辣椒種質(zhì)資源PMMoV抗性基因檢測與抗性鑒定

陳建分　曹振木　秦于玲　申龍斌　劉維俠　朱丹　吳怡婷　劉子記　王旭

關(guān)鍵詞：辣椒；種質(zhì)資源；PMMoV；分子標(biāo)記；抗病性鑒定

中圖分類號：S436.418 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬一年生或多年生二倍體作物，是全球重要的蔬菜作物之一。辣椒果實富含類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、維生素C 等多種營養(yǎng)物質(zhì)，既可直接食用又可用作調(diào)味品，辣椒提取物在醫(yī)藥和化工領(lǐng)域也具有廣泛應(yīng)用。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，2019 年全球鮮食辣椒和加工辣椒總種植面積約為3.7190×10⁶hm²，總產(chǎn)量約為4.2283×10⁷t；我國2019 年辣椒種植面積約為8.4700×10⁵hm²，總產(chǎn)量達(dá)1.9333×10⁷t，居全球首位[1]。

長期以來，病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要因素。目前，我國報道的病毒種類有30 余種，近年來辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle viru，PMMoV）已逐漸成為海南[2]、廣西[3]、廣東[4]、四川[5]、安徽[6]、黑龍江[7]、山東[8-9]、西藏[10]等多個辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害。PMMoV 屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），主要通過種傳、汁液傳播[11-12]。辣椒感染PMMoV 后葉片癥狀表現(xiàn)輕微皺縮、褪綠斑駁和花葉癥狀，果實被侵染后表現(xiàn)為扁平、變小、褪綠斑駁、凹凸斑點、畸形與壞死等現(xiàn)象。

L¹、L²、L³、L⁴ 系列等位基因是辣（甜）椒抗煙草花葉病毒屬病毒的主要抗性基因[13-15]，這些基因被引入辣椒栽培種中保護植株免受煙草花葉病毒的侵染。目前我國辣椒生產(chǎn)上的PMMoV致病型多以P_1，2株系為主[16-17]，P_1，2致病型病毒株系能夠系統(tǒng)侵染帶有L¹、L² 抗性基因的辣（甜）椒，而帶有L³抗性基因的辣（甜）椒對該病毒株系表現(xiàn)為抗性，L³基因能夠應(yīng)對我國辣椒生產(chǎn)上的主要問題。張寶璽等[18]通過常規(guī)育種技術(shù)和分子標(biāo)記相結(jié)合，創(chuàng)制出含有抗PMMoV（P_{0，1，2}）L³基因新品種中椒105 號、中椒106 號、中椒107號、中椒108 號。TOMITA 等[15]通過圖位克隆獲得L³基因，并利用同位克隆的方法獲得了L 的6個等位基因：L¹、L^1a、L^1c、L²、L^b和L⁴。鑒定抗性種質(zhì)是選育抗病品種不可缺少的步驟，目前，高抗PMMoV 的辣椒種質(zhì)鮮有報道。由于辣椒的栽培種遺傳多樣性比較豐富、L 基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，目前尚未利用基因序列開發(fā)功能標(biāo)記。因此，本研究利用已報道的L³連鎖標(biāo)記，遺傳距離為0.00015 cM，以110 份辣椒種質(zhì)資源為研究對象，結(jié)合抗病基因檢測和苗期抗性鑒定，精準(zhǔn)篩選抗辣椒輕斑駁病毒的種質(zhì)資源，以期為選育抗PMMoV 辣椒品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試?yán)苯贩N質(zhì)資源共110 份，材料名稱和來源地詳見表1。PMMoV 鑒定毒原P1，2 株系由本課題組從田間發(fā)病植株上分離提純保存。

1.2 方法

1.2.1 毒原擴繁及檢測 將PMMoV 毒源人工接種在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）上進(jìn)行擴繁，待發(fā)病后選取感病葉片，利用RT-PCR 方法進(jìn)行分子檢測，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

1.2.2 L³抗性基因檢測 與L³連鎖的分子標(biāo)記參照TOMITA 等[22]的方法。根據(jù)Bioteke DNA 試劑盒（ 北京百泰克生物技術(shù)有限公司） 提取gDNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA 的質(zhì)量和濃度，并將濃度稀釋至100 ng/μL，保存于–20 ℃冰箱備用。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：PCR-mix（2×Es Taq Master Mix）10 μL，模板DNA 1.0 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH₂O 補齊至20 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 PMMoV 苗期人工接種抗性鑒定 將篩選出含有抗性基因分子標(biāo)記的辣椒種質(zhì)進(jìn)行苗期人工接種鑒定， 以14SM517m 材料為感病對照（CK–），中椒107 為抗病對照（CK+）。2022年8 月3 日，將所有辣椒種子經(jīng)10%磷酸三鈉溶液浸種35 min，用蒸餾水清洗除去辣味，在55 ℃下溫湯浸種4 h，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。出芽后播種于50 孔塑料穴盤內(nèi)育苗，每份參試材料3 次重復(fù)，每重復(fù)15 株。幼苗長至兩葉一心期時，移栽至15.2 cm× 15.6 cm 塑料盆中，育苗基質(zhì)為高溫滅菌基質(zhì)（蛭石∶營養(yǎng)土=1∶2）。

待辣椒幼苗長至4～5 葉期時，取感染PMMoV的煙草新葉，加入10 倍于鮮葉質(zhì)量的0.01 mol/L 磷酸緩沖液（PBS， pH 7.0）中，在冰上研磨勻漿，離心去渣取上清液，接種液現(xiàn)配現(xiàn)用。在葉面抹薄層600 目金剛砂，用手指蘸取少量接種液輕輕摩擦葉面。接種30 min 后用清水沖去葉面多余汁液，為避免病毒接不上的情況，3 d 后再接種1次。將幼苗置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后5 d 調(diào)查局部癥狀，20 d 調(diào)查系統(tǒng)癥狀，計算病情指數(shù)，并進(jìn)行抗性分級。

1.2.4 病情調(diào)查與統(tǒng)計 PMMoV 抗性調(diào)查的病情指數(shù)計算及抗性級別的劃分均參考《辣椒種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[23]。

按上述標(biāo)準(zhǔn)劃分單株病情級別。0：無任何癥狀；1：心葉明脈，或接種葉少量急性小枯斑；3：少數(shù)葉片呈花葉，或接種葉脫落，莖部產(chǎn)生壞死斑；5：多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片畸形，皺縮，或莖部產(chǎn)生壞死條斑；7：多數(shù)葉片畸形，皺縮，植株矮化，或莖、枝和葉脈系統(tǒng)壞死；9：植株嚴(yán)重矮化，停止生長；或植株嚴(yán)重系統(tǒng)壞死，甚至死亡。病情指數(shù)計算公式為：

病情指數(shù)（DI）=Σ（病級數(shù)值×該病級株數(shù)）/（病級最高值×調(diào)查總株數(shù)）×100。

品系群體抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 軟件進(jìn)行分析、計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 25 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD 或Duncans 法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒原擴繁檢測結(jié)果

RT-PCR 鑒定結(jié)果表明，PMMoV 特異性引物能擴增出220 bp 左右的條帶，與目的條帶一致，而CMV 和TSWV 檢測引物均未擴增出條帶（圖1），初步證明此毒原為PMMoV 單一感染毒原，可用于接種鑒定。

2.2 辣椒種質(zhì)L³抗性基因檢測

L³抗性分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，17YB32、17SCa28m、CF19-34m、19FB6-1、15SM39-2、CCJ93-1、14SM555×14SM1、14SM567-2、14SM526-1、14SM565-1、14SM514m、14SM502-1、14SM519-1、14SM504m、14SM503m、14SM519-3、14SM518-2、14SM519-2 等46 份種質(zhì)含有與抗性基因L³連鎖的分子標(biāo)記（圖2），其余64 份種質(zhì)均未擴增出目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)不含L³抗性基因。

2.3 辣椒種質(zhì)PMMoV 抗性鑒定

辣椒種質(zhì)PMMoV 抗性鑒定結(jié)果表明（圖3、表3），46 份供試種質(zhì)存在顯著性差異，未發(fā)現(xiàn)對PMMoV 免疫的種質(zhì)，各種質(zhì)的病情指數(shù)在8.86～60.00 之間。病情指數(shù)能夠反映辣椒種質(zhì)抗PMMoV 能力的強弱，數(shù)值越高，表明抗性越低，反之，表明抗性越高。其中，高抗種質(zhì)為CF19-34m和19FB6-1，病情指數(shù)分別為8.86 和8.79，抗病性顯著強于感病種質(zhì)，葉片幾乎無感染癥狀；抗病種質(zhì)CCJ93-1 次之，葉片僅有輕微的花葉癥狀；中抗材料17YB32、17SCa28m、15SM39-2、14SM555×14SM1、14SM567-2、14SM526-1、14SM565-1、14SM502-1、14SM519-1、14SM504m、14SM503m、14SM519-3、14SM518-2、14SM519-2、CCJ52-1 等34 份，植株少數(shù)葉片出現(xiàn)花葉、皺縮；感病種質(zhì)14SM514m、CCJ22-1 、CCJ113-2 、CCJ135-1 、CCJ157-1、CCJ537-1m、L545、CCJ87-2、CCJ133-1，這9 份材料中CCJ113-2 和CCJ135-1 的病情指數(shù)最大，病情指數(shù)為60.00。感病種質(zhì)的抗性能力弱，植株葉片多數(shù)皺縮和心葉畸形，植株矮化。總體來看，高抗、抗病和中抗材料占總鑒定材料的80.43%。

3 討論

本研究結(jié)合L³抗性基因檢測和苗期人工接種抗性鑒定方法，在110 份辣椒種質(zhì)中篩選出抗PMMoV P_1，2種質(zhì)37 份，這些抗病種質(zhì)可為辣椒的抗病育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。近年來，辣椒輕斑駁病毒在國內(nèi)快速蔓延，研究者正加快篩選對其具較大抗性的辣椒種質(zhì)。秦蕾等[24]對51 份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了TMV 抗性鑒定，獲得抗病材料15 份，其中高抗材料2 份，占總鑒定材料的3.92%；姚明華等[25]對引進(jìn)的42 份非洲辣椒材料進(jìn)行了TMV 抗性鑒定，獲得抗性材料9 份；王飛等[26]在74 份泰國辣椒種質(zhì)中篩選出7 份TMV抗性材料。已有研究篩選到的抗性材料相對較少，本研究鑒定結(jié)果表明，不同的辣椒種質(zhì)表現(xiàn)的抗性有所不同，其中多數(shù)抗病材料表現(xiàn)為中抗，僅獲得2 份高抗材料和1 份抗病材料。這可能是由于抗病性受到多種因素的影響，包括外在的環(huán)境因子、內(nèi)在基因表達(dá)及辣椒與病毒的相互作用等。其次，可能高效L 基因主要存在于辣椒野生種當(dāng)中。

目前，辣椒抗PMMoV 的 L 基因已被克隆。本研究利用已報道的與L³連鎖的分子標(biāo)記對110份辣椒種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示有46 份種質(zhì)含有抗性分子標(biāo)記，包括一年生辣椒栽培種（C.annuum L）和中國辣椒栽培種（C. chinense Jacquin）。在接種PMMoV P_1，2菌株后，其中有9 份含有抗性分子標(biāo)記的種質(zhì)表現(xiàn)為感病，這種現(xiàn)象可能與品種的遺傳背景有關(guān)。本研究采用的是與L³連鎖的標(biāo)記而不是功能標(biāo)記，因此存在假陽性的可能，為了準(zhǔn)確鑒定辣椒種質(zhì)對PMMoV 的抗性，需要結(jié)合抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病害，對辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[27]。由于PMMoV具有種傳的特性，使用化學(xué)殺菌劑和傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治措施無法控制病毒病的為害。與傳統(tǒng)育種方式相比，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以快速對已知抗性基因進(jìn)行檢測，縮短了育種年限，有利于尋找新抗源，拓寬辣椒品種抗性遺傳多樣性，對PMMoV抗病品種的選育尤為重要。

本課題組前期研究已經(jīng)明確了海南儋州辣椒種質(zhì)資源圃感染的PMMoV 為P_1，2致病型，應(yīng)用L³抗性基因可以有效克服PMMoV P_1，2 致病型的為害。然而，病毒毒株會克服抗性基因而變異，L³基因?qū)MMoV P_{1，2，3，4}致病型不具有抗性[28]。因此，未來的工作需要挖掘鑒定其他PMMoV 抗性基因用于辣椒抗性種質(zhì)資源的創(chuàng)制，為辣椒抗PMMoV 育種提供更高效的抗源材料。