié)論與討論。

基于普通油茶響應(yīng)冷脅迫過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究中鑒定到分屬2 個(gè)亞家族的24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白基因，其蛋白結(jié)構(gòu)具有較高的保守性。其中，CoC3H17、CoC3H14 和CoC3H24等基因在響應(yīng)冷脅迫過程中表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)量，可能是普通油茶應(yīng)對(duì)冷脅迫的關(guān)鍵基因。

所鑒定24 個(gè)CCCH 型鋅指蛋白家族成員，僅被聚類為2 個(gè)亞家族分支。在擬南芥和水稻中分別鑒定到68 和67 個(gè)CCCH 家族成員[21]。六倍體普通油茶沒有因?yàn)槿旧w多倍化發(fā)生基因家族擴(kuò)張，反而呈現(xiàn)收縮趨勢，這可能是因?yàn)樵谶M(jìn)化過程中CCCH 型鋅指蛋白家族發(fā)生過染色體水平的缺失，這種現(xiàn)象也曾在四倍體柳枝稷中觀察到[30]。另外，本研究中使用的是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可能存在一些未表達(dá)基因家族成員未被鑒定到的情況。

普通油茶的CCCH 型鋅指蛋白具有較高的保守性。本研究中所有CCCH 型鋅指蛋白家族僅包含3 種基序類型，且同一亞家族蛋白質(zhì)的保守基序較為相似。這3 種基序類型在擬南芥、水稻和玉米中也有報(bào)道，表明CCCH 型鋅指蛋白在不同的物種間也具有保守性[21-23]。

普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族約1/3的成員在冷脅迫過程中被激發(fā)，呈現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。本研究的野外試驗(yàn)設(shè)置在廬山高海拔區(qū)域，在試驗(yàn)過程中D1—D3 時(shí)期氣溫均在10 ℃以上，D4 時(shí)期氣溫明顯下降（4.7 ℃），該時(shí)期CoC3H17 基因的表達(dá)豐度顯著提高。本研究室內(nèi)試驗(yàn)設(shè)置的溫度均在4 ℃以下，CoC3H17 基因一直持續(xù)高表達(dá)。這表明CoC3H17 基因可能在普通油茶響應(yīng)冷脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。通過進(jìn)一步探究廬山耐寒種群（LSG）與栽培普通油茶（GW1）之間CCCH 型鋅指蛋白基因家族成員的差異，發(fā)現(xiàn)在野外試驗(yàn)中2 個(gè)種群的CoC3H14和CoC3H24 基因在低溫階段（D4—D6）顯著提高了轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，在室內(nèi)低溫試驗(yàn)過程中，廬山耐寒種群在處理0 ～ 32 h 時(shí)持續(xù)高表達(dá)，且顯著高于栽培普通油茶。因此，推測CoC3H14 和CoC3H24 基因可能是廬山耐寒普通油茶特有的響應(yīng)低溫脅迫的基因。

本研究中對(duì)普通油茶CCCH 型鋅指蛋白基因家族適應(yīng)冷脅迫的功能基因進(jìn)行了鑒定，而其在普通油茶生長發(fā)育、逆境信號(hào)響應(yīng)等過程中的具體功能仍有待深入研究。同時(shí)，普通油茶CoC3H14和CoC3H24 基因響應(yīng)冷脅迫的分子機(jī)制也是下一步研究的方向。

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[ 本文編校：聞 麗]

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260306，32270238）。