生物統(tǒng)合加工嵌合纖維小體組裝模塊反應(yīng)機(jī)制探究

摘 要：為探究生物統(tǒng)合加工嵌合纖維小體中重組蛋白粘連模塊與對(duì)接模塊的分子相互作用及其對(duì)嵌合纖維小體組裝效率的影響，采用釀酒酵母細(xì)胞分泌表達(dá)支架蛋白和酶分子催化模塊，在胞外通過(guò)非變性蛋白凝膠電泳和等溫滴定量熱法測(cè)定分析二級(jí)支架蛋白、纖維素酶分別與一級(jí)支架蛋白結(jié)合時(shí)的相互作用反應(yīng)。結(jié)果顯示，分別連接二級(jí)支架蛋白和纖維素酶蛋白的對(duì)接模塊與粘連模塊的親和力常數(shù)增大，親和力減小，組裝反應(yīng)為焓變驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng)并產(chǎn)生氫鍵，證明這些蛋白分子間親和力減小是導(dǎo)致二級(jí)支架蛋白與一級(jí)支架蛋白組裝效率較低的主要影響因素。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母；嵌合纖維小體；纖維素酶；自組裝；蛋白相互識(shí)別；分子動(dòng)力學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： TK6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引 言

木質(zhì)纖維素原料的高效降解是限制纖維素乙醇生產(chǎn)的瓶頸技術(shù)之一。厭氧微生物產(chǎn)生的超級(jí)分子機(jī)器——纖維小體是目前已發(fā)現(xiàn)的能高效降解纖維素、半纖維素或木質(zhì)素等成分的酶系統(tǒng)，它由多種酶蛋白與腳手架蛋白結(jié)合組裝而成［1］，其高度有序的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)能整合更多數(shù)量和種類(lèi)的纖維素酶及半纖維素酶等，可提高不同酶分子間的協(xié)同效應(yīng)和空間臨近效應(yīng)，產(chǎn)生“集成效應(yīng)”［2］。纖維小體的粘連模塊與對(duì)接模塊間高親和性和種間特異性識(shí)別是組裝蛋白元件的分子基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了一些關(guān)于胞外自組裝嵌合纖維小體的研究［3-5］，然而其組裝效率較低及酶活性不足是目前研究普遍存在的問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn)粘連模塊與對(duì)接模塊的親和力強(qiáng)度是可變的，融合蛋白中相同的對(duì)接模塊與粘連模塊的親和力常數(shù)存在差異［6-7］。

本文以釀酒酵母為宿主細(xì)胞，分泌表達(dá)嵌合纖維小體的一級(jí)支架蛋白ScafⅠ（由粘連模塊CipA、ScaB和CipC組成）、二級(jí)支架蛋白和纖維素酶，并在胞外將后兩者分別與ScafⅠ組裝，采用等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）測(cè)定人工設(shè)計(jì)的ScafⅠ上粘連模塊與對(duì)接模塊的相互作用反應(yīng)，探究融合蛋白對(duì)對(duì)接模塊親和性的影響以及復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)嵌合纖維小體中二級(jí)支架蛋白的組裝效率及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 材 料

本文所用重組釀酒酵母菌株如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 纖維小體蛋白分泌表達(dá)重組釀酒酵母菌株構(gòu)建

將本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的一級(jí)支架蛋白基因ScafⅠ片段插入分泌表達(dá)載體pYD1-PGK-αMF［8］，構(gòu)建出載體pYD1-PGK-αMF-ScafⅠ，然后將該載體用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y6細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性單克隆命名為Y6/ScafⅠ。二級(jí)支架蛋白分泌載體pYD1-PGK-αMF-ScafⅡ-CipA、pYD1-PGK-αMF-ScafⅡ-CipC和pYD1-PGK-αMF-ScafⅡ-ScaB以及重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法與Y6/ScafⅠ構(gòu)建方法相同。

1.2.2 纖維小體蛋白質(zhì)純化

將胞外分泌纖維素酶和支架蛋白的重組釀酒酵母菌株在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，取適量菌液于4 ℃下，3000 r/min離心10 min，取上清液，再于4 ℃下，4000 r/min離心15 min，超濾濃縮。纖維小體蛋白C端帶有6×His標(biāo)簽，將濃縮蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液（30 mmol/L咪唑，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸緩沖液）按照體積比1∶2混合，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)AKTA Pure（GE公司）和鎳柱純化：蛋白上樣緩沖液流速1 mL/min，5倍柱體積的上樣緩沖液洗滌，6倍柱體積洗脫液（A液：20 mmol/L磷酸緩沖液，200 mmol/L NaCl；B液：500 mmol/L咪唑）以1 mL/min的流速洗脫，B液的梯度洗脫條件為30 min內(nèi)從0線(xiàn)性提高到100%。收集洗脫峰蛋白樣品于[-80 ℃]下保存?zhèn)溆谩２捎肂CA方法測(cè)定純化后纖維小體蛋白濃度［9］，并進(jìn)行非變性蛋白質(zhì)電泳驗(yàn)證分析［10-11］。

1.2.3 等溫滴定量熱法測(cè)定蛋白質(zhì)相互作用

以脫氣超純水進(jìn)行“水滴水”滴定，驗(yàn)證等溫滴定量熱儀（ITC200，GE），合格標(biāo)準(zhǔn)：基線(xiàn)漂移5 μcal±0.5，幅度lt;0.05 μcal/s。以二級(jí)支架蛋白ScafⅡ-CipA、ScafⅡ-ScaB、ScafⅡ-CipC、纖維素酶EGⅡ-ScaB、CBHⅡ-CipC和BGLⅠ-CipA分別滴定一級(jí)支架蛋白（ScafⅠ）：第1滴0.4 μL，持續(xù)0.8 s，第2～19滴共滴加2 μL，持續(xù)4 s，每?jī)傻伍g隔120 s，共19次。采用MicroCal Origin 7.0.軟件“one-site binding model”模塊處理滴定數(shù)據(jù)并擬合滴定飽和曲線(xiàn)，計(jì)算親和力常數(shù)（[Kd]）、熵變（[ΔS]）和焓變（[ΔH]）。

2 結(jié)果與分析

2.1 嵌合纖維小體蛋白純化

為進(jìn)行ITC分析，采用親和色譜層析的方法分別純化二級(jí)支架蛋白、纖維素酶和一級(jí)支架蛋白。圖1所示為蛋白樣品經(jīng)超濾濃縮后的SDS-PAGE電泳結(jié)果。可看出，目的蛋白ScafⅡ-CipA（84.90 kDa）、ScafⅡ-ScaB（89.80 kDa）、ScafⅡ-CipC（49.87 kDa）、纖維素酶EGⅡ-ScaB（52.25 kDa）、CBHⅡ-CipC（56.07 kDa）、BGLⅠ-CipA（96.74 kDa）和ScafⅠ（50.28 kDa）的蛋白條帶較清晰，該結(jié)果說(shuō)明蛋白純化樣品適用于等溫滴定量熱法（ITC）分析。

2.2 非變性蛋白質(zhì)電泳驗(yàn)證粘連-對(duì)接模塊結(jié)合

采用非變性蛋白質(zhì)電泳方法驗(yàn)證純化濃縮的嵌合纖維小體蛋白樣品相互結(jié)合活性。二級(jí)支架蛋白與一級(jí)支架蛋白的結(jié)合結(jié)果如圖2a～圖2c所示。其中圖2a第3泳道為ScafⅠ與ScafⅡ-CipA結(jié)合形成的復(fù)合物（130 kDa），圖2b第1泳道為ScafⅠ與ScafⅡ-ScaB結(jié)合形成的復(fù)合物（140 kDa），圖2c第3泳道為ScafⅠ與ScafⅡ-CipC結(jié)合形成的復(fù)合物（100 kDa）。纖維素酶蛋白與一級(jí)支架蛋白的結(jié)合驗(yàn)證結(jié)果如圖2d～圖2f所示，其第3泳道為ScafⅠ分別與EGⅡ-ScaB結(jié)合形成的復(fù)合物（100 kDa）、與CBHIⅡ-CipC結(jié)合形成的復(fù)合物（110 kDa）以及與BGLⅠ-CipA結(jié)合形成的復(fù)合物（147 kDa）。上述結(jié)果說(shuō)明純化獲得的纖維素酶蛋白和二級(jí)支架蛋白與一級(jí)支架蛋白ScafⅠ具有相互結(jié)合的生物功能。

2.3 嵌合纖維小體蛋白相互作用

纖維素酶EGⅡ-ScaB（1.09 mmol/L）、CBHⅡ-CipC（2.91 mM）和BGLⅠ-CipA（3.70 mmol/L）分別滴定ScafⅠ（0.30 mmol/L）的結(jié)合反應(yīng)過(guò)程特征如圖3a～圖3c所示，親和力常數(shù)[Kd]和熱力學(xué)參數(shù)（熵值，焓值）如表2所示。上述結(jié)果說(shuō)明[Kd]（EGII-ScaB）lt;[Kd]（CBHⅡ-CipC）lt;[Kd]（BGLⅠ-CipA），即纖維素酶蛋白與ScafⅠ結(jié)合時(shí)，EGⅡ-ScaB與ScafⅠ具有較高的親和力，可先與ScafⅠ結(jié)合，然后依次是CBHⅡ-CipC和BGLⅠ-CipA，而以二級(jí)支架蛋白ScafⅡ-CipA（4.6 mmol/L）、ScafⅡ-ScaB（4 mmol/L），ScafⅡ-CipC（1.8 mmol/L）分別滴定ScafⅠ（0.3 mmol/L）的結(jié)合反應(yīng)過(guò)程如圖3d～圖3f所示，可看出[Kd]（ScafⅡ-CipA）gt;[Kd]（ScafⅡ-ScaB）gt;[Kd]（ScafⅡ-CipC），這說(shuō)明二級(jí)支架蛋白ScafⅡ-CipC與ScafⅠ具有較高的親和力并優(yōu)先結(jié)合，然后依次是ScafⅡ-ScaB及ScafⅡ-CipA。

通過(guò)對(duì)比分析表2中纖維素酶、二級(jí)支架蛋白分別與ScafⅠ相互作用的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)如下規(guī)律：

1）與天然粘連模塊結(jié)合對(duì)接模塊的親和力常數(shù)（天然的粘連模塊CipA和CipC與對(duì)接模塊的[Kd]為10-7～10-9 mol/L）相比，本文中纖維素酶、二級(jí)支架蛋白上的對(duì)接模塊與ScafⅠ上的粘連模塊結(jié)合時(shí)[Kd]值都處在10-3～10-4 mol/L數(shù)量級(jí)，后者親和力均明顯減小，因此這將對(duì)降低二級(jí)支架蛋白的組裝效率產(chǎn)生較大影響；

2） ScafⅡ-CipA和BGLⅠ-CipA的[Kd]分別為8.40×10-3 mol/L和4.50×10-4 mol/L，兩者相差20倍；ScafⅡ-ScaB與EGⅡ-ScaB相差2.17倍，ScafⅡ-CipC與CBHⅡ-CipC相差0.41倍，這說(shuō)明對(duì)接模塊ScaB和CipC與纖維素酶或者二級(jí)支架蛋白連接形成融合蛋白的Kd差距較小，而對(duì)接模塊CipA受到ScafⅡ-CipA的影響，其親和力減小最大：

3） 根據(jù)ITC數(shù)據(jù)，二級(jí)支架蛋白及纖維素酶與一級(jí)支架蛋白通過(guò)粘連模塊與對(duì)接模塊結(jié)合時(shí)，蛋白分子相互作用反應(yīng)都是放熱反應(yīng)，說(shuō)明粘連模塊與對(duì)接模塊間有化學(xué)鍵形成，再依據(jù)[ΔHlt;0]且[-TΔSgt;0]的結(jié)果，則證明生成的化學(xué)鍵主要是氫鍵，其中在ScafⅡ-ScaB及BGLⅠ-CipA與ScafⅠ的結(jié)合反應(yīng)中氫鍵貢獻(xiàn)比例最高，此時(shí)結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致熵減?。╗-TΔSgt;0]），但[ΔH]減小幅度較大，使反應(yīng)得以進(jìn)行，這說(shuō)明6個(gè)粘連-對(duì)接模塊組裝反應(yīng)主要是通過(guò)焓變驅(qū)動(dòng)的結(jié)合反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

早期研究認(rèn)為“隨機(jī)結(jié)合”是對(duì)接模塊與粘連模塊間的普遍現(xiàn)象，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)酶分子使對(duì)接模塊具有獨(dú)特的親和性，因此具有相對(duì)較大親和力的催化模塊能優(yōu)先與支架蛋白結(jié)合，并占有較大比例［12］。Bomble等［13］發(fā)現(xiàn)Cel48A、Cel5A和Cbh9A催化模塊中對(duì)接模塊的氨基酸序列相同，但與相同粘連模塊的親和力大小及化學(xué)鍵均不相同，它們與CipA結(jié)合呈現(xiàn)出“時(shí)序性”。在嵌合纖維小體設(shè)計(jì)和裝配過(guò)程中也有類(lèi)似現(xiàn)象出現(xiàn)。Borne等［7］發(fā)現(xiàn)由3個(gè)CipC粘連模塊組成的支架蛋白Scaf7隨機(jī)的與含相同對(duì)接模塊的Cel5A，Cel48F和Cel9G同時(shí)組裝，產(chǎn)生的纖維小體結(jié)構(gòu)是Scaf7-Cel48F-Cel48F-Cel5A（50%）、Scaf7-Cel9G-Cel9G-Cel9G（33）和Scaf7-Cel5A-Cel5A-Cel5A（17%），這說(shuō)明受不同酶分子的影響，對(duì)接模塊與CipC的親和力強(qiáng)度依次為Cel48F＞Cel9G＞Cel5A。Jeon等［6］采用ITC方法證實(shí)含有相同對(duì)接模塊的纖維素酶EngG、EngE和ExgS分別與粘連模塊CbpA結(jié)合時(shí)的[Kd]分別為6.56×10-7、7.62×10-8和5.33×10-9 mol/L，說(shuō)明融合酶ExgS與粘連模塊CbpA存在強(qiáng)結(jié)合，其親和性遠(yuǎn)大于天然結(jié)構(gòu)的EngG及融合酶EngE；與EngG相比，重組酶親和力常數(shù)同時(shí)出現(xiàn)減小和增大兩種變化方向?；诖?，酶分子影響粘連-對(duì)接模塊的親和力大小可能是由于酶分子改變了對(duì)接模塊的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促發(fā)對(duì)親和力有重要影響的氨基酸殘基的相對(duì)位置改變。Carvalho等［14］證明對(duì)接蛋白的構(gòu)象3-α螺旋結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離粘連模塊，而結(jié)合粘連模塊的三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)變化。因此，在本文中對(duì)接模塊上連接的蛋白分子，無(wú)論是酶或二級(jí)支架蛋白都會(huì)使對(duì)接模塊的空間構(gòu)象發(fā)生變化，可能會(huì)改變決定特異性識(shí)別和親和力大小的關(guān)鍵氨基酸殘基的相對(duì)空間位置，這最終將影響纖維小體的組裝水平，但目前尚無(wú)法預(yù)測(cè)親和力常數(shù)的變化方向。

本文應(yīng)用等溫滴定量熱法剖析嵌合纖維小體結(jié)構(gòu)單元二級(jí)支架蛋白、纖維素酶和一級(jí)支架蛋白間的親和性對(duì)組裝效率和催化能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：嵌合纖維小體的粘連模塊（CipA、ScaB和CipC）與對(duì)接模塊的親和力常數(shù)比天然粘連模塊-對(duì)接蛋白的親和力常數(shù)減小了103～105倍，兩者結(jié)合主要是通過(guò)焓變驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng)，并生成了氫鍵。該結(jié)果證明這些蛋白分子間親和力減小是導(dǎo)致二級(jí)支架蛋白與一級(jí)支架蛋白組裝效率較低的主要影響因素。

基于本文中利用化學(xué)參數(shù)親和力常數(shù)[Kd]和熱力學(xué)參數(shù)（熵值、焓值）說(shuō)明在釀酒酵母中嵌合纖維小體組裝元件之間親和力的變化規(guī)律，對(duì)組裝效率低的生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行闡釋。這種方法對(duì)設(shè)計(jì)嵌合纖維小體及推進(jìn)嵌合纖維小體的理論研究和設(shè)計(jì)優(yōu)化具有重要意義。

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COHESIN-DOCKERIN ASSEMBLY INTERACTIONS MECHANISM OF

CBP DESIGNER CELLULOSOME

Xu Shi， Wan Ping， Li Juanjuan， Liu Han， Du Jiliang， Tian Shen

（College of Life Science， Capital Normal University， Beijing 100048， China）

Abastract：In order to explore the molecular interaction between recombinant protein cohesin module and dockerin module and its effect on the assembly efficiency. In this study， scaffoldins and enzymes was secreted by Saccharomyces cerevisiae cells， and the interaction of secondary scaffolins and cellulases combined with primary scaffolin was determined and analyzed by non-denatured electrophoresis and isothermal titration calorimetry in vitro. The results showed that the affinity force between the dockerin module of secondary scaffold protein and cohesion module of cellulase protein decreased while the affinity constant [（Kd）] increased. The assembly reaction was driven by enthalpy change and hydrogen bonds are generated. The results proved that the decrease of intermolecular affinity of the proteins was the main factor that leads to the lower assembly efficiency of secondary scaffold proteins and primary scaffold proteins.

Keywords：Saccharomyces cerevisiae； designer cellulosome； cellulase； self-assembly； protein mutual recognition； molecular dynamic